Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 10
2.1. Общая характеристика лейкоза крупного рогатого скота 10
2.2. Таксономия семейства ретровирусов 12
2.3. Вирус лейкоза крупного рогатого скота 13
2.3.1. Морфология ВЛ КРС 13
2.3.2. Структура генома ВЛ КРС 15
2.3.3. Репликация вируса 18
2.3.4. Устойчивость вируса 19
2.3.5. Культивирование ВЛ КРС 20
2.4. Эпизоотологические особенности лейкоза КРС 22
2.4.1. Естественные пути передачи ВЛ КРС 22
2.4.2. Передача ВЛ КРС в ходе эксперимента 23
2.5. Меры борьбы и профилактики 25
2.6. Диагностика лейкоза КРС 26
2.6.1. Клинические, патоморфологические и гематологические методы исследования лейкоза КРС 26
2.6.2. Серологические реакции 27
2.6.3. Прямые методы выявления провируса ВЛ КРС 32
2.7. Заключение по обзору литературы 38
3. Собственные исследования 40
3.1. Материалы 40
3.1.1. Биологические материалы 40
3.1.2. Реактивы и оборудование 41
3.2. Методы 42
3.3. Результаты собственных исследований и их обсуждение 47
3.3.1. Разработка и усовершенствование метода ПЦР для выявления провирусной ДНК ВЛ КРС
3.3.1.1. Выбор праймеров для проведения ПЦР 48
3.3.1.2. Оптимизация условий пробоподготовки для ПЦР 50
3.3.1.3. Оптимизация условий проведения ПЦР 51
3.3.2. Изучение возможности применения метода ПЦР для обнаружения ВЛ КРС в различных биоматериалах 56
3.3.2.1. Применение метода ПЦР для выявления провирусной ДНК в образцах крови КРС 56
3.3.2.2. Использование метода ПЦР для выявления провирусной ДНК в образцах молока КРС 58
3.3.2.3. Применение метода ПЦР для выявления провируса ВЛ КРС в образцах сыворотки крови КРС 60
3.3.2.4. Обнаружение провирусной ДНК в образцах носовых истечений КРС 61
3.3.2.5. Применение метода ПЦР для выявления провируса лейкоза КРС в суспензиях из органов 64
3.3.2.6. Применение метода ПЦР для выявления провируса лейкоза КРС в образцах спермы быков-производителей 66
3.3.3. Диагностика лейкоза крупного рогатого скота у КРС и овец, содержащихся совместно в естественных условиях 67
3.3.4. Диагностика лейкоза крупного рогатого скота методом ПЦР-ИФА 74
4. Заключение 76
5. Выводы 79
6. Практические предложения 80
7. Список использованной литературы 81
Приложения 102
- Клинические, патоморфологические и гематологические методы исследования лейкоза КРС
- Применение метода ПЦР для выявления провирусной ДНК в образцах крови КРС
- Обнаружение провирусной ДНК в образцах носовых истечений КРС
- Диагностика лейкоза крупного рогатого скота у КРС и овец, содержащихся совместно в естественных условиях
Клинические, патоморфологические и гематологические методы исследования лейкоза КРС
До применения серологических реакций для выявления антител к ВЛ КРС, диагностика лейкоза КРС базировалось на клиническом, патоморфологическом и гематологическом методах исследования [23, 61].
Клинический метод включает обнаружение у животных увеличения поверхностных (надколенных, надвыменных, предлопаточных и др.) и доступных ректальному исследованию внутренних лимфатических узлов, селезенки, опухолевых разрастаний в различных частях тела [123, 126, 190].
Патоморфологические исследования основывались на установлении патологических изменений в организме инфицированного животного. При вскрытии трупов учитывались размер и консистенция селезенки, лимфатических узлов и других внутренних органов [23, 28, 29]. Гематологические исследования позволяют установить повышенное содержание лейкоцитов, в частности лимфоцитов крови. Поэтому раньше во многих странах мира одним из основных диагностических методов был гематологический. Оценка результатов гематологических исследований производилась по т.н. "лейкозному ключу", в основу которого положены абсолютное число и процент лимфоцитов для двух возрастных категорий крупного рогатого скота - до 2 лет и старше 3 лет [28, 29].
