Введение к работе
Крымская-Конго геморрагическая лихорадка (ККГЛ) - природно-очаговая вирусная инфекция человека. Вирус ККГЛ вызывает тяжелое острое лихорадочное заболевание, сопровождающееся геморрагическим и интоксикационным синдромом. В природе постоянная циркуляция вируса поддерживается иксодовыми клещами и их прокормителями. Случаи заболевания ККГЛ регистрируются в странах Европы, Азии и Африки. В последние несколько лет наблюдалось значительное увеличение заболеваемости ККГЛ в южных регионах России, таких как Ростовская область, Волгоградская область, Ставропольский край и Республика Калмыкия (1999-2000 гг.).
Заражение человека происходит трансмиссивным путем при присасывании клеща. Кроме того больной человек в период выраженного геморрагического синдрома может быть источником заражения окружающих его лиц через кровь, то есть вирус может передаваться контактным путем.
Заболеваемость при ККГЛ носит спорадический характер, однако, в разные годы были отмечены внутрисемейные и внутрибольничные вспышки с высокой летальностью (до 50%). Такого рода заболевания требуют пристального внимания, поскольку можно ожидать по разным причинам появление новых эпидемически значимых вариантов возбудителя, тем более что для ККГЛ показан не только трансмиссивный путь передачи. Все это показьшает важность всестороннего изучения этого вируса.
По существующей классификации вирус ККГЛ относится к роду наировирусов семейства Bunyaviridae. Хотя для вирусов из разных родов этого семейства уже имеются полные нуклеотидные последовательности генома, представленного тремя сегментами, и изучена организация генома, а также хорошо охарактеризованы вирусные белки, очень мало известно о представителях рода наировирусов. На момент начала наших исследований данные по устройству и реализации генома наировирусов были немногочисленны и основывались в основном на изучении генома вируса Дугбе. Трудности в изучении вируса ККГЛ связаны с тем, что это наиболее опасный патоген для человека среди наировирусов (относится ко второму уровню биологической опасности в России и 4 уровню в других странах), и вакцина для защиты от этого возбудителя отсутствует. Кроме того, нет удобной и адекватной биологической модели для поддержания этого вируса в лабораторных условиях, а так же накопления достаточных количеств вирусного материала для изучения его молекулярно-биологических характеристик. В связи с этим, хотя в последнее время наблюдается значительный интерес к этому вирусу, до сих пор не определена полная нуклеотидная последовательность генома вируса ККГЛ и получены только предварительные данные о способах его реализации.
Цель и задачи работы. Целью данной работы было изучение основных молекулярно-биологических характеристик вируса ККГЛ и вирусспецифических белков, синтезирующихся при репродукции вируса ККГЛ.
Для этого необходимо было решить следующие задачи:
1. Определить нуклеотидную последовательность РНК S, М сегментов и фрагмента L сегмента прототипного центрально-азиатского штамма Ходжа вируса ККГЛ и определить потенциальные характеристики вирусспецифических белков.
2. Провести сравнение полных нуклеотидных последовательностей S и М сегментов и фрагментов L сегментов и выявить филогенетические взаимоотношения между штаммами вируса ККГЛ из разных регионов мира.
3. Подобрать оптимальные условия для адаптации вируса ККГЛ к культуре клеток Vero-Еб, получить вариант, адаптированный к этой культуре, и изучить его свойства.
4. На модели полученного адаптированного к клеткам варианта штамма Ходжа идентифицировать и охарактеризовать структурные и неструктурные белки вируса ККГЛ, синтезирующиеся в процессе инфекции в культуре клеток Vero-Еб.
Научная новизна.
В результате проведенных исследований впервые была определена полная нуклеотидная последовательность РНК S и М сегментов прототипного азиатского штамма Ходжа, выделенного в 1967 году в СССР. Впервые для вируса ККГЛ была определена нуклеотидная последовательность фрагмента РНК L сегмента для 4 штаммов, выделенных в разные годы и в разных регионах мира. На основании полных нуклеотидных последовательностей S и М сегментов, а также на основании части последовательности L сегмента были определены филогенетические отношения между штаммами вируса ККГЛ. Было показано, что филогенетические группы формируются соответственно географическому месту циркуляции вируса на основе данных для S и L сегментов. По данным для полных М сегментов штаммы вируса ККГЛ достоверно группируются в три кластера не зависимо от места, времени и источника выделения этих штаммов. Получены указания на возможность реассортации сегментов между природными штаммами вируса ККГЛ.
Впервые применен метод совместного культивирования инфицированных и неинфицированных клеток для адаптации вируса ККГЛ к культурам клеток. Впервые были идентифицированы и охарактеризованы структурные и неструктурные белки вируса ККГЛ. Научно-практическая значимость работы.
1. В данной работе была определена часть нуклеотидной последовательности L сегмента, что облегчит в дальнейшем расшифровку полной последовательности генома возбудителя такого тяжелого заболевания человека, как ККГЛ, и позволит провести функциональное картирование его генома,
2. Получен вариант вируса ККГЛ, адаптированный к культуре клеток, с более быстрым и высоким уровнем репродукции в клетках. Использование такого варианта позволит упростить наработку антигенного материала, удешевляет и облегчает приготовление диагностических наборов. Кроме этого, открываются новые возможности для получения вакцинных препаратов против вируса ККГЛ на культуральном субстрате.
3. Для пополнения коллекции в процессе работы были идентифицированы и закреплены в пассажах 6 новых штаммов вируса ККГЛ, выделенных из клещей, собранных во время вспышки в Ставропольском крае в 2000 г.
4. Был предложен метод по выявлению РНК вируса ККГЛ с помощью обратной транскрипции и полнмеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) на основе праймеров, подобранных к S и М сегментам. Схема метода позволяет исключить ложноположительные случаи выявления РНК и использовать этот метод как в диагностических целях, так и для молекулярно-эпидемиологических исследований.
