Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 12
2.1. Инфекционный бронхит кур (ИБК) 12
2.1.1. Патогенез и эпизоотология инфекционного бронхита кур 12
2.1.2. Классификация и структура возбудителя 15
2.1.3.Антигенная вариабельность вируса ИБК 19
2.1.4 Антигенные свойства пепломерного белка S1 23
2.1.5. Характеристика изолятов вируса ИБК, выделенных на птицефабриках России 25
2.2. Инфекционный ларинготрахеит птиц 30
2.2.1. Патогенез и эпизоотология инфекционного ларинготрахеита птиц 30
2.2.2. Классификация и физико-химические свойства вируса ИЛТ 34
2.2.3. Репликация вируса инфекционного ларинготрахеита 40
2.2.4. Диагностика инфекционного ларинготрахеита птиц 42
2.2.5. Дифференциация вакцинных штаммов ИЛТ и полевых изолятов 48
2.3.3аключение по обзору литературы 52
3. Собственные исследования 54
3.1. Материалы 54
3.1.1. Вирус ИБК 54
3.1.2. Вирус ИЛТ 55
3.1.3. Химические реагенты 56
3.1.4. Ферменты 56
3.1.5. Праймеры 56
3.1.6. Оборудование 57
3.2. Методы 58
3.2.1. Очистка и концентрирование вируса ИБК 58
3.2.2. Очистка и концентрирование вируса ИЛТ 59
3.2.3. Титрование вирусов ИБК и ИЛТ 60
3.2.4. Контроль вируссодержащего сырья на отсутствие контаминации бактериальной и грибной микрофлорой 60
3.2.5. Контроль вируссодержащего материала на отсутствие контаминации микоплазмами 61
3.2.6. Непрямой вариант ИФА 62
3.2.7. Блокирующий вариант ИФА 63
3.2.8. Выделение суммарной ДНК и РНК 64
3.2.9. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 65
3.2.10. Прямое секвенирование амплифицированных фрагментов «ДНК 67
3.2.11. Компьютерный анализ первичных структур нуклеиновых кислот 68
3.2.12. Получение гипериммунных сывороток 69
3.2.13. Реакция нейтрализации 69
3.2.14. РДП для выявления вируса ИЛТ 72
3.2.15. Статистическая обработка полученных результатов 72
4. Результаты собственных исследований и их обсуждение 73
4.1. Определение видовой принадлежности и выделение изолятов вируса ИБК «Калужский» и «Таганрогский» из полевых проб 73
4.2. Изучение антигенных свойств выделенных изолятов вируса ИБК в реакции перекрестной нейтрализации 86
4.3. Изучение способности выделенных изолятов ИБК к репродукции в КЭ 89
4.4. Определение вирулентности выделенных изолятов вируса ИБК 91
т 4.5. Определение антигенной активности изолятов вируса ИБК 95
4.6. Индикация генома вируса ИЛТ с помощью амплификации фрагмента кДНК области генов ТК и ICP4 97
4.7. Секвенирование амплифицированных участков генов ICP4 и ТК вируса ИЛТ и анализ генетической вариабельности 105
4.8. Выделение вируса ИЛТ из полевых проб 109
4.9. Идентификация выделенных вирусов средствами электронной микроскопии, в реакциях нейтрализации, РДП и ИФА 114
5. Заключение 121
6. Выводы 125
7. Практические предложения 127
8. Список литературы 128
Приложения 151
- Классификация и структура возбудителя
- Диагностика инфекционного ларинготрахеита птиц
- Определение видовой принадлежности и выделение изолятов вируса ИБК «Калужский» и «Таганрогский» из полевых проб
- Идентификация выделенных вирусов средствами электронной микроскопии, в реакциях нейтрализации, РДП и ИФА
Введение к работе
Актуальность темы. В связи с постоянной интенсификацией промышленного птицеводства, выведением новых высокопродуктивных пород птицы, расширением международных экономических связей, включающих закупку племенной птицы за рубежом, на территории нашей страны регистрируются новые инфекционные болезни домашней птицы. Кроме того, появляются вариантные изоляты уже известных вирусов, способные вызывать заболевания даже у вакцинированной птицы. Поэтому постоянный мониторинг таких экономически значимых заболеваний, как инфекционный бронхит кур и инфекционный ларинготрахеит птиц, позволяет контролировать их распространение и обеспечивать эффективность профилактических мероприятий. Большое значение при этом имеют выделение изолятов вирусов и изучение их биологических свойств, в частности, для создания новых вакцин.
Инфекционный бронхит кур (ИБК) - высококонтагиозное заболевание, которое поражает птиц различного возраста в хозяйствах мясного и яичного направления и широко распространено во многих странах. Возбудителем заболевания является РНК-содержащий вирус ceu.Coronaviridae, рода Coronavirus. При развитии заболевания норажакмея респираторные органы, почки, а также рснродукіивньїе органы и кишечник кур. Экономические потери связаны со снижением прироста массы тела у цыплят-бройлеров, снижением яичной продуктивности, ухудшением качества яиц у несушек и родительского поголовья кур.