Наиболее специфичным для лейкоза является развитие лимфоцитоза за счет увеличения количества лимфоидных и малодифференцированных клеток. При лимфоидной форме лейкоза происходит пролиферация лимфоидных клеток разной степени зрелости. При хроническом течении болезни увеличивается содержание лимфоцитов, а при остром и подостром течениях, обострении хронически протекаемого лейкозного процесса преобладающими клеточными элементами становятся пролимфоциты и лимфобласты [28, 112, 193].
Однако все эти вышеперечисленные методы не относятся к методам ранней диагностики. Проявлению клинических и патоморфологических изменений у животных при лейкозе КРС предшествует длительный инкубационный период, который затем сменяется стадией бессимптомной инфекции. Количественные и качественные изменения морфологической картины крови начинают проявляться при стадии бессимптомной инфекции. В большинстве случаев клинические признаки, патоморфологические и гематологические изменения при лейкозе КРС схожи с другими заболеваниями, поэтому не позволяют достоверно выявить всех инфицированных животных [17, 114].
Характерной особенностью ВЛ КРС является пожизненная одновременная персистенция вируса и вирусспецифических антител. Поэтому серологические методы обнаружения противовирусных антител можно использовать для выявления больных животных. У зараженных животных в крови циркулируют антитела к некоторым из структурных белков вируса. Однако диагностическое значение имеют антитела против gp51 и p24 [37, 59, 188]. Количественное соотношение антител против р24 и др51 связано со стадией инфекционного процесса [53, 102, 103]. Многочисленные исследования показывают, что антитела к др51 появляются раньше и в более высоком титре, чем антитела к р24 и, следовательно, серологические реакции, направленные на выявление антител против др51, по своей чувствительности будут превосходить реакции, в которых используется в качестве антигена белок р24 [54, 79, 183].
Для обнаружения специфических антител в лабораториях широко применяют реакцию иммунодиффузии (РИД) и иммуноферментный анализ (ИФА), для постановки которых разработаны и выпускаются соответствующие коммерческие диагностические наборы. Диагностические наборы содержат оболочечный гликопротеин ВЛ КРС, стандартизованный по референтной сыворотке Е1; референтная сыворотка Е4, разведенная с отрицательной сывороткой в соотношении 1:10, которая должна быть выявлена как положительная без повторной постановки реакции или предварительной концентрации. Референтные сыворотки Е1 и Е4 предназначены для стандартизации всех диагностических наборов при проведении РИД и ИФА [138, 152, 201].
Реакция иммунодиффузии. РИД является одним из широко применяемых методов серологического исследования животных в государственных программах по борьбе с ВЛ КРС во многих странах [1, 13, 152].
Сущность метода заключается в том, что антиген и антитело, реагируя в плоском слое агара, образуют преципитат, который проявляется в виде четкой линии преципитации. Реакция иммунодиффузии проходит в 0,8-1,0% геле агара, который готовят на трис-НСІ или боратном буферах в диапазоне рН 7,2-8,6, содержащем 8,0-8,5% NaCl [37, 195]. Методика постановки реакции одинакова для всех диагностикумов и предусматривает заполнение лунок антигеном, антисывороткой и испытуемыми сыворотками по схеме 1:2:4 или 1:3:3. Число проявляющихся линий преципитации соответствует числу пар антиген-антитело в исследуемой системе [138, 195].
Первоначально для выявления животных, инфицированных ВЛ КРС, была разработана РИД, основанная на обнаружении в сыворотке крови антител к внутреннему белку вируса - р24 [8, 24, 144, 145]. Реакция имела низкую чувствительность, хотя и позволяла выявить некоторых инфицированных животных [140]. В 1975 г. впервые появилось сообщение об использовании РИД для выявления антител против гликопротеидного антигена др51 ВЛ КРС [63, 124]. Первые исследования показали, что большинство сывороток, положительно реагирующих в РИД с др51, были отрицательными в РИД на р24. Это позволило сделать вывод, что чувствительность РИД с гликопротеидным антигеном др51 значительно выше, чем при использовании в РИД антигена р24 [42, 43, 113].
Реакция иммунодиффузии в геле агара, направленная на выявление анти-др51 антител, используется в качестве основного диагностического теста, регламентирующего международную и внутреннюю торговлю племенными животными, спермой и эмбрионами. При первичном обследовании сывороток крови, результаты РИД считают достаточными для объявления стада благополучным и свободным от ВЛ КРС [13].
