Идентификация, молекулярно-биологическая характеристика и анализ циркуляции ротавирусов разных G[P] типов Фёдорова Оксана Фёдоровна

Введение к работе

Актуальность проблемы. Ротавирусы (семейство Reovmdae, род Rotavirus) являются основным этиологическим агентом острого гастроэнтерита у детей первых лет жизни Анализ исследований, опубликованных в период с 1986 по 2000 годы показал, что каждый год в мире регистрируется 111 млн эпизодов ротавирусного гастроэнтерита, 25 млн визитов в клинику, 2 млн госпитализаций и 352000-592000 (в среднем 440 тыс) смертей среди детей в возрасте до 5 лет [Parashar, 2003], что определяет необходимость разработки ротавирусной вакцины и совершенствования эпиднадзора за инфекцией К настоящему времени в мире накоплена обширная информация об экстраординарном генетическом и антигенном многообразии ротавирусов. Среди ротавирусов человека группы А идентифицированы 10 G серотипов (детерминируются гликопротеином VP7), 9 «Р»-серотипов (детерминируются протеазочувствительным белком VP4) и 11 [Р]-генотипов. Гены, кодирующие VP4 и VP7, могут подвергаться независимому перераспределению, что увеличивает многообразие природных штаммов ротавируса, засчет возникновения различных комбинаций G и [Р] [Santos, 2005]

К настоящему времени показано существование географических различий в распространенности различных серотипов и генотипов ротавируса, установлен факт их временного перераспределения, зафиксировано появление большого количества нетипируемых штаммов и постоянно сообщается о находках новых, эпидемически значимых вариантов ротавируса [Gentsch, 2005].

В связи с этим для разработки универсальной вакцины и оценки эффективности уже разработанных вакцин необходимо знание антигенного (генетического) спектра ротавирусов, распространенных на той или иной территории, и проведение мониторинга за циркуляцией ротавирусов разных G[P] типов Такие исследования в мире носят широкомасштабный характер [Wood, 2005] Однако в России научные работы подобного плана не проводятся Ранее в Нижегородском НИИЭМ было проведено изучение генетических и антигенных вариантов РВ, доминировавших на Европейской территории России в 1984-1996 гг Были получены новые данные об особенностях многолетней циркуляции ротавирусов основных G серотипов и

4 прослежены последовательные сдвиги во времени от одного доминирующего варианта вируса к другому. В то же время исследований по изучению разнообразия [Р]-генотипов ротавируса, G[P] ассоциаций, их распределению и установлению особенностей смены [Р]-генотипов РВ, не проводилось

Цель исследования: оптимизация метода ОТ-ПЦР для [Р]-генотипирования ротавирусов, изучение временных особенностей циркуляции ротавирусов разных G[P] типов и их молекулярно-биологическая характеристика.

Задачи исследования:

1 Оптимизировать метод ОТ-ПЦР для выявления гена VP4 ротавирусов группы А и дать оценку его эффективности

2. Разработать праймеры для идентификации [Р]-генотипов и Р[8] субтипов ротавирусов.

3 Определить электрофоретипы РНК и G[P] типы ротавирусов, обнаруженных на территориях г Нижнего Новгорода и г. Дзержинска в период 1997-05 гг., рассчитать их относительное распределение.

4. Изучить особенности смены доминирования субтипов Р[8]-1 и Р[8]-2 в процессе многолетней циркуляции ротавирусов G1 Р[8] типа.

5 Дать сравнительную характеристику клинических проявлений инфекции, вызванной ротавирусами генотипов G1P[8]-1 и GlP[8]-2

6. Охарактеризовать молекулярно-биологические свойства ротавирусов, выделенных от новорожденных детей.

Научная новизна и практическая значимость работы: Оптимизирован метод ОТ-ПЦР для обнаружения РНК ротавирусов разных электрофоретипов, эффективный в отношении штаммов, актуальных для России, что может служить основой для создания диагностической амплификационной тест-системы.

Впервые определен спектр G[P] типов ротавируса, идентифицированных на двух территориях Нижегородской области в 1997-05 гг. Территории городов Нижний Новгород и Дзержинск являются единственными в Российской Федерации, для которых установлен антигенный профиль природных штаммов РВ, что может быть использовано для оценки эффективности применения разработанных в мире ротавирусньгх вакцин

Разработан способ субтитрования аллелей гена VP4 генотипа Р[8] с использованием ПЦР Научная новизна подтверждена патентом (Патент № 2264469, приоритет от 24 ноября 2003 года).

Разработана новая технология С[Р]-генотипирования ротавирусов с использованием ПЦР, включающая: набор оригинальных праймеров, совместимых для мультиплексной постановки, контрольную постановку и универсальную программу амплификации Рекомендована к утверждению расширенным заседанием Секции по эпидемиологии, инфекционным болезням и вирусологии Ученого совета МЗ РФ (Пр. № 168-уч. от 6 декабря 2004 года).