Вирус ИБК исключительно разнообразен и имеет большое количество серотипов и вариантов (Сюрин В.Н.,1998, Garcia М., 2001, Liu S., 2004, Picault J.P., 1986, Schikora В.М., 2003, Wang C.H., 2000, Zanella A., 2003). Причиной такого антигенного многообразия вируса ИБК является его чрезвычайно высокая изменчивость. Антигенные различия между вирусами возникают в результате спонтанных мутаций в определенных участках структурных генов, кодирующих иммунодоминантные области. Известно большое количество серотипов вируса (по разным данным от 20 до 30), при этом иммунитет, приобретенный к одному серотипу, не дает перекрестной защиты от заражения другим серотипом, что значительно осложняет профилактику ИБК.
—миотии |
С середины 1990-х гг. в ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» проводится обследование птицехозяйств, расположенных в различных регионах РФ на наличие антител к вирусу ИБК. Было показано широкое распространение заболевания на птицефабриках России.
В результате исследования патологических материалов, полученных из птицехозяйств в 1999-2004 гг., методами ПЦР и секвенирования было выявлено и типировано 57 изолятов вируса ИБК. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что спектр вирусов ИБК, циркулирующих в настоящее время в России, очень разнообразен. Наряду с изолятами группы Массачусетс, выявляемыми ранее (41%), и изолятами европейского происхождения (13%), широко распространены эндемичные для России вариантные изоляты (46%) (Борисов А.В , 2002).
Постоянное выявление и изучение новых изолятов вируса ИБК, а также широкий генетический спектр уже выявленных, указывают на необходимость изучения их иммуно-биологических свойств, получения на их основе живых и ннактивированных вакцин, а также мониторинга за данным заболеванием с использованием всех имеющихся диагностических методов исследований, что свидетельствует об актуальности работы.
Инфекционный ларинготрахеит птиц (ИЛТ) - контагиозная вирусная болезнь кур. индеек, цесарок, фазанов, характеризующаяся поражением слизистых оболочек верхних дыхательных путей и глаз. Заболевание вызывается вирусом ИЛТ, относящимся к сем. Herpesviridae, подсемейству a-Herpesviruses. В естественных условиях к инфекционному ларинготрахеиту восприимчивы куры всех возрастных гр\пп. Вирус поражает кур-несушек, материнское поголовье, бройлеров. В настоящее время ИЛТ встречается повсеместно во всех странах мира (Бабкин В.Ф., 1986, Timurkaan N.. 2003, Vander Кор М.,1993, Wieliczko А., 2004).
Источником возбудителя при инфекционном ларинготрахеите являются больные, переболевшие, а также птицы с бессимптомным течением ИЛТ. После лсреболевания ИЛТ у кур наблюдается длительное вирусносительство - до двух лет и более. После острой фазы инфекции может наступить латентный период с сохранением^ генетическвго- -материала вируса в ДНК нейроцитов ганглия тройничного Hepga,.gt Только в случае острой формы заболевания с высокой смертностью и оіхаркиваиием крови, ларинготрахеит может быть точно диагностирован по клиническим симптомам. В случае легкого течения заболевания, а также при смешанной инфекции требуется лабораторное подтверждение диагноза. Основными методами диагностики ИЛТ являются обнаружение внутриклеточных телец-включений, выделение вируса на развивающихся куриных эмбрионах (КЭ), и идентификация инфицирующего агента в серологических реакциях (РДП, РН, РИД, ИФА) или методами электронной микроскопии. Все эти методы обладают различной чувствительностью и требуют предварительного пассирования вируса на КЭ. В результате постановка диагноза занимает длительное время. Поэтому разработка экспресс-методов диагностики ИЛТ, таких как ПЦР, является актуальной проблемой. Цель и задачи исследования Основная цель данных исследований заключалась в разработке методов выделения и идентификации изолятов вирусов ИБК и ИЛТ, определении первичной сірукіурьі вариабельных фрагменти вирусных існомоіі, в изучении биолоїических свойств выделенных вирусов, таких как способность размножаться в чувствительных системах (куриных эмбрионах или культурах клеток), вирулентность и иммуногенность для восприимчивых животных, а также в совершенствовании методов диагностики ИЛТ. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: разработать комплексную методику выделения и идентификации изолятов вирусов ИБК и ИЛТ из различных вируссодержащих материалов; изучить биологические свойства изолятов вируса ИБК, выделенных из полевых образцов, для возможного использования их в составе инактивированной вакцины для профилактики ИБК в птицехозяйствах; оптимизировать условия постановки РДП для идентификации вируса ИЛТ; разработать метод индикации генома вируса ИЛТ в различных вируссодержащих материалах на основе ПЦР; 4 изучить биологические свойства изолятов вируса ИЛТ, выделенных в России, в сравнении с вакцинными отечественными и зарубежными штаммами вируса ИЛТ; провести анализ нуклеотидной последовательности некоторых участков генома изолятов вируса ИЛТ, выделенных в России, а также вакцинных отечественных и зарубежных штаммов вируса ИЛТ. Научная новизна исследования. Впервые определены нуклеотидные последовательности вариабельной области гена S1 