Этот метод по простоте постановки и относительной низкой стоимости не имеет себе равных среди других серологических реакций и широко применяется для поголовного обследования [76].
Однако на результат РИД влияют многие факторы: качество антигена и контрольных сывороток, количественные соотношения антигена и антител, качество агара, рН и ионная сила буфера, температура, диаметр лунок и расстояние между ними [86, 209].
Применение метода ПЦР для выявления провирусной ДНК в образцах крови КРС
Для тестирования были отобраны образцы крови от 14 животных из неблагополучных и 10 проб крови из благополучных хозяйств Владимирской, Ивановской и Нижегородской областей.
Ранее отмечалось [24, 124], что с помощью серологических методов не всегда удается обнаружить наличие специфических антител в сыворотке крови животных. Кроме того, возникают проблемы с ложноположительными результатами, полученными в серологических исследованиях. Поэтому все пробы крови были исследованы с использованием метода ПЦР. Для проведения сравнительных экспериментов пробы сыворотки крови также исследовались методами РИД и ИФА (табл. 7).
В ходе проведенных экспериментов наличие специфических антител к ВЛ КРС в РИД было обнаружено в 14 пробах из 24 протестированных. С помощью ИФА специфические антитела были обнаружены в тех же пробах, которые были положительными в РИД. Кроме того, положительные результаты в ИФА были получены в пробах крови от двух животных (№8 и №10), которые ранее были отнесены к отрицательным в РИД. С помощью метода ПЦР фрагмент амплифицированной ДНК был обнаружен в тех же пробах, которые являлись положительными согласно серологическим реакциям, и в двух образцах, отрицательных в РИД и ИФА (№11 и №22).
Следует отметить, что результаты, полученные в "nestecT-ПЦР с праймерами 1a-1b/2a-2b, полностью совпадали с данными разработанной нами методики ПЦР с одной парой праймеров 4-5F/4R (табл. 7).
Кроме того, нами установлено, что с помощью ПЦР выявляется большее количество инфицированных животных, чем в серологических реакциях, и это согласуется с данными большинства исследователей [47, 50, 93, 135]. Однако необходимо подчеркнуть, что большинство этих исследований проводилось с использованием проб крови, отобранных от экспериментально зараженных животных. В наших исследованиях мы проводили выявление провируса ВЛ КРС в пробах крови животных методом ПЦР у естественно зараженных животных.
Роль молока, как фактора передачи вируса, установлена уже давно. Известно, что при лейкозе КРС снижается качество молока и продуктивность лактирующих коров на 5-7%. В работах [15, 35, 172, 187] показано, что при постоянном выпаивании молока от инфицированных животных удается воспроизвести лейкоз КРС у экспериментальных животных. В настоящее время исследование молока в основном проводят при помощи ИФА [127, 172, 187]. Однако, следует отметить, что в молозиве у недавно отелившихся коров присутствуют в большом количестве колостральные антитела, улавливаемые даже в РИД [25, 39]. Через некоторое время титр антител в молоке этих животных постепенно снижается до уровня, не определяемого в серологических реакциях (РИД и ИФА) [39]. .
В нашей работе мы попытались применить метод ПЦР для выявления провируса ВЛ КРС в пробах молока животных. С этой целью были отобраны образцы молока из двух хозяйств Владимирской области. Всего для исследования было отобрано 30 проб молока, которые были проверены с помощью серологических реакций (РИД и ИФА) и ПЦР. Результаты приведены в табл. 8.
При исследовании в РИД образцов молока из двух хозяйств специфические антитела обнаружили в 8 пробах из 30 исследованных (26,7%). С помощью ИФА наличие специфических антител было обнаружено в большинстве исследованных проб молока. В ИФА положительные результаты получили в 25 пробах молока из 30 протестированных (83,3%). Однако при исследовании в ПЦР с одной парой праймеров провирусную ДНК обнаружили только в 5 пробах (16,7%). Дополнительно было проведено исследование образцов сборного молока из этих хозяйств. В пробе сборного молока из первого хозяйства мы получили слабоположительный результат методом ИФА. Кроме того, в данной пробе был выявлен провирус ВЛ КРС методом "nested -ПЦР с праймерами 1a-1b/2a-2b. В пробе сборного молока из второго хозяйства мы получили отрицательный результат методами ИФА и ПЦР. В качестве подтверждающего теста мы выбрали метод ПЦР с двумя парами праймеров. Но и при проведении ПЦР с двумя парами праймеров для выявления провирусной ДНК мы получили аналогичные результаты.
