Введение к работе
Актуальность проблемы
Острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ) и грипп по числу случаев превосходят все другие инфекционные болезни вместе взятые. ОРВИ занимают первое место в структуре заболеваемости взрослых и детей болезнями органов дыхания и являются основной причиной обращений за медицинской помощью. Широкому распространению ОРВИ по всему миру способствуют аэрогенный путь передачи инфекции и большое количество самих респираторных возбудителей [Учайкин В.Ф., 2001]. Для вирусов, относящихся к возбудителям ОРВИ, характерны следующие общие черты - воздушно-капельный путь передачи, тропность вирусов к эпителию верхних и нижних дыхательных путей, сходные клинические проявления инфекционного процесса.
Исторически, гриппу уделяется наибольшее внимание, поскольку вирус гриппа вызывает эпидемии и пандемии, поражая людей всех возрастов, а заболевание часто протекает с осложнениями [Glezen W.P., 2000; Маринич И.Г., 1999]. Именно осложнения ответственны за летальность при гриппе, при этом их частота при гриппе может достигать 15-20% [Rothberg M.B., 2008; Treaner J.J., 2010].
Вместе с тем, остальным респираторным вирусам, к которым относятся аденовирусы (АДВ), риновирусы (РВ), респираторно-синцитиальный вирус (РСВ), вирусы парагриппа 1-4 типа (ВПГ1-4), коронавирусы (КВ) и некоторые другие, уделяется меньшее внимание. В то же время АДВ, РСВ и ВПГ1-4 могут вызывать тяжелые поражения респираторного тракта (синдром крупа, бронхиолит, пневмония и др.) [Simoes E.A., 2003]. Традиционно имеется представление, что такие респираторные патогены, как РВ и КВ, ассоциированы исключительно с заболеваниями верхних дыхательных путей легкой и средней тяжести [Brittain-Long R., 2010]. В последнее время появились исследования, которые опровергают такое представление [Gaunt E.R., 2010; Busse W.W., 2010]. В 2003 г. мир столкнулся с угрозой пандемии атипичной пневмонии (тяжелый острый респираторный синдром (ТОРС, англ. SARS)). Вирус, выделенный от больных ТОРС, был идентифицирован как КВ [Drosten C., 2003]. Имеются также исследования, свидетельствующие о том, что риновирусы могут вызывать поражения и нижних дыхательных путей, "запуская" развитие таких тяжелых заболеваний, как бронхиальная астма и хроническая обструктивная болезнь легких [Gern J.E., 2010].
Традиционные методы идентификации респираторных вирусов имеют недостатки, прежде всего связанные с недостаточной чувствительностью (иммунофлуоресцентные методы), большой длительностью, трудоемкостью, неуниверсальностью процедуры (культуральный метод).
В настоящее время в лабораторной диагностике респираторных инфекций активно начинают использовать молекулярные методы, в том числе полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и ее различные модификации. Самым перспективным методом диагностики ОРВИ является ПЦР с детекцией в режиме реального времени (ПЦР-РВ) [Templeton K.E., 2004; Mahony J., 2007].
Цели и задачи исследования
Целями настоящего исследования являлись: оценка эффективности дифференциальной диагностики ОРВИ методом ПЦР с детекцией в режиме реального времени, а также исследование видовой структуры риновирусов и коронавирусов, циркулирующих в Московском регионе и оценка их роли в этиологии ОРВИ различной степени тяжести.
Для реализации поставленных целей необходимо было решить следующие задачи:
разработать лабораторный образец набора реагентов для одновременного выявления 12 групп респираторных вирусов методом мультиплексной ПЦР-РВ;
провести ПЦР-анализ панели клинических образцов, охарактеризованных в культуре клеток MDCK на наличие вирусов гриппа А и вирусов гриппа В;
методом мультиплексной ПЦР-РВ проанализировать панели клинических образцов от больных с симптомами ОРВИ неустановленной этиологии;
провести внешний контроль качества ПЦР-диагностики ОРВИ, приняв участие в международной программе контроля качества молекулярной диагностики;
оценить диагностическую ценность метода мультиплексной ПЦР-РВ по показателям диагностической чувствительности, специфичности и воспроизводимости;
на основе метода ПЦР-РВ отработать условия дифференциального выявления разных видов риновирусов и коронавирусов;
изучить видовое разнообразие риновирусов и коронавирусов, циркулирующих в Московском регионе;
оценить роль риновирусов и коронавирусов в этиологии ОРВИ различной степени тяжести.