изолятов вируса ИБК «Калужский» и «Таганрогский», выделенных во ВНИИЗЖ, и изучены их биологические свойства. Штаммы депонированы в коллекции ВГНКИ под номерами «Калужский №-121-ДЕП», «Таганрогский №-120 ДЕП». Разработан метод выявления генома вируса ИЛТ в различных вируссодержащих материалах на основе ПЦР. Впервые определена нуклеотидная последовательность участков генов ICP4 и ТК 18 изолятов и 9 вакцинных штаммов вируса ИЛТ. Создан банк данных нуклеотидных последовательностей участков генов ICP4 и ТК вируса ИЛТ. Практическая значимость исследования. Разработаны комплексные методы выделения и идентификации изолятов вирусов ИБК и ИЛТ, позволяющие выделять вирус из различных вируссодержащих материалов и оценивать его биологические свойства. С помощью разработанных методов было проанализировано 79 проб патматериала, поступивших на исследование из птицехозяйств различных регионов России в течение 1999-2004 гг. с подозрением на ИБК и 85 проб патматериала с подозрением на ИЛТ. В 41 пробе был выявлен вирус ИБК, в 20 -вирус ИЛТ. Разработан метод индикации генома вируса ИЛТ на основе ПЦР с праймерамн, ограничивающими области генов ICP4 и ТК, позволяющий выявлять геном возбудителя в различных вируссодержащих материалах в течение 4-6 часов без предварительного выделения вируса в куриных эмбрионах. С помощью 5 разработанного метода проведено исследование 18 изолятов вируса ИЛТ, выявленных в патмагериалах, постунавших на исследование из различных птицефабрик России в 1999-2004 гг., а также 4 отечественных и 5 зарубежных вакцинных штаммов. Методы выделения и идентификации изолятов вируса ИБК, выделения, титрования и идентификации вируса ИЛТ, индикации генома вируса ИЛТ с помощью полимеразной цепной реакции, одобрены ученым советом, утверждены директором ВНИИЗЖ и рекомендованы для использования в практике. Публикация научных исследований. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ. Апробация работы. Основные материалы диссертации были доложены и опубликованы в материалах IV и V Всероссийских научно-практических конференций «Генодиагностика инфекционных заболеваний», Москва 2002 и 2004 гг., Международной научной конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии животных» ВНИИЗЖ, г. Владимир (2003 г.), Международной научной конференции молодых ученых «Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных» ВНИИЗЖ, г. Владимир ( 2004 г.). Структура и объем работы. Диссертация изложена на 156 страницах компьютерного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы и приложения. Список литературы включает 203 источника. Работа иллюстрирована 12 рисунками и 15 таблицами. С использованием фингерпринтного анализа и трансляции in vitro вирусных РНК, а также благодаря определению полной нуклеотидной последовательности некоторых коронавирусов была построена генетическая карта геномной РНК. Порядок генов, кодирующих полимеразу, а также структурные белки S, М и N аналогичен у большинства коронавирусов, но по числу, порядку и свойствам дополнительных открытых рамок считывания, кодирующих неструктурные белки (NS) они значительно отличаются (121). Вирионы содержат три основных структурных белка S, N и М и минорный оболочечный белок sM или Е. Молекулы основного фосфопротеина N (50-80 кДа), взаимодействуя с геномной РНК, образуют протяженный нуклеокапсид со спиральной симметрией, диаметром 9-11 нм. Нуклеокапсид окружает липопротеиновая оболочка, которая формируется из шероховатого эндоплазматического ретикулума или аппарата Гольджи зараженных клеток. Гликопротеин М - это трансмембранный белок, довольно глубоко погруженный в оболочку. На наружной поверхности липидного бислоя оказывается лишь небольшой, гликозилированный N-концевой участок молекулы белка (69). Предполагают, что гликопротеин М способствует включению нуклеокапсида в оболочку вириона при почковании. Гликопротеин-предшественник S (180-200 кДа) является структурным белком пепломеров. Посттрансляционно он нарезается протеазами на 2 части: S1 и S2 гликопротеины. Небольшая его часть погружена в липидный бислой, а большая часть молекулы находится снаружи. Гликопротеин S1 содержит основные антигенные детерминанты, индуцирующие синтез серотипоспецифических и вируснейтрализующих антител, а также играет роль антирецептора, с помощью которого вирусная частица прикрепляется к рецепторам клетки и вызывает слияние мембран (58). Область, кодирующая полимеразу, консервативна у всех коронавирусов и содержит две большие, перекрывающиеся открытые рамки считывания ОРС 1а ОРС 1Ь. Было доказано, что в перекрывающейся области происходит сдвиг рамки трансляции за счет существования там определенных нуклеотидных последовательностей и третичной структуры РНК-«псевдонот» (61). Геном вируса ИБК является инфекционным. После проникновения в клетку происходит синтез РНК-зависимой-РНК-полимеразы, которая не присутствует в зрелых вирионах (57,166). При транскрипции геномной РНК этим ферментом образуется комплементарная минус-цепь РНК полной длины, которая имеет на 5-конце последовательность poly(U) (136,167). Минус-цепь РНК служит матрицей как для синтеза новых геномных РНК, так и пяти имеющих кэп, полиаденилированных