В результате проведенных экспериментов мы пришли к заключению, что не во всех пробах, содержащих антитела по данным серологических реакций, присутствовал ВЛ КРС, как это подтверждают результаты ПЦР. По нашему мнению лишь в тех пробах молока, где была выявлена провирусная ДНК, молоко может служить как фактор передачи лейкоза КРС.
С помощью серологических реакций (РИД и ИФА) в сыворотке крови животных обнаруживаются специфические антитела к ВЛ КРС. В данном эксперименте мы попытались применить метод ПЦР для выявления фрагмента амплифицированной ДНК в сыворотках крови животных. Для проведения исследований были отобраны 11 образцов сывороток крови из неблагополучного по лейкозу хозяйства Ивановской области, которые предварительно анализировались серологическими методами. Положительные результаты в РИД и ИФА были получены во всех образцах сывороток крови животных. При исследовании проб крови данных животных с помощью ПЦР с одной парой праймеров 4-5F/4R положительные результаты были получены только в 3 пробах из 11 (№1-3). С помощью метода ПЦР с двумя парами праймеров 1a-1b/2a-2b, фрагмент провирусной ДНК ВЛ КРС был обнаружен в 5 пробах (№1-5).
Обнаружение провирусной ДНК в образцах носовых истечений КРС
Для изучения этиологии, патогенеза и эпизоотологии болезни, вызванной лейкозом КРС многими исследователями проводилось экспериментальное воспроизведение инфекции на гетерологичных животных [38, 56, 80, 92].
Для экспериментального заражения лейкозом КРС преимущественно используются овцы, т.к. они являются наиболее удобной моделью для воспроизведения инфекции. Действительно, у овец заражение ВЛ КРС происходит в более ранние сроки, чем у КРС [38, 80, 136]. Данный фактор является ключевым при подборе диагностических систем для выявления животных на ранних стадиях инфицирования [38, 125, 205].
Для диагностики лейкоза КРС у овец, экспериментально зараженных ВЛ КРС, применяли РИД и ИФА, а также ПЦР [24, 56, 205]. При этом серологические исследования показали, что антитела к вирусу лейкоза выявляют через 5-8 недель после заражения [24, 56]. В большинстве случаев показано, что с помощью серологических реакций не всегда удается выявить всех инфицированных животных. С помощью ПЦР провирусная ДНК выявляется в крови через 1-2 недели после экспериментального заражения овец [24, 205].
В нашей работе мы попытались провести диагностическое обследование овец, содержащихся совместно с КРС в естественных условиях: выявить наличие антител в сыворотках крови методом РИД или обнаружить провирусную ДНК с помощью метода ПЦР в крови овец. С этой целью были отобраны образцы крови от 434 овец из хозяйства Чуйской области Республики Кыргызстан, которые контактировали с инфицированными лейкозом КРС коровами при их совместном выпасе на общих пастбищах.
В данном хозяйстве ведется программа по искоренению лейкоза КРС. С целью предотвращения дальнейшего распространения инфекции среди поголовья КРС, инфицированные животные содержатся отдельно. Для их выявления используют метод РИД, на основании которого ведется выбраковка инфицированных животных.
Дополнительно были отобраны образцы крови от КРС из этого же хозяйства для выявления инфицированных животных серологическими методами. В данном хозяйстве КРС содержатся в трех разных группах, из которых 2 считаются условно свободными от ВЛ КРС, где отобрали 475 образцов крови. В третьей группе этого хозяйства, где содержатся 250 голов КРС, отбор проб крови не проводился, так как сыворотки крови этих животных ранее неоднократно реагировали положительно в РИД.
