Содержание к диссертации
Введение
Терапия и профилактика отравлений ФОТ 8
Биологический антидоты как средство профилактики и терапии отравлений ФОТ
Бутирилхолинэстераза человека 23
Биотехнологическое получение рекомбинантной бутирилхолинэстеразы человека
Материалы и методы 39
Реактивы и материалы 39
Бактериальные штаммы 40
Клеточные линии 40
Растворы и бактериальные среды 40
Антибиотики 41
Методы работы с нуклеиновыми кислотами 41
Методы работы с бактериями Escherichia coli 45
Методы работы с эукариотическими клетками линии СНО 46
Методы работы с белками 49
Методы работы с животными 56
Результаты и обсуждение 58
Создание эукариотической системы экспрессии человеческой 58
бутирилхолинэстразы
Разработка системы детекции и оценки продукции рекомбинантного белка 69
Характеристики рекомбинантной БуХЭ 74
Оптимизация фармакокинетических параметров рчБуХЭ химическим 77
полисиалированием in vitro
Исследование защитной эффективности модифицированной рчБуХЭ in vivo 87
Выводы 90
Список литературы
- Реактивы и материалы
- Клеточные линии
- Методы работы с эукариотическими клетками линии СНО
- Характеристики рекомбинантной БуХЭ
Введение к работе
Актуальность проблемы
В конце 1930-х гг. в качестве инсектицидов был синтезирован ряд фосфороргани- ческих токсинов (ФОТ). Доступность ряда ФОТ в странах с развивающейся аграрной экономикой приводит к частым случаям отравлений и летальных интоксикаций. По данным Всемирной организации здравоохранения бытовое летальное отравление ФОТ получает более 300 000 человек в год. Несмотря на то, что 185 государств в 1992 г. присоединились к Конвенции «О запрещении химического оружия», сохраняется угроза использования нервно-паралитических агентов и других ФОТ в ходе военных действий и террористических актов.
Методы медикаментозного лечения отравлений фосфорорганическими токсинами на настоящий момент обладают целым рядом побочных эффектов. Альтернативным подходом к терапии и профилактике отравлений ФОТ является использование биологических антидотов. В качестве таких антидотов могут выступать антитела и ферменты, которые изолируют и инактивируют высокотоксичные соединения до того, как те достигнут своей биологической мишени. Из всех потенциальный кандидатов на роль биологического антидота против ФОТ только бутирилхолинэстераза (БуХЭ, ЕС 3.1.1.8) плазмы крови человека в 2006 г. получила статус «New development drug» (Новый лекарственный препарат, подлежащий дальнейшей разработке - англ.) от Управления по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов США (FDA).
Обзор современных биотехнологических методов получения БуХЭ позволяет сделать следующие выводы.
-
Получение БуХЭ из плазмы крови человека (чБуХЭ) - дорогостоящий процесс, осложненный возможностью контаминации препарата патогенами из зараженной плазмы.
-
Попытки экспрессии рекомбинантной бутирилхолинэстеразы человека (рчБуХЭ) в клетках бактерий и дрожжей не привели к получению активного фермента;
-
Проект создания трансгенных животных в качестве источника рчБуХЭ закрыт в связи с нерентабельностью производства.
-
Несмотря на высокий уровень продукции активной рчБуХЭ в трансгенных растениях, применение этого препарата в качестве медикамента невозможно, так как на сегодняшний день FDA не одобрило использование трансгенных растений для получения препаратов рекомбинантных белков, пригодных для инъекции в кровь человека.
-
Из всех существующих на сегодняшний день систем экспрессии рчБуХЭ, только клетки линии CHO (Chinese hamster ovary cells - англ., клетки яичников китайского хомячка) полностью удовлетворяют требованиям FDA, однако низкий уровень продукции делает применение этой системы в промышленных масштабах нерентабельным.
Таким образом, на сегодняшний день не существует эффективной и экономически
выгодной системы экспрессии рчБуХЭ, пригодной для инъекции в кровь. Цель работы и основные задачи исследования
Цель работы состояла в создании эффективной системы экспрессии рекомби- нантной БуХЭ человека и исследовании функциональной активности полученного фермента в экспериментах in vitro и in vivo. Для ее достижения были поставлены следующие экспериментальные задачи:
-
-
создание эффективной эукариотической системы экспрессии функционально активной БуХЭ человека;
-
изучение физико-химических свойств рекомбинантной БуХЭ человека;
-
оптимизация фармакокинетических характеристик рекомбинантного фермента;
-
определение эффективности полученного препарата рчБуХЭ для профилактики отравлений ФОТ.
Научная новизна и практическая значимость работы
Для получения рекомбинантной БуХЭ человека была выбрана система экспрессии на основе клеток линии CHO, которая сертифицирована для синтеза медикаментозных препаратов на основе рекомбинантных белков. Ген БуХЭ был клонирован под контроль промотора фактора элонгации полипептидной цепи (EF-a1). После проведения стабильной трансфекции и оптимизации условий продукции на специализированных безбелковых ростовых средах удалось получить клон A3 продуцирующий до 30 мг рчБуХЭ на литр ростовой среды, что как минимум на порядок выше, чем в ранее разработанных системах. Для изменения олигомерного состава рекомбинантного фермента клон A3 был трансфицирован фрагментом ДНК, несущим ген обогащенного остатками пролина пептида PRAD под контролем промотора EF-al. В результате отбора был получен стабильный клеточный клон А3Н9, продуцирующий БуХЭ в форме димера и тетрамера. Опыты на мышах линии BALB/c показали, что фармако- кинетические параметры полученной