субгеномных мРНК. Коронавирусы обладают некоторыми уникальными особенностями транскрипции РНК, состава белков и механизма сборки вирионов. Коронавирусы прикрепляются к рецепторам клеток-мишеней своими пепломерами. Точный механизм проникновения вирусной частицы в клетку хозяина не вполне ясен, но предполагают, что основным способом проникновения коронавирусов в клетку является адсорбционный эндоцитоз (105). При трансляции in vitro каждой из вирусспецифических мРНК синтезируется только один полипептид. Это отличает коронавирусы от других РНК-содержащих вирусов с позитивным геномом, таких как пикорна-и альфавирусы (137). мРНК А кодирует белок N, синтез которого происходит на полисомах в цитоплазматическом матриксе. Белок N фосфорилируется и связывается в цитоплазме с геномной РНК, образуя спиральный нуклеокапсид (56). мРНК С и Е кодируют гликопротеины М и S. Их синтез происходит на полисомах, прикрепленных к шероховатому эндоплазматическому ретикулуму (ШЭР). При трансляции гликопротеин S включается в мембрану шероховатого эндоплазматического ретикулума (ШЭР) и гликозилируется путем переноса олигосахаридов на аспарагиновые остатки растущей полипептидной цепи (65). В аппарате Гольджи или на плазматической мембране S расщепляется протеазами клетки-хозяина на две большие субъединицы S1 (90 кДа) и S2 (84 кДа) (58), что является необходимым условием для проявления инфекционности вируса (169 ). Было установлено, что гликопротеин S переносится на плазматическую мембрану и экспонируется на поверхности инфицированных клеток, что может делать клетки чувствительными к лизису под действием противовирусных антител и комплемента (67). Гликопротеин М также синтезируется на полисомах, связанных с мембранами, однако, по процессингу и типу включения он отличается от большинства других вирусных гликопротеинов (171). Была определена нуклеотидная последовательность кДНК, соответствующая 5 -концевому домену мРНК D (или мРНК 3) штамма Beaudette (55). Было установлено, что ген 3, считавшийся ранее неструктурным геном в геноме вируса ИБК, уникальная последовательность которого транслируется с мРНК D, кодирует последовательность минорного оболочечного белка sM (или Е). Вирионы коронавирусов образуются путем почкования от мембран ШЭР и аппарата Гольджи. Нити нуклеокапсидов выстраиваются в месте почкования на цитоплазматической поверхности этих мембран в упорядоченный ряд на участках, содержащих вирусные гликопротеины. На мембранах ШЭР или аппарата Гольджи белки клетки-хозяина исключаются из почкующихся вирионов и заменяются вирусными гликопротеинами (172). Почкующиеся вирионы, которые содержат собранный нуклеокапсид, проходят в полость ШЭР и аппарата Гольджи. Таким образом, внутри клетки могут образовываться зрелые вирионы, возможно, даже до того, как белок S перейдет на плазматическую мембрану и сделает клетку чувствительной к иммунному воздействию. Поэтому покрытые оболочкой вирусы этого типа почкуются в месте, которое не подвергается действию иммунной защиты хозяина. Возможно, именно этим объясняется персистенция коронавирусов в хозяине, обладающем иммунитетом (160). Вирионы некоторых вирусов могут выходить из клетки лишь при ее гибели, однако коронавирусы способны выходить также из интактных клеток, по-видимому, с помощью механизма клеточной секреции (121). Способность коронавирусов выходить из клетки без ее лизиса является важным фактором, обеспечивающим возможность умеренной (нецитопатической) инфекции. Представители рода Coronavirus разделяются на три серологические группы. У вирусов в пределах каждой группы существует антигенное родство, сходная организация генома и нуклеотидная гомология. Штаммы вируса ИБК отнесены к 3-ей серогруппе. Ларинготрахеит может быть точно диагностирован по клиническим симптомам только в случае острой формы заболевания с высокой смертностью и отхаркиванием крови. Однако сходные клинические симптомы и повреждения могут присутствовать и при других респираторных заболеваниях домашних птиц. Поэтому диагноз на ларинготрахеит ставится на основании обобщения эпизоотологических данных, клинических признаков и результатов лабораторных исследований. Лабораторная диагностика ИЛТ включает выделение вируса на развивающихся куриных эмбрионах или в культурах клеток куриных фибробластов, почек эмбрионов и цыплят, его идентификацию в реакции нейтрализации, реакции иммунодиффузии, полимеразной цепной реакции, постановку биопробы на чувствительных цыплятах, обнаружение специфических телец-включений, электронную микроскопию, выявление вирусного антигена реакциями иммунофлюоресценции, непрямой гемагглютинации, задержки гемагглютинации, нейтрализации вирусных гемагглютининов, встречным иммуноэлектрофорезом, иммуноферментным анализом, а также обнаружение специфических антител в РН, РДП, РИГА, РЗГА, ВИЭФ, РНВГ, ИФА (14,80). Выделение вируса на куриных эмбрионах является наиболее распространенным методом лабораторной диагностики инфекционного ларинготрахеита. Для заражения куриных эмбрионов используют трахеальный экссудат, гомогенаты конъюнктивы и слизистой оболочки трахеи больных и погибших кур. Для выделения вируса ИЛТ из патологического материала используют 9-10 дневные