Первоначально были исследованы сыворотки крови КРС на наличие антител против ВЛ КРС серологическими методами (РИД и ИФА). При исследовании в РИД проб сывороток крови от КРС, антитела были выявлены у 24 животных из 475 (5,3%). Для тестирования в ИФА мы использовали пулы сывороток, каждый из которых состоял из 10 образцов сывороток крови КРС. Положительные результаты в ИФА были получены в 17 пулах из 48. Затем проводили повторное исследование этих же проб, но при составлении пулов не использовали пробы сывороток, прореагировавших положительно в РИД. В 7 пулах были получены положительные результаты (табл. 13). Кроме того, с помощью ИФА было проведено исследование по отдельности проб 31-40, исключая прореагировавших положительно в РИД, и было выявлено наличие антител в пробе №31. Из этого сделали вывод, что в остальных 6 положительных пулах также может выявляться хотя бы по одной положительно реагирующей пробе.
На основании проведенных серологических исследований инфицированность лейкозом КРС в двух группах составляет 5,3% при исследовании в РИД и не менее 6,5% в ИФА. Данные результаты показывают, что с помощью ИФА выявляется большее количество положительно реагирующих проб сывороток крови от животных, и подтверждают тот факт, что ИФА является более чувствительным методом, чем РИД. Учитывая данные по третьей группе, где содержатся 250 зараженных животных (на основании РИД) в целом по хозяйству инфицированность лейкозом среди КРС составляет свыше 30%.
Также следует учесть тот момент, что отбор крови мы проводили через три месяца после проведения в данном хозяйстве обследования на лейкоз с помощью РИД. Как видно по результатам наших исследований сывороток крови из двух групп, которые считаются условно свободными от лейкоза КРС, были выявлены инфицированные животные, что согласуется с данными [24]. Поэтому предлагается на заключительных этапах обследования применять метод ПЦР, с помощью которого удается достоверно выявить всех инфицированных животных [17, 24, 85, 124].
Диагностика лейкоза крупного рогатого скота у КРС и овец, содержащихся совместно в естественных условиях
На протяжении ряда лет в нашей лаборатории для выявления генома провируса лейкоза КРС методом ПЦР использовали праймеры к области gp51 (1а-1Ь) и Tax (За-ЗЬ). Довольно часто с некоторыми пробами эти праймеры образуют неспецифический продукт, который на форезе выглядит в виде шмера или набора полос. Решить эту проблему удалось, У благодаря использованию "nested -ПЦР [47, 51, 124].
Основным преимуществом метода "nestecT-ПЦР является высокая чувствительность и специфичность. Однако при неаккуратной работе или при анализе большого количества образцов данное преимущество становится серьезным недостатком. Малейшая контаминация рабочих растворов или проб молекулами ДНК-мишени приводит к появлению ложноположительных результатов. Установить источник контаминации и устранить является непростой задачей. Существует ряд правил, выполнение которых помогает избежать контаминации. Однако некоторые исследователи предпочитают применять альтернативные методы, чтобы повысить специфичность ПЦР и избежать ложноположительных результатов. Так для выявления вируса ящура [81] была разработана методика гибридизационно-ферментного варианта метода ПЦР (ПЦР-ИФА), которая позднее успешно использовали для дифференциации вирусов ящура и везикулярной болезни свиней [18, 134].
Мы попытались применить подобный подход для обнаружения провируса лейкоза КРС и разработать альтернативный способ индикации генома ВЛ КРС, обеспечивающий высокую специфичность и не требующий двухстадийного проведения амплификации в отличие "nested -ПЦР.
Изучив данные по применению "nestecT-ПЦР с внешними 1а-1Ь и внутренними 2а-2Ь праймерами, мы усомнились в удачном выборе структуры внешней пары 1а-1Ь, поскольку после первой амплификации видимый продукт в агарозном геле, как правило, отсутствовал, либо наблюдался шмер или набор фрагментов, среди которых было невозможно определить фрагмент нужной длины. Для более достоверного анализа, мы провели параллельно две реакции амплификации с внешними и внутренними праймерами, а также "nestecT-ПЦР. С внутренними праймерами 2а-2Ь результаты оказались лучше, чем с парой 1а-1Ь (табл. 16, пробы 1, 3). Именно по этой причине в ПЦР-ИФА решено было использовать пару 2а-2Ь и биотинилированный зонд 2abz, структура которого совпадает с участком, расположенным внутри фрагмента, ограниченного этими праймерами.
