Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Общая характеристика оспы овец и коз 11
1.1.1. Распространенность заболеваний 11
1.1.2. Клиническая картина заболеваний 14
1.1.3. Патологоанатомические изменения 15
1.1.4. Эпизоотологические особенности 16
1.2. Характеристика BOO и ВОК 17
1.2.1. Таксономическое положение 17
1.2.2. Видовая специфичность 18
1.2.3. Физико-химические свойства 20
1.2.4. Структура вириона 20
1.3. Геном BOO и ВОК 25
1.4. Патогенез BOO и ВОК 27
1.4.1. Проникновение вируса в клетку 27
1.4.2. Депротеинизация вирусной сердцевины 29
1.4.3. Экспрессия генов 30
1.4.4. Морфогенез 31
1.5. Культивирование BOO и ВОК 32
1.6. Иммунитет и специфическая профилактика 33
1.7. Диагностика оспы овец и оспы коз 37
1.7.1. Дифференциальная диагностика 37
1.7.2. Вирусологические методы диагностики 38
1.7.3. Серологические методы 40
1.7.4. Молекулярно-биологические методы 48
1.8. Заключение по обзору литературы 51
2. Собственные исследования 54
2.1. Материалы 54
2.1.1. Патологический материал 54
2.1.2. Вирусы 54
2.1.3. Реактивы и ферменты 54
2.1.4. Праймеры 55
2.1.5. Растворы и буферные смеси 55
2.1.6. Оборудование 55
2.2. Методы 56
2.2.1. Расчет праимеров для ПЦР 56
2.2.2. Выделение ДНК 57
2.2.3. Полимеразная цепная реакция 57
2.2.4. Очистка продуктов ПЦР 58
2.2.5. Рестрикционный анализ 58
2.2.6. Молекулярное клонирование 59
2.2.7. Экспрессия рекомбинантных белков 59
2.2.8. Сыворотки крови 59
2.2.9. Иммуноферментный анализ 60
3. Резульаты собственных исследований 62
3.1. Расчет праимеров для метода индикации и видовой дифференциации каприпоксвирусов 62
3.2. Оценка специфичности метода видовой дифференциации каприпоксвирусов 64
3.3. Оценка аналитической чувствительности метода видовой дифференциации каприпоксвирусов 67
3.4. Разработка метода дифференциации вакцинных и эпизоотических штаммов вируса оспы овец 69
3.5. Оценка специфичности метода штаммовой дифференциации BOO.. 71
3.6. Разработка метода обнаружения вируса контагиозной эктимы на основе ПЦР 74
3.7. Получение рекомбинантных антигенов BOO 76
3.8. Оценка активности рекомбинантных антигенов 79
3.9. Разработка непрямого варианта ИФА на основе рекомбинантных антигенов Р17иР18 81
3.9.1. Определение рабочего разведения антигенов Р17иР18 81
3.9.2. Выбор блокирующего раствора 83
3.9.3. Выбор буфера для приготовления блокирующего раствора 87
3.9.4. Выбор рабочего разведения конъюгата 88
3.9.5. Определение позитивно-негативного порога для Р17-ИФАиР18-ИФА 89
3.9.6. Оценка воспроизводимости методов Р17-ИФА и Р18-ИФА 91
3.10. Определение диагностической чувствительности и специфичности ИФА на основе рекомбинантных антигенов Р18иР17 92
4. Обсуждение результатов исследования 95
5. Выводы 108
6. Практические предложения 109
7. Список литературы 110
Приложения 128
- Характеристика BOO и ВОК
- Экспрессия рекомбинантных белков
- Оценка специфичности метода видовой дифференциации каприпоксвирусов
- Разработка непрямого варианта ИФА на основе рекомбинантных антигенов Р17иР18
Введение к работе
Актуальность темы. Оспа овец и оспа коз - высококонтагиозные вирусные заболевания мелких жвачных. По классификации МЭБ они относятся к трансграничным болезням животных, способным вызывать эпизоотии и наносить большой экономический ущерб. Оспа овец и коз эндемична на Ближнем Востоке, в Центральной Азии, Индии, Китае, а также в Центральной и Южной Африке. В 1996-2003 гг. неблагополучными по этим заболеваниям были 55 стран, в том числе 7 стран СНГ. В России оспа регистрировалась в 1994-2000 и 2002-2003 гг. [187].