куриные эмбрионы (14,113). Заражение проводят в аллантоисную полость и на ХАО. Характерные поражения ХАО в виде мелко или крупноузелковых очагов некроза наблюдаются после инкубации эмбрионов в течение 72-96 часов. Гибель эмбрионов вызывают не все штаммы, иногда выявляют нарушения гемодинамики эмбрионов (31). Для выделения вируса ИЛТ используют также первичные культуры клеток фибробластов, печени и почек КЭ (18,23). Срок наступления ЦПД зависит от дозы вируса и числа пассажей. Кроме того, была установлена неодинаковая чувствительность различных клеточных культур к вирусу ИЛТ (13,18,23). Некоторые штаммы (ВНИИБП) вызывают латентную форму инфекции и имеют низкую степень репродукции в культуре ПКФ, возможно обуславливая сим биотическую форму взаимодействия с клеточной культурой (37). Только после 3 пассажей наблюдается ЦПД, которое проявляется в вакуолизации и округлении клеток, разрывах монослоя и отслоении его от стекла. Другие же штаммы (ЦНИИП) адаптируются к условиям культивирования с первого пассажа. Репродукция вируса при этом сопровождается деструкционными изменениями в ядре и цитоплазме клетки, приводя к образованию синцития и симпластов, а также отмечается образование внутриядерных телец-включений, мелкой зернистости и множественных вакуолей в цитоплазме клеток. Специфичность ЦПД вируса ИЛТ в культуре клеток подтверждается в РН, РДП, реакции иммунофлюоресценции. Реакцию нейтрализации используют для идентификации вируса ИЛТ и для обнаружения специфических противовирусных антител. Реакцию ставят на 3-8 дневных цыплятах с использованием нормальной и специфической гипериммунной сыворотки, а в качестве антигена -выделенного на КЭ вируса. Также РН проводят на первично трипсинизированной культуре клеток печени или почек КЭ, или на развивающихся КЭ. Гипериммунные сыворотки к вирусу ИЛТ получают путем иммунизации кроликов вируссодержащей жидкостью в разведениях 1:5 - 1:10, приготовленной из хориоаллантоисных оболочек КЭ, зараженных высоковирулентными штаммами вируса ИЛТ. Вируссодержащую жидкость вводят внутривенно в течение 3 недель по 3 раза в неделю: в первую неделю - по 2 мл, во вторую - по 3 мл, в третью - по 4 мл. Через 7 день после последнего введения антигена кроликов обескровливают (14). В РН можно также использовать сыворотки кур, переболевших ИЛТ, что применяется для ретроспективной диагностики ИЛТ. С этой целью исследуют парные сыворотки через 14-28 дней. Повышение титра антител к вирусу ИЛТ свидетельствует о наличие инфекции в хозяйстве, а сохранение или снижение уровня антител - о прошедшей инфекции (2,140). Вместе с тем, реакция нейтрализации имеет ряд недостатков - она требует сравнительно больших затрат рабочего времени и средств. Реакция иммунодиффузии используется как с целью выявления вируса ИЛТ, так и для определения специфических антител. РИД ставят по общепринятой методике на предметных стеклах или в чашках Петри. Чувствительность РИД зависит от примененяемого буфера, концентрации вирусного антигена и активности иммунной сыворотки. При экспериментальном заражении восприимчивых цыплят преципитирующие антитела появляются на седьмой день после заражения, максимальные титры обнаруживаются на 49 день (3,25 Ig) и сохраняются до 120 дней. К преимуществам данной реакции следует отнести экономичность, простоту ее постановки, быстроту учета результатов и высокую специфичность (45,86,114,140). К недостаткам РИД следует отнести ее низкую чувствительность. Для повышения чувствительности реакции ряд исследователей предлагают различные схемы получения специфического антигена, пригодного для РИД (40). При исследовании сывороток крови в РИД следует учитывать, что не все птицы иммунологически реагируют на заражение вирусом ИЛТ образованием преципитинов. В связи с этим рекомендуется исследовать как можно больше проб сывороток крови. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) является экспресс-методом диагностики, так как позволяет поставить диагноз в течение 6 часов с момента доставки патологического материала (21,93,191). С помощью РИФ вирус ИЛТ можно обнаружить в мазках-отпечатках из пораженного хорион-аллантоиса, культуры клеток фибробластов куриных эмбрионов, мазках со слизистой оболочки трахеи, а также конъюнктивы экспериментально зараженной и естественно больной птицы. Из гипериммунных сывороток крови кур и кроликов выделяют иммуноглобулины путем высаливания. Из полученных иммуноглобулинов готовят коньюгаты. Прямой и непрямой методы РИФ позволяют обнаружить антиген вируса ИЛТ в пораженных клетках через 18-24 часа после заражения культур тканей эмбрионов и цыплят. Антиген вируса ИЛТ в пораженных клетках обнаруживается сначала в перинуклеарной зоне цитоплазмы, а через 48-72 часа после инфицирования - в цитоплазме и ядре пораженных клеток. Обнаружение вирусного антигена в ядрах клеток указывает на их глубокое поражение и сравнительно длительное течение инфекционного процесса. Результат РИФ оценивают в крестах в зависимости от интенсивности свечения и количества флюоресцирующих клеток (181,191). Комплекс антиген-антитело хорошо виден на общем темном поле в виде ярких люминисцирующих конгломератов в мазках из хорион-аллантоисной