Научная новизна
Разработана и апробирована оригинальная тест-система для одновременного выявления в клинических образцах от больных с диагнозом ОРВИ 12 основных групп респираторных вирусов методом мультиплексной ПЦР-РВ: вирусов гриппа А и В (ВГА и ВГВ), вирусов парагриппа 1, 2, 3, 4 типов, аденовирусов, бокавирусов (БВ), респираторно-синцитиального вируса, риновирусов, энтеровирусов и коронавирусов.
Используя разработанную в ходе выполнения работ ПЦР-тест-систему, впервые в России дана всесторонняя и объективная оценка диагностической ценности метода мультиплексной ПЦР-РВ для диагностики ОРВИ.
Изучено видовое разнообразие риновирусов и коронавирусов,
циркулировавших на территории Москвы и Московской области в период с 2007 по 2012 гг. Показана одновременная циркуляция всех видов риновирусов (РВ-А, РВ-В и РВ-С), а также четырех видов коронавирусов - 229E, OC43, NL63 и HKU1.
Предложен комплексный подход к изучению видовой структуры таких широко распространенных респираторных вирусов, как риновирусы и коронавирусы в этиологии ОРВИ. Дана дифференциальная клиническая оценка этих патогенов.
Практическая значимость
-
-
Разработаны методические подходы, которые легли в основу набора реагентов «ОРВИ-Монитор». Приказом Росздравнадзора данный набор разрешен к производству, продаже и применению на территории Российской Федерации. Эта ПЦР-тест-система может быть использована службами эпидемиологического надзора при мониторинге ситуации по гриппу и ОРВИ, а также в клинической практике для постановки этиологического диагноза пациентам с ОРВИ.
-
Получен патент РФ №2460803 от 10.09.2012 «Способ дифференциальной диагностики респираторных вирусных инфекций методом мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени и перечень последовательностей для его осуществления».
Положения, выносимые на защиту
-
-
-
Мультиплексная ПЦР с детекцией в режиме реального времени является эффективным методом дифференциальной диагностики ОРВИ. Доля расшифрованных случаев ОРВИ превышает 70% при условии соблюдения критериев отбора, хранения и транспортировки образцов, а также при использовании качественных наборов для выделения вирусной РНК.
-
Разработан экспериментальный набор реагентов (ЭНР) для одновременного выявления в клинических образцах двенадцати основных возбудителей ОРВИ методом мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени.
-
Метод мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени при выявлении вирусов гриппа А (ВГА) и вирусов гриппа В (ВГВ) значительно превосходит по диагностической чувствительности метод изоляции вирусов гриппа в культуре клеток MDCK
-
На территории Московского региона в настоящее время циркулируют все виды риновирусов (РВ-А, РВ-В и РВ-С) и коронавирусы КВ-Ж63, КВ-229Е, КВ- OC43 и КВ-HKUL
-
Вопреки общепринятому представлению риновирусы и коронавирусы являются возбудителями не только простудных заболеваний. У детей эти патогены с высокой частотой вызывают и более тяжелые заболевания, требующие госпитализации.
Апробация работы
Материалы диссертационной работы представлены на IV международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (г. Санкт-Петербург, 2008), II научно-практической конференции «Современные технологии и методы диагностики различных групп заболеваний, лабораторный анализ» (Москва, 2009), XIX международном ежегодном конгрессе «19th Annual Congress of the European Respiratory Society» (г. Вена, Австрия, 2009), XIV международном ежегодном конгрессе «14th Congress of the Asian Pasific Society of Repirology
(APSR) and 3 Joint Congress of the APSR/American College of Chest Physicians» (г. Сеул, Южная Корея, 2009), III ежегодном всероссийском конгрессе по инфекционным болезням (г. Москва, 2011), II межрегиональной научно- практической конференции молодых ученных «Человек: здоровье и экология» (г. Иркутск, 2011), Х съезде всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации» (г. Москва, 2012).
Апробация диссертации состоялась 28.03.2013 г. на научной конференции отдела вирусологии им. О.Г. Анджапаридзе ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН.
Публикации результатов исследования
По материалам диссертации опубликовано 13 научных работ, в том числе 5 статей в научных журналах, рекомендованных ВАК и 7 тезисов в сборниках российских и международных конгрессов и конференций. Получен патент РФ.
Объем и структура диссертации
Похожие диссертации на Эффективность дифференциальной диагностики ОРВИ методом ПЦР с детекцией в режиме реального времени
-
-
-