Возбудителями болезней являются близкородственные, но таксономически самостоятельные виды - вирус оспы овец (BOO) и вирус оспы коз (ВОК), - относящиеся к роду Саргурох семейства Poxviridae. BOO и ВОК не обладают четко выраженной хозяйской специфичностью: несмотря на то, что обычно вирусы вызывают наиболее выраженное заболевание либо у овец, либо у коз, некоторые штаммы патогенны для обоих видов животных-хозяев [112]. Это делает актуальной задачу видовой дифференциации возбудителей оспы.
Для специфической профилактики оспы используются живые аттенуированные вакцины. Вакцинированные животные в результате контакта с эпизоотическими штаммами могут становиться бессимптомными носителями вируса и служить резервуаром инфекции. В связи с этим, при обнаружении у вакцинированных животных вируса оспы возникает необходимость в дифференциации вакцинных и эпизоотических штаммов.
Лабораторная диагностика оспы основана на обнаружении вируса или его составляющих (белков, ДНК) в патологическом материале, либо антител к вирусу в крови животных.
Традиционные методы диагностики оспы овец и коз (реакция нейтрализации, выделение вируса на культуре клеток) не способны дифференцировать вирусы оспы овец и оспы коз друг от друга и, тем более, вакцинные штаммы вирусов от эпизоотических. На сегодняшний день различать вирусы рода Саргурох возможно только с помощью рестрикционного картирования или нуклеотидного секвенирования вирусных геномов (ДНК). Однако в силу сложности и трудоемкости они неприменимы для рутинной диагностики.
В соответствии с требованиями МЭБ при подозрении на оспу овец и коз патологический материал должен тестироваться также на наличие вируса контагиозной эктимы. Этот парапоксвирус вызывает заболевание, которое, также как и оспа, проявляется поражениями кожи, однако не относится к особо опасным болезням из-за незначительной смертности среди пораженных животных. Метод обнаружения вируса контагиозной эктимы с помощью ПЦР в России до сих пор отсутствует.
Для выявления антител к BOO и ВОК традиционно используется реакция нейтрализации. Метод дорог, малопроизводителен, может выполняться лишь в условиях специализированных лабораторий с высоким классом биологической защиты. Первые попытки применения ИФА для выявления антител к BOO и ВОК были основаны на использовании в качестве антигена очищенных препаратов вирусов [48, 89, 142] Однако из-за невозможности избавиться от примесей клеточных белков в препаратах антигена специфичность реакции была низкой. Для избежания этой проблемы H.G.Heine et al. [40] предложили для выявления антител к BOO и ВОК ИФА, основанный на использовании рекомбинантного антигена Р32, полученного экспрессией в E.coli. Разработанный ими ИФА имел ряд преимуществ перед традиционными тест-системами, поскольку рекомбинантный антиген был биологически безопасен, дешев в получении, а также имел высокую степень очистки, что обеспечивало высокую специфичность реакции. Однако в России подобные работы не проводились.
Таким образом, в диагностике оспы овец и оспы коз нерешенными оставался ряд проблем. Отсутствовали простые и быстрые методы видовой и штаммовой дифференциации вирусов оспы овец и оспы коз. Не разрабатывались в России и высокоспецифичные иммуноферментные методы для выявления антител к этим вирусам.
Цели и задачи исследования. Цель нашей работы заключалась в совершенствовании методов диагностики оспы овец и оспы коз.