Зонд состоит из олигонуклеотидной части, спейсера и биотина. Роль олигонуклеотида заключается в комплементарном взаимодействии с соответствующим участком ампликона во время гибридизации. Биотин обеспечивает иммобилизацию зонда благодаря связыванию с авидином, адсорбированным на поверхности ячеек планшета для ИФА.
Спейсер представляет собой цепочку из СН2-групп, соединяющую 5 -конец олигонуклеотида с молекулой биотина. Длина спейсера может варьировать. В нашей работе мы использовали два зонда с одинаковой олигонуклеотидной частью, отличающиеся длиной спейсера. Зонд Bio2-2abz имел короткий спейсер из двух СН2-групп. В зонде с длинным спейсером Bio6-2abz было шесть СН2-групп.
Материалом для исследования служила кровь больных и здоровых животных (КРС) по данным РИД. Положительные результаты (оптическая плотность OD4g2 больше 0,200) были получены только с зондом Bio2-2abz (табл. 15). В эксперименте использовали разные количества каждого зонда, чтобы подобрать эмпирическим путем необходимое количество зонда на лунку. При анализе положительных проб не наблюдали существенной разницы в значениях оптической плотности с увеличением количества наносимого зонда. По-видимому, минимальных испытуемых количеств (0,5 мкл на лунку) было достаточно, чтобы заполнить все участки связывания авидина с биотином, поэтому увеличение содержания зонда в лунке не влияло на конечный результат.
Для оценки эффективности ПЦР-ИФА в сравнении с другими методами диагностики лейкоза КРС параллельно методами ПЦР-ИФА, ПЦР с одной парой праймеров и "nested -ПЦР исследовали кровь животных, среди которых были КРС и экспериментально инфицированные овцы и лошади. Те же образцы крови предварительно были проверены на наличие антител к вирусу лейкоза КРС в РИД и ИФА. ПЦР-ИФА проводили по стандартной схеме, для детекции амплифицированного продукта использовали как электрофорез, так и ИФА. По данным, приведенным в табл. 16, результаты "nestecT-ПЦР и ПЦР-ИФА совпали. Более того, в ряде случаев (табл. 15, пробы 4-5; табл. 16, пробы 2 и 4) ПЦР-ИФА позволяла обнаружить фрагмент амплификации, когда этого не удавалось сделать с помощью электрофореза.
Проведенные исследования продемонстрировали возможность применения гибридизационно-ферментного варианта метода ПЦР (ПЦР-ИФА), в котором используется однократная ПЦР с праймерами 2а-2Ь и гибридизация с зондом Bio2-2abz, для выявления провируса лейкоза КРС.
Лейкоз КРС широко распространен во многих странах мира и наносит значительный экономический ущерб животноводству, который слагается из снижения продуктивности животных, вынужденного убоя и снижения качества животноводческой продукции. С лейкозом КРС проводится борьба путем выявления больных животных, их изоляции и вынужденного убоя. Однако, когда инфицированность в стаде достигает 30% и более, / вынужденный убой приводит к упадку любое хозяйство. Поэтому в таких хозяйствах проводятся мероприятия по изоляции больных животных и планомерного отправления их на убой. В этом случае огромное значение имеет диагностика лейкоза и индикация вируса. В настоящее время с этой целью, наряду с гематологическими исследованиями, широко применяются серологические методы РИД и ИФА. Однако этими методами выявляются не все больные животные.
В последние годы в диагностике инфекционных болезней широко применяются методы с использованием ПЦР, причем для диагностики лейкоза КРС используют, как правило, метод ПЦР с двумя парами праймеров, что приводит к значительному удорожанию диагностической процедуры, а материалом для исследования служит кровь животных. В литературе отсутствуют данные по использованию ПЦР для диагностики ВЛ КРС в других биологических жидкостях, в которых могут содержаться инфицированные лимфоциты (молоко, сперма, носовые истечения, слюна и т.п.). Разработка простого и эффективного варианта метода ПЦР с одной парой праймеров, а также усовершенствование существующих специфических методов выявления возбудителя лейкоза КРС в крови и других биологических жидкостях были предприняты в настоящей работе.
В ходе проведенных экспериментов были оптимизированы условия подготовки биологических проб для ПЦР. Для выделения ДНК из образцов носовых истечений и молока нами был использован метод ускоренной пробоподготовки. Методом универсальной пробоподготовки мы проводили выделение ДНК из образцов цельной крови и сыворотки.