оболочки зараженного эмбриона. Вирус ИЛТ репродуцируется в эпителиоцитах слизистой оболочки гортани, трахеи, конъюнктивы, вызывая острое воспаление этих оболочек с образованием внутриядерных телец-включений. Гистологические исследования выявляют увеличение ядер пораженных эпителиальных клеток, гиперхроматию ядерной оболочки. Тельца-включения имеют округлую форму (иногда форму диплококков), окрашиваются оксифильно и занимают 1/3-2/3 объема клеточного ядра (95), вокруг включения видна неокрашенная зона. Однако вероятность обнаружения внутриядерных телец-включений в патологическом материале существует только в начальной фазе болезни - между 2 и 7 днями. Goodwin MAet al. (93) проводили сравнение методов гистопатологии и прямой иммунофлюоресценции при диагностике ф ларинготрахеита. При исследовании 144 образцов патматериала, отобранного у птицы с респираторной клиникой в 48 случаях методом РИФ был выявлен вируса ИЛТ, гистопатологическими исследованиями тельца-включения были обнаружены в 46 пробах. Была показана большая чувствительность РИФ по сравнению с гистопатологическими исследованиями. Инфекционный бронхит кур наносит серьезный экономический ущерб птицеводческим хозяйствам. Основной причиной проявления заболевания у вакцинированных птиц считается появление изолятов вируса ИБК, антигенно отличающихся от используемых вакцинных штаммов (5,105). За период с 1999 -2004 гг. было проанализировано более 250 проб из 149 птицехозяйств. Причиной направления материалов на исследование в основном являлось наличие у птицы респираторных симптомов, снижение яйценоскости или проявление других симптомов заболевания, которые могут быть вызваны вирусом инфекционного бронхита кур. Для исследования в лабораторию направлялась живая птица с клиническими признаками, трупы погибших особей или отобранный в хозяйстве патматериал (трахеи, легкие, почки). В результате проведенных исследований в 111 хозяйствах был выявлен вирус ИБК, из них 31 птицефабрика имела яичное направление и 80 - бройлерное. По результатам секвенирования гена S1 было установлено, что в 57 случаях (18 птицехозяйств яичного направления, 39 -бройлерного) заболевание вызвали вирусы ИБК, не имеющие значительного сходства ни с одним из известных серотипов. Они были отнесены к группам вариантных изолятов. Таким образом, наши исследования показали, что вариантные изоляты выявляются как в хозяйствах яичного, так и мясного направления. Кроме того, наблюдались вспышки заболевания среди вакцинированной птицы, которые вызывались вариантными изолятами. Это свидетельствует о том, что применяемые вакцины не всегда обеспечивают надежную защиту против вариантных изолятов вируса ИБК. Эффективным подходом для профилактики и контроля ИБК считается получение на основе выявляемых изолятов инактивированных вакцин, обеспечивающих достаточно высокие уровни специфического иммунитета. Нам предстояло выявить из полученных ранее изолятов вируса ИБК те, которые обладали бы наиболее отличающимися биологическими и генетическими свойствами от вакцинных штаммов, и в дальнейшем рекомендовать их для использования при производстве инактивированных вакцин. Биологические свойства выделяемых изолятов, такие, как способность к репродукции в куриных эмбрионах, патогенность для КЭ и 30-суточных цыплят, иммуногенная активность, антигенная специфичность и степень нейтрализации специфической антисывороткой, отличны от хорошо изученных названных свойств у вакцинных штаммов, начиная с этапа выделения вируса. Поэтому перед нами стояла задача - разработать методику выделения, титрования и идентификации изолятов вируса ИБК, а также изучить биологические свойства выявленных изолятов. Для этого было необходимо решить ряд проблем: оценить соответствие видовой принадлежности выделенных изолятов вирусу ИБК методами секвенирования гипервариабельной области гена S1, электронной микроскопии и в реакции нейтрализации; подобрать подходящую систему для культивирования и титрования вируса ИБК; исключить контаминацию выделенных изолятов бактериальной и грибной микрофлорой, микоплазмами, а также исключить присутствие гемагглютинирующих антигенов; определить степень антигенного родства выявленных изолятов и референтных штаммов ИБК в реакции перекрестной нейтрализации; определить вирулентность и антигенную активность выделенных вирусов. В лаборатории молекулярной диагностики болезней птиц при исследовании полевых проб было выявлено 57 вариантных изолятов вируса ИБК. Некоторые из них имели гомологию с референтными штаммами, другие имели отличия по структуре гипервариабельного участка гена S1 более 25% от всех известных нам штаммов. В качестве претендентов на дальнейшие исследования нами были отобраны 10 изолятов. Однако при их выделении на КЭ мы столкнулись с рядом трудностей. Прежде всего, в 6 пробах патматериала присутствовал вакцинный штамм вируса ньюкаслской болезни (НБ), так как профилактику НБ и ИБК в птицехозяйствах проводят в одинаковом возрасте и практически повсеместно. Кроме того, пробы были нередко контаминированы микоплазмами (5 из 10). Нами были предприняты попытки освободиться от вируса НБ путем нейтрализации его гипериммунными сыворотками. Однако они не