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
- провести сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генома вирусов рода Саргурох, выявить участки генома, пригодные для видовой дифференциации каприпоксвирусов и для дифференциации вакцинных и эпизоотических штаммов этих возбудителей;
- разработать простой и быстрый метод обнаружения и дифференциации вирусов оспы овец и оспы коз, основанный на ПЦР и не требующий проведения таких дополнительных процедур, как рестрикционный анализ или нуклеотидное секвенирование;
- разработать метод, позволяющий различать вакцинные и эпизоотические штаммы вируса оспы овец;
- для проведения дифференциальной диагностики оспы овец и оспы коз от контагиозной эктимы разработать на основе ПЦР метод обнаружения вируса контагиозной эктимы;
- получить рекомбинантные антигены вируса оспы овец экспрессией в E.coli;
- на основе рекомбинатных антигенов разработать иммуноферментный метод для выявления антител к вирусам оспы овец и оспы коз Научная новизна исследований.
Впервые разработан экспресс-метод, позволяющий выявлять и дифференцировать виды каприпоксвирусов только на основе ПЦР, без дополнительных исследований (рестрикционного анализа или нуклеотидного секвенирования).
Предложен метод дифференциации вакцинных штаммов «НИСХИ», «ВНИИЗЖ» и «Б 5/96» вируса оспы овец от эпизоотических изолятов на основе ПЦР с последующим рестрикционным анализом ампликонов, не имеющий аналогов в диагностике оспы овец.
Предложен метод дифференциальной диагностики вируса оспы овец и вируса оспы коз от вируса контагиозной эктимы.
Экспрессией в Е. coli получены рекомбинантные белки Р17, Р18 и Р26 вируса оспы овец.
Разработан непрямой вариант ИФА с использованием рекомбинантных белков Р17 и Р18 в качестве антигенов для обнаружения антител к каприпоксвирусам в сыворотках крови мелких жвачных.
Практическая значимость исследований.
В результате проведенных исследований разработано 5 методик, которые прошли комиссионные испытания, одобрены ученым советом и утверждены директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»:
«Методика обнаружения и видовой дифференциации каприпоксвирусов с использованием мультиплексной полимеразной цепной реакции» (2005 г.);
«Методика обнаружения вируса контагиозной эктимы с использованием полимеразной цепной реакции» (2005 г.);
«Методика дифференциации вакцинных и эпизоотических штаммов вируса оспы овец с использованием рестрикционного анализа продуктов ПЦР» (2005 г.);
«Методика обнаружения антител к каприпоксвирусам в непрямом иммуноферментном анализе с использованием рекомбинантного антигена Р17 вируса оспы овец» (2006 г.);
«Методика обнаружения антител к каприпоксвирусам в непрямом иммуноферментном анализе с использованием рекомбинантного антигена Р18 вируса оспы овец» (2006 г.).
Публикации научных исследований. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе одна работа в издании, рекомендованном ВАК РФ.
Апробация работы. Материалы диссертации представлены и обсуждены на Международной научной конференции молодых ученых «Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных» (Владимир, 2004г.), а также на заседаниях ученого совета ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» в период 2002-2006 гг.
Основные положения, выносимые на защиту:
Метод обнаружения и видовой дифференциации каприпоксвирусов, с использованием мультиплексной ПЦР.
Метод дифференциации вакцинных и эпизоотических штаммов вируса оспы овец с использованием рестрикционного анализа продуктов ПЦР.
Метод обнаружения вируса контагиозной эктимы с использованием ПЦР.
Получение рекомбинантных антигенов вируса оспы овец и оценка их антигенной активности.
Использование рекомбинантных антигенов Р17 и Р18 вируса оспы овец в непрямом варианте ИФА.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 133 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения и 5 приложений. Список используемой литературы включает 188 источников, из которых 149 на иностранном языке. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 16 рисунками.
Исследования по диссертационной работе выполнены в 2003-2006 гг. в ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (г. Владимир).
Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю кандидату биологических наук Алексею Владимировичу Щербакову и сотрудникам лаборатории диагностики особо опасных болезней животных -за оказанную практическую помощь в выполнении отдельных этапов работы и оформлении диссертации.