Впервые показаны связанные с субгенотипом Р[8] различия в выраженности ОРВИ при клинических проявлениях ротавирусной инфекции. Показано, что PB-GlP[8]-2 характеризуются слабой выраженностью или отсутствием симптомов поражений слизистых верхних дыхательных путей.

Выявлен и охарактеризован новый вариант ротавируса G9P[6]NSP4(A), выделенный от новорожденных с бессимптомной формой инфекции

Впервые определена первичная структура гена NSP4 трех российских изолятов ротавируса с генотипом G9P[6]NSP4(A) (DQ270101, DQ270102, DQ270103), что расширяет представления о вариабельности гена энтеротоксина NSP4 ротавируса в мире.

Внедрение результатов исследования в практику:

В процессе работы была установлена этиологическая роль РВ в возникновении 2454 эпизодов ОКИ. Результаты использованы в официальной статистике. При оперативном проведении исследований результаты использовались лечащим врачом для выбора адекватной стратегии лечения детей.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Оптимизированные и разработанные праймеры для обнаружения РНК ротавирусов группы A (Ro4-l, Ro4-2), для идентификации [Р]-генотипа (P[4]R, P[8]R) и субгенотипа Р[8] (R-P[8]-l, R-P[8]-2), обеспечивают генотипирование штаммов ротавируса, актуальных для территорий России

2. Спектр G[P] типов ротавирусов, циркулировавших среди детей на территории Нижегородской области в период 1997-05 гг, включает основные G1-4 серотипы и Р[4], Р[6], Р[8], Р[9] генотипы, представленные семью G[P] комбинациями, распределение которых изменяется во времени

3. Особенностью циркуляции ротавируса G1P[8] является постоянное доминирование, поддерживаемое сменой субтипа Р[8]-генотипа, сопровождающейся изменениями в клинических проявлениях инфекции

4. Ротавирус, обнаруженный у новорожденных детей с бессимптомной формой инфекции имеет генотип G9P[6]NSP4(A) и реорганизованный 11 -й геномный сегмент

Апробация работы: Основные положения диссертации доложены и обсуждены

на VII Нижегородской сессии молодых ученых (г Н Новгород, 2002 г ),

на заседании Нижегородского научного биохимического общества (г Н. Новгород, 2004 г);

на заседаниях Ученого Совета Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии имени академика И Н Блохиной и проблемных научно-практических семинарах института

Диссертация апробирована на межлабораторной конференции Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии 15 декабря 2005 г

Объем и структура диссертации:

Материалы диссертации изложены на 145 страницах машинописного текста Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и указателя литературы, включающего 192 источника литературы отечественных и зарубежных авторов Диссертация иллюстрирована 18 рисунками и 9 таблицами.

По результатам диссертации опубликовано 10 печатных работ

Работа выполнена в рамках научной тематики Нижегородского НИИЭМ им. академика ИН. Блохиной в качестве фрагмента № 034/087/007-002 01 к договору с МЗ РФ № 034/087/007 «Новые технологии в профилактике, диагностике и лечении инфекционных заболеваний и их использование в эпиднадзоре».

Похожие диссертации на Идентификация, молекулярно-биологическая характеристика и анализ циркуляции ротавирусов разных G[P] типов

Идентификация, молекулярно-биологическая характеристика и анализ циркуляции ротавирусов разных G[P] типовФедорова Оксана Федоровна

Выделение, идентификация и характеристика изолятов вирусов инфекционного бронхита кур и инфекционного ларинготрахеита птиц Батченко Галина Владимировна

Идентификация и характеристика нового фактора инициации митохондриальной трансляции дрожжей S.CerevisiaeКузьменко, Антон Викторович

Метил-ДНК связывающие белки с доменами "цинковые пальцы": молекулярно-генетическая характеристика и анализ биологических функций методами нокаутаПрохорчук, Егор Борисович

Молекулярно-генетический анализ и биологическая характеристика полевых изолятов вируса лейкоза птиц, циркулирующих на территории Российской ФедерацииПлотников Вадим Алексеевич

Выявление ротавирусов КРС группы А с помощью ПЦР и их характеристика на основе анализа геномаЧупин Сергей Александрович

Идентификация, выделение, физико-химическая характеристика и иммуноферментный анализ специфических альфа-2 глобулинов мозгаКоротеева, Елена Анатольевна

Идентификация функциональных типов растений степей Бурятии Белоусов Иван Владимирович

Интегрированный анализ различных типов данных постгеномных исследований для идентификации ключевых путей мультигенных заболеванийИшкин, Александр Александрович

Идентификация генетических маркеров, ассоциированных с предрасположенностью к сахарному диабету типа 1, на хромосомах 6 и 10 Серегин Юрий Александрович