привели к успеху, и после 2-3 пассажей на КЭ гибель эмбрионов наступала от ньюкаслской болезни к 48 часам инкубации, а вирус ИБК накапливался в следовых количествах. Второй причиной неудач был тот факт, что в ряде случаев вариантные формы вируса присутствовали в пробах патматериала от вакцинированных против ИБК птиц и выявлялись одновременно с вакцинным вирусом. После ряда пассажей на эмбрионах вакцинный вирус накапливался в более высоких титрах по сравнению с вариантным, разделить их не удалось. В результате нам удалось получить лишь 2 изолята - выделенные из патматериала, поступившего с птицефабрики «Калужская» Калужской области, впоследствии названный «Калужский», и птицефабрики «Таганрогская» Ростовской области, названный «Таганрогский». На птицефабрике «Калужская», имеющей бройлерное направление, в течение последних лет периодически отмечались вспышки ИБК различной степени тяжести, несмотря на плановую вакцинацию. В пробах патматериала, поступавшего на исследование в различные периоды, был идентифицирован вирус ИБК, относящийся к серотипу Массачусетс (вакцинный штамм Н-120), а также вариантный изолят, имеющий отличия по данным секвенирования гена S1 от известных серотипов более, чем на 25%. Неэффективность профилактических мероприятий объяснялась, по-видимому, особыми серологическими свойствами циркулирующего изолята, который не нейтрализовался антителами, вырабатываемыми на применяемые вакцины из штамма Н-120. Зимой 1998-1999 года на птицефабрике «Калужская» имела место новая вспышка респираторного заболевания цыплят, у которых наблюдали затрудненное дыхание, кашель, хрипы, катаральные риниты. В хозяйстве проводится плановая вакцинация живой вакциной из штамма Н-120 (в возрасте 1 и 14 дней). В январе живые цыплята в возрасте 30 дней и патматериал от павшей птицы поступили на исследование во ВНИИЗЖ. При патологоанатомическом вскрытии поступившей на исследование больной птицы отмечались серозный ринит и трахеит, фибринозные пробки в области бифуркации трахеи, отек легких, помутнение воздухоносных мешков, нефрит. В 2001 г. на исследование поступил патологический материал от вынужденно убитых кур из птицефабрики яичного направления «Таганрогская» Ростовской области с признаками поражения органов яйцеобразования. В качестве патматериала были взяты трахея, легкие, почки и герминативные органы. Патматериал транспортировали на льду в стерильном физиологическом растворе, содержащем 10000 ЕД./мл пенициллина и 10000 мг/мл стрептомицина. Из образцов вируссодержащего материала готовили 10% суспензию на буфере ФБР, измельчая кусочки ткани ножницами, а затем растирая в ступке со стеклянным песком. Затем центрифугировали в течение 15 минут при 2000 об./мин. К надосадочной жидкости добавляли антибиотики (байтрил 100 ЕД, гентамицин 100 ЕД, амфотерицин 50 ЕД) и выдерживали 1,5-2 часа при 4С. Заражение куриных эмбрионов вирусом инфекционного бронхита проводили в аллантоисную полость. Для заражения отбирали 9-11 дневные развивающиеся СПФ-куриные эмбрионы. Скорлупу эмбрионов обрабатывали стерилизующей смесью, делали отверстие в области естественной пуги, через которое вводили иглу шприца на 1,5 см длины. Суспензию испытуемого материала инокулировали в объеме 0,2 мл в аллантоисную полость. Эмбрионы инкубировали при 37С, овоскопируя по 2 раза в день. Все эмбрионы, погибшие в течение первых 24 часов после заражения, отбраковывали (неспецифическая гибель). По истечении сроков инкубации (48-60 часов) эмбрионы охлаждали при 4С, вскрывали и собирали аллантоисную жидкость для проведения следующих пассажей и различных исследований. Результатом исследований полученных проб в ПЦР с праймерами на ген S1 был синтез специфического фрагмента длиной 571 п.н., что свидетельствовало о наличии генома вируса ИБК в вышеуказанных пробах. Электронно- микроскопическое исследование полученных вируссодержащих препаратов вируса ИЛТ проводили совместно с д.б.н. Пономаревым А.П., ведущим н. сотр. лаборатории болезней крупного рогатого скота. Для обнаружения вируса под электронным микроскопом осветленную фильтрованием вируссодержащую суспензию центрифугировали при 12000 g в течение 30 минут, осадок растворяли в воде в 1/30 от начального объема. Каплю полученного гомогената наносили на пленки и фиксировали несколькими каплями дистиллированной воды. Сетку накладывали на каплю суспензии и оставляли на 2 минуты, после чего излишки жидкости убирали фильтровальной бумагой. Добавляли каплю 4% фосфовольфрамовой кислоты (рН 6,4) и излишки удаляли через 3 минуты. Негативно-контрастированные препараты исследовали под электронным микроскопом JEM-100B при инструментальном увеличении в 20000-40000 раз. Морфологически вирион ИЛТ представляет собой нуклеокапсид в суперкапсидной оболочке. Размеры вирионов варьировали от 120 до 300 нм. На рис.12 представлена электронная микрофотография, полученная при исследовании очищенной и концентрированной суспензии ХАО СПФ КЭ, зараженных вакцинным штаммом «О» вируса ИЛТ. Инструментальное увеличение хЗОООО и трехкратное при получении фотографии. Видовую принадлежность выделенных изолятов вирусов ИЛТ определяли в реакции нейтрализации. РН проводили на КЭ с постоянной дозой