Характеристика BOO и ВОК
По современной классификации вирусов все оспенные возбудители, вызывающие заболевания у человека, а также у многих видов животных и растений, отнесены к семейству Poxviridae [181]. Основные свойства вирусов семейства Poxviridae это: большой сложный вирион, содержащий ферменты для синтеза мРНК; геном, представленный одной линейной двуцепочечной молекулой ДНК длиной 130-300 т.п.н. со шпилеобразной петлей на концах; цитоплазматический сайт репликации.
Семейство подразделено на два подсемейства: вирусы оспы позвоночных (Chordopoxvirinae) и вирусы оспы насекомых (Entomopoxvirinae). Первое делится на 8 родов, второе - на 3 рода. Представители одного рода генетически и антигенно родственны, имеют сходную морфологию и спектр хозяев. Между родами могут наблюдаться перекрестные серологические реакции, по крайней мере, по группоспецифичному антигену [171, 186].
Род Caprypoxvirus включает вирусы оспы овец и оспы коз и вирус кожной бугорчатой КРС (вирус Нетлинга или вирус нодулярного дерматита). Представители рода близкородственны, что доказывается иммунологическим анализом [114] и структурой генома [92]. Вирусы оспы овец и коз морфологически и серологически неотличимы друг от друга. Поэтому некоторые исследователи считали, что возбудителем этих заболеваний является один вирус, обладающий разной видовой специфичностью [58, 59, 115]. Дальнейшие молекулярно-биологические исследования вирусов оспы овец и коз установили, что, несмотря на очень большую степень сходства их геномов, есть отличия в белках этих вирусов, позволяющие говорить об их филогенетическом различии [170]. В связи с новыми данными BOO и ВОК стали рассматривать как отдельные таксономические виды [4, 181].
Вирусы оспы овец и коз поражают в основном мелких жвачных (овец и коз). Особенно тяжело заболевание протекает у овец тонкорунных пород и коз ангорской породы. Некоторые штаммы могут вызывать местные поражения у КРС. К оспе овец восприимчивы и некоторые дикие животные (сайгаки, козероги, газели). Последние могут служить источником и переносчиком инфекции [16].
В естественных условиях вирусы оспы овец и оспы коз имеют высокую специфичность к виду животного-хозяина, однако она не является жестко детерминированной и отличается от изолята к изоляту. Предполагают, что вирулентность каприпоксвирусов настолько вариабельна, что некоторые штаммы патогенны только для коз и потому считаются вирусом оспы коз. Другие штаммы патогенны только для овец и потому их рассматривают как вирус оспы овец. Оставшиеся штаммы могут вызывать заболевание, как у овец, так и у коз. Видовая специфичность, проявляемая разными штаммами, является, вероятно, следствием их адаптации к овцам или козам в ограниченном географическом регионе [110]. Однако вопрос обозначения оспенных заболеваний овец и коз единым термином «каприпокс», как предлагалось ранее, сейчас оспаривается [58].
Для некоторых штаммов BOO и ВОК, действительно, характерна строгая специфичность к гомологичному виду животного-хозяина. Так штамм «А» BOO обладал патогенностью по отношению к овцам и не вызывал заболевания и коз [25]. Также строго специфичны и изоляты со Среднего Востока и из Индии - вирус оспы овец не поражает коз, а вирус оспы коз не поражает овец [52, 113, 163]. Согласно другим исследованиям, некоторые штаммы BOO и ВОК в равной степени патогенны для обоих видов животных: кенийский, йеменский и оманский изоляты вируса оспы овец с одинаковой легкостью поражают овец и коз [112]. Вирулентный штамм «Р-4» ВОК патогенен - как по отношению к козам, так и к овцам, вызывая более легкую или равную по тяжести форму болезни [10, 25]. Есть штаммы, занимающие по своим свойствам промежуточное положение между BOO и ВОК [112].
Установлено, что овцы и козы могут обмениваться штаммами Caprypoxvirus [25]. Кроме того, в природных условиях между штаммами каприпоксвирусов могут происходить рекомбинации, приводящие к изменению спектра видовой специфичности и вирулентности [132].
По современной таксономии вирусы оспы овец и оспы коз являются самостоятельными нозоологическими единицами [181], но не обладают четко выраженной видовой специфичностью. Все это обуславливает необходимость разработки методов дифференциальной диагностики BOO и ВОК и подробного изучения вновь возникающих вариантов этих вирусов.
Экспрессия рекомбинантных белков
Молекулярное клонирование амплифицированных методом ПЦР и очищенных фрагментов генома BOO осуществляли по общепринятым методикам [19, 29].
Культивирование Е. coli проводили в течение ночи при 37С в орбитальном шейкере на 150 об/мин. Индукцию осуществляли добавлением в дневную культуру бактериальных клеток 1М раствора индуктора IPTG (Promega, США) [29]. Размер рекомбинантных белков и уровень экспрессии определяли с помощью вертикального электрофореза в 12% полиакриламидном геле. Экспрессированные рекомбинантные белки очищали методом металл-хелатной хроматографии с использованием Ni-NTA агарозы (QIAGEN). Очищенные препараты рекомбинантных белков использовали для изучения их антигенной активности и специфичности.
В качестве положительного контроля использовали сыворотку крови, взятую от овцы, экспериментально зараженной эпизоотическим штаммом BOO. Нормальная сыворотка крови для отрицательного контроля получена от здорового барана, не имеющего антител к BOO. Контрольные сыворотки с подтвержденным серологическим статусом в реакции нейтрализации предоставил «Отдел биологического и технологического контроля» ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных». Сыворотки крови от здоровых не вакцинированных овец были получены из хозяйств Новосибирской и Тверской областей. Оптимизация отдельных этапов подробно описана в разделе «Результаты собственных исследований» (п. 4). Непрямой вариант ИФА после оптимизации условий выполняли по стандартной методике [15,35]. Полистироловые планшеты сенсибилизировали рекомбинантным антигеном, разведенным в 0,1 М буфере КББ до концентрации белка 10 мкг/мл. После 17 часов инкубации при 4С содержимое лунок удаляли и вносили 10% раствор молока в буфере TBS для блокирования не связавшихся с антигеном участков лунок. Планшеты инкубировали 1 час при 37С с последующей трехкратной отмывкой буфером TBS. Затем в лунки вносили разведенные в 3% растворе молока на буфере TBS контрольные и испытуемые сыворотки и инкубировали 1 час при 37С. После трехкратной отмывки буфером TBS в каждую лунку вносили раствор универсального моноклонального пероксидазного конъюгата (Sigma), взятого в рабочем разведении 1:16000. Планшеты инкубировали 1 час при 37С, три раза отмывали буфером TBS и вносили для окрашивания раствор субстрата ABTS на 10-15 минут. Реакцию останавливали добавлением 1%-ного раствора SDS и определяли оптическую плотность содержимого каждой лунки с использованием спектрофотометра при длине волны 405 нм (Каныпина, 2002). Учет результатов непрямого варианта ИФА, обработку, хранение и анализ полученных данных проводили с помощью компьютерной программы «СИНКО-ИФА» (ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», свидетельство о регистрации №2000611338). Статистическую обработку экспериментальных данных проводили по методу Стьюдента. Определение средней арифметической (хср) при количестве опытов (п), среднего квадратичного отклонения (а) от средней арифметической, оценку достоверности (Р) показателей проводили согласно руководству И.В.Полякова [26]. Позитивно-негативный порог (ПНП) определяли по методу Snyder с небольшими модификациями: путем расчета средних значений ОП отрицательных сывороток для каждого разведения с прибавлением трех значений стандартного отклонения. ПНП, полученный в виде прямой, представлял границу, отражающую верхние 0,5% отрицательных величин. Титром антигена или сыворотки крови считали последнее разведение, в котором оптическая плотность в два раза превышала среднее значение оптической плотности отрицательного контроля на данном планшете. Относительную чувствительность и специфичность непрямого варианта ИФА подсчитывали, используя следующие формулы: чувствительность = а / (а + с) 100%; специфичность = d / (b + d) 100%, где: а- количество заведомо положительных проб; d- количество заведомо отрицательных проб; с- количество ложноотрицательных проб; Ь- количество ложноположительных проб. Статистическая обработка результатов. Определение среднего арифметического (х) при количестве опытов (п), среднего квадратичного отклонения (а) средней арифметической проводили согласно руководству И.В.Полякова [26].