сыворотки и разведением вируса. Использовали гипериммунные сыворотки кроликов, полученные по приведенной выше схеме, описанной в разделе 3.2.12. Титр сывороток в ИФА был не менее 1:12800. Эмбрионы заражали смесью вирус:сыворотка на ХАО, где специфические нейтрализующие антитела гипериммунной сыворотки препятствовали формированию бляшек вируса ИЛТ. Параллельно исследовали материал на контаминацию наиболее вероятными вирусами (вирус болезни Марека, ньюкаслской болезни, болезни Гамборо, инфекционного бронхита кур, оспы птиц, реовирусами птиц). Сыворотки инактивировали прогреванием при 55С в течение 30 минут, затем готовили смесь гипериммунных сывороток, содержащих антитела против перечисленных вирусов, каждая из которых имела индекс нейтрализации специфического вируса не менее 3. Полученную смесь разводили 1:10 и смешивали в равных объемах с последовательными десятикратными разведениями исследуемого антигена. Для разведения вируса и сывороток использовали 0,8% раствор NaCI. Инкубировали в течение 1 часа при 37С. В качестве контроля использовали смесь разведений вируса с нормальной сывороткой. Затем проводили заражение эмбрионов в объеме 0,2 мл. Для испытания каждого варианта смеси использовали не менее 4 эмбрионов. Инкубировали эмбрионы при 37С в течение 7 суток. Рассчитывали индекс нейтрализации При ИН 1, антител к исследуемому вирусу в сыворотке нет, если ИН 2 антитела достоверно есть. Все выделенные вирусы ИЛТ при исследовании препаратов вируса с гетерологичными сыворотками имели ИН 1, а при исследовании с гипериммунной специфической сывороткой ИН 2, что свидетельствует о том, что выделенный вирус действительно является вирусом ИЛТ. Также отсутствие контаминации исследуемых препаратов вируса ИЛТ другими вирусами устанавливали в реакции ПЦР. По данным литературы иммунологических различий среди штаммов щ вируса ИЛТ не обнаружено, хотя некоторые отклонения в способности нейтрализоваться гипериммунными сыворотками описаны у штаммов различной вирулентности (37, 86,100). Для изучения антигенной специфичности и степени нейтрализации специфической сывороткой проводили перекрестную реакцию нейтрализации некоторых штаммов вируса ИЛТ гомологичными и гетерологичными сыворотками. Использовали гипериммунные сыворотки кроликов, полученные на введение вакцинных препаратов из штаммов вируса ИЛТ «О» (вакцина пр-ва ВНИИЗЖ, генетическая группа 1), ВНИИБП (вакцина пр-ва ВНИИБП, генетическая группа 2), "Эеп/а Хвакцина пр-ва «Intervet», генетическая группа 2) по приведенной выше схеме, описанной в п. 3.2.12. Реакцию нейтрализации проводили с разведением вируса и постоянной дозой сыворотки. Титры антител в сыворотках, определенные в ИФА, составили не ниже 1:12800. В качестве чувствительных тест-объектов использовали КЭ 10-суточной инкубации при заражении на ХАО. Вакцинные препараты, имеющие титры 6,5, 6,5 и 6,25 lg ЭИД5о/ мл, соответственно, разводили с десятикратным шагом. Для разведения использовали ФБР. Полученные данные представлены в табл. 14. На основании данных табл.14 устанавливали отношения индексов нейтрализации и определяли степень антигенного родства между штаммами с помощью модифицированного метода Архетти-Хорствала. Степень антигенного родства составила «О» / «ВНИИБП» 78%, «О» / «Serva» - 74%, «ВНИИБП» / «Serva» - 80 %. Таким образом, изучение антигенных свойств вирусов, относящихся к разным генетическим группам, в реакции перекрестной нейтрализации не выявило существенных различий в нейтрализации их гомологичными и гетерологичными сыворотками. На основании вышеизложенного можно сделать вывод о серологической однородности исследованных вирусов ИЛТ. В традиционной схеме диагностики ИЛТ применяется реакция диффузионной преципитации с целью индикации вируса ИЛТ. К преимуществам данной реакции следует отнести экономичность, простоту ее постановки, быстроту учета результатов и высокую специфичность. Однако реакция обладает низкой чувствительностью - при исследовании полевых проб вирусный антиген ИЛТ обычно выявляется из гомогената инфицированных ХАО после проведения 2 и более пассажей на КЭ. Для повышения чувствительности реакции многие исследователи предлагают проводить концентрирование антигена (40).Классификация и структура возбудителя
Диагностика инфекционного ларинготрахеита птиц
Определение видовой принадлежности и выделение изолятов вируса ИБК «Калужский» и «Таганрогский» из полевых проб
Идентификация выделенных вирусов средствами электронной микроскопии, в реакциях нейтрализации, РДП и ИФА
Похожие диссертации на Выделение, идентификация и характеристика изолятов вирусов инфекционного бронхита кур и инфекционного ларинготрахеита птиц
![Идентификация, молекулярно-биологическая характеристика и анализ циркуляции ротавирусов разных G[P] типов](/i/i/4496/149155.png "Идентификация, молекулярно-биологическая характеристика и анализ циркуляции ротавирусов разных G[P] типов Федорова Оксана Федоровна")
![Идентификация, молекулярно-биологическая характеристика и анализ циркуляции ротавирусов разных G[P] типов](/i/i/4456/315898.png "Идентификация, молекулярно-биологическая характеристика и анализ циркуляции ротавирусов разных G[P] типов Фёдорова Оксана Фёдоровна")