Оценка специфичности метода видовой дифференциации каприпоксвирусов
Для определения специфичности метода видовой дифференциации каприпоксвирусов были использованы четыре вируса оспы овец (штамм «ВНИИЗЖ», изоляты «Афганский», «Приморский», «ЕАО»), четыре вируса оспы коз (штаммы «ВНИИЗЖ», «Pellor», изоляты «Таджикский», «ЕАО») и один изолят вируса бугорчатки. При этом изоляты «Приморский» и «ЕАО» ВОК были представлены в виде суспензии кожи больных животных, а все остальные - в виде вируссодержащих клеточных культур. Кроме того, были приготовлены пробы, содержащие смесь двух и трех видов каприпоксвирусов одновременно. Всего для оценки диагностической специфичности метода было исследовано 11 проб, содержащих каприпоксвирусы.
Первым этапом проверки разработанного метода была оценка специфичности универсальных праймеров О и С2 для трех видов каприпоксвирусов. С этой целью для всех проб проводили ПЦР с родоспецифичными праймерами С1 и С2. Как показал электрофорез продуктов ПЦР в 2%-ом агарозном геле специфический фрагмент расчетной длины (693 п.н. для BOO и ВБ и 703 п.н. для ВОК) был получен как для проб, содержащих BOO, ВОК или ВБ, так и для проб с их смесью (рис. 5А). Полученные результаты подтвердили универсальность праймеров С1 и С2 для всех трех видов каприпоксвирусов.
Специфический фрагмент ДНК отсутствовал в пробах, содержащих изоляты "Таджикский" и "ЕАО" ВОК (рис. 5А, треки 7, 9). Эти пробы отличались от остальных тем, что представляли собой суспензию органов и, вероятно, содержали вирус в концентрации, недостаточной для обнаружения с помощью одного раунда ПЦР. Результаты второго раунда ПЦР подтвердили это предположение.
На рисунке 5 В отражены результаты второго раунда ПЦР -мультиплексной ПЦР с видоспецифичными праймерами. В пробах, содержащих ДНК BOO, был получен ампликон длиной 311 п.н., что соответствует расчетному значению. Фрагмент длиной 415 п.н. синтезировалась в пробах с генетическим материалом ВОК. Ожидаемый результат - ампликон длиной 254 п.н. - был получен и в пробе с ДНК ВБ.
Неожиданный результат был получен при анализе пробы, содержащей изолят "Таджикский" ВОК. Электрофорез продуктов мультиплексной ПЦР показал наличие в этой пробе фрагмента длиной 311 п.н., специфичного для BOO, вместо ожидаемого фрагмента размером 415 п.н., характерного для ВОК. На основании полученных результатов предположили, что изолят «Таджикский» в действительности является вирусом оспы овец. Дальнейшие исследования подтвердили это предположение.
Для проверки возможности выявления каприпоксвирусов в смешанных пробах провели ПЦР со смесью ДНК. При этом в пробах, содержащих смесь ДНК BOO и ВОК, синтезировались два фрагмента, а со смесью ДНК BOO, ВОК и ВБ - три ампликона соответствующей длины (рис. 5В).
Разработанный по результатам исследований метод видовой дифференциации каприпоксвирусов с использованием мультиплексной ПЦР прошел комиссионные испытания, одобрен ученым советом и утвержден директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (приложение №1). Для определения аналитической чувствительности метода видовой дифференциации каприпоксвирусов использовали культуральную суспензию вакцинного штамма «ВНИИЗЖ» BOO с известным начальным титром вируса, составлявшим 10 ЦПДі()/мл. Из исходного вирусного препарата сделали последовательные десятикратные разведения от 10"1 ЦПДУмл до \0 2 ЦПДзц/мл. В результате получили серию проб с убывающим количеством вирусного агента. Из каждой пробы выделяли суммарную ДНК, которую использовали при проведении ПЦР.
После первого раунда ПЦР с универсальными праймерами О и С2 вирус был выявлен в образцах (разведениях), содержащих от Ю ЦПД /мл до 10" ЦПД /мл (рис. 6А). После второго раунда ПЦР с видоспецифичными праймерами вирус был обнаружен еще в четырех разведениях, содержащих от 101 ЦПД5(,/мл до !0"2ЦПД5и/мл (рис. 6В).
Полученные данные позволяют сделать заключение о том, что аналитическая чувствительность метода видовой дифференциации каприпоксвирусов составляет 10"" ЦПД5((/мл.
Рисунок 6. Определение аналитической чувствительности метода на примере вакцинного штамма "ВНИИЗЖ" НОО. Объем проб - 5 мкл; сверху указаны рачведепия вируса в ЦПД?ц/мл; А - первый раунд ПЦР с универсальными праймерами С1 и С2; В -второй раунд ІІЦР (мультиплексная ПЦР). Вторым этапом нашей работы являлась разработка метода, позволяющего дифференцировать вакцинные и эпизоотические штаммы BOO. Для достижения этой цели, прежде всего было необходимо провести сравнительный анализ всех доступных на данный момент нуклеотидных последовательностей вируса оспы овец для поиска областей генома, отличающихся у вакцинных и эпизоотических штаммов BOO.
В настоящее время в Базе данных Европейского Биоинформационного Института (EMBL) для BOO представлены полные последовательности генома двух эпизоотических штаммов (А и TU-V02127) и одного вакцинного штамма (НИСХИ). Их анализ показал что, несмотря на значительную гомологию (более 99,9%), последовательность ДНК вакцинного штамма BOO отличается от таковой эпизоотических штаммов: отмечена 71 нуклеотидная замена как в транслируемых, так и в нетранслируемых областях генома. При этом изменения затрагивают только 17 белков (Tulman, 2002). Одно из самых существенных отличий аттенуированного вакцинного штамма "НИСХИ" от вирулентных эпизоотических штаммов BOO заключается в изменении структуры двух из пяти генов, содержащих так называемые "ankyrin-repeat" участки. Для дифференциации вакцинных и эпизоотических штаммов BOO в качестве мишени выбрали ген одного из "ankyrin-repeat" белков, соответствующий 145 ОРС ВБ. Он несет маркерный признак аттенуированного штамма: точечную мутацию в 244 триплете в виде замены нуклеотида А на Т (рис. 7). Эта мутация приводит к появлению стоп-кодона (AAA — ТАА) и укорочению белка. В результате у вирулентных форм BOO этот белок состоит из 638 а.о., тогда как у аттенуированного штамма - только из 243 а.о. Возникновение стоп-кодона у аттенуированного штамма сопровождается появлением сайта ТТТААА, узнаваемого рестриктазой Dral (жирным шрифтом выделен тимидин, появившийся в результате точечной мутации).
Разработка непрямого варианта ИФА на основе рекомбинантных антигенов Р17иР18
Исходная концентрация очищенных препаратов рекомбинантных белков, определенная по методу Бредфорда, составляла 1,6 мг/мл для Р17 и 1,2 мг/мл для Р18. Выбор рабочего разведения антигена проводили методом непрямого ИФА, в котором все параметры реакции оставались неизменными, за исключением концентрации адсорбируемого на планшет рекомбинантного белка. Для этого готовили серию двухкратных разведений антигена Р17 в буфере КББ от 1:20 до 1:10240. Положительную и отрицательную контрольные сыворотки вносили в разведениях 1:80. Все этапы реакции проводили, как описано выше (п. 4.8). По результатам реакции вычисляли величину S/N, как отношение оптических плотностей положительной и отрицательной контрольной сыворотки (табл. 4). Как видно из данных таблицы 4, для антигена Р17 значение оптической плотности положительной контрольной сыворотки превышало 1,000 при разведениях антигена от 1:20 до 1:640. Однако разница между оптическими плотностями для положительной и отрицательной контрольной сыворотки была максимальной при разведении антигена 1:640. На основании полученных данных это разведение белка Р17 было выбрано в качестве рабочего. Рабочее разведение соответствовало концентрации белка 2,5 мкг/мл. Определение рабочей концентрации для антигена Р18 проводили по аналогичной схеме. В результате установили, что для антигена Р18 значения оптической плотности контрольной положительной сыворотки максимальны при разведениях антигена от 1:20 до 1:80, при этом минимальное значение оптической плотности отрицательной контрольной сыворотки наблюдалось для разведения 1:80 (табл. 4). Поэтому для рекомбинантного антигена Р18 рабочее разведение составило 1:80, что соответствовало его рабочей концентрации 15 мкг/мл.
Последующие этапы оптимизации проводили с учетом полученных результатов. Для сенсибилизации планшетов использовали общепринятую схему: рекомбинантный антиген разводили в карбонатно-бикарбонатном буфере (рН 9,6) до рабочей концентрации (2,5 мкг/мл для белка Р17 или 15 мкг/мл для белка Р18), вносили по 50 мкл в лунки полистирового планшета и инкубировали в течение 16-18 часов при 4-8С. При сенсибилизации планшета антиген занимает лишь часть центров связывания в лунках. С остальными могут взаимодействовать другие компоненты реакции на последующих этапах, приводя к повышению фонового уровня окрашивания. Для снижения этого неспецифического взаимодействия необходимо блокировать свободные центры связывания, оставшиеся в лунках после сенсибилизации планшета. Поэтому при разработке непрямого варианта ИФА важную роль имеет выбор блокирующего раствора. С этой целью нами было проверено 12 растворов различного состава: 10%-, 3%- и 1%-ный раствор нормальной сыворотки лошади, 10%-, 3%- и 1%-ный растворы обезжиренного молока, 10%-, 3%- и 1%-ный растворы дрожжевого экстракта, 10%)-, 3%- и 1%-ный растворы желатина. Наиболее подходящий для блокирования раствор был определен по результатам непрямого ИФА. Способность этих растворов блокировать свободные центры связывания исследовали как в лунках с антигеном, так и без него. Для этого готовили рабочее разведение рекомбинантного белка Р17 и сенсибилизировали им планшеты по общепринятой схеме, при этом часть лунок оставляли без антигена. Блокирование оставшихся в лунках после адсорбции антигена центров связывания осуществляли внесением одного из вышеперечисленных растворов.
Положительную и отрицательную контрольные сыворотки вносили в разведении 1:80. Все последующие этапы проводили, как описано ранее. На основании результатов реакции вычисляли отношение оптических плотностей положительной и отрицательной контрольной сывороток (S/N отношение). По оптическим плотностям контрольных сывороток на безантигенном ряду определяли фоновый уровень. По этим двум показателям оценивали блокирующие способности выбранных растворов. Результаты выбора наилучшего блокирующего буфера для рекомбинантного антигена Р17 приведены в таблице 5. Поскольку разные антигены обладают неодинаковой способностью к сорбированию на планшете, для рекомбинантного белка Р18 блокирующий буфер подбирали отдельно. Влияние состава блокирующего буферного раствора на оптическую плотность контрольных сывороток при использовании антигена Р18 представлены в таблице 6. Подбор блокирующего буфера для планшетов, сенсибилизированных антигеном Р17, показал, что минимальные значения фонового уровня (в лунках без антигена) наблюдаются при использовании 1%, 3% и 10% растворов молока. Для этих же растворов отмечены и наибольшие значения оптической плотности положительной контрольной сыворотки. Окончательный выбор блокирующего буфера был осуществлен после сравнения значений S/N. Как видно из данных таблицы 5, он является максимальным при использовании 10% раствора молока. На основании этих данных в последующих исследованиях при использовании в качестве антигена рекомбинантного белка Р17 блокирование осуществляли 10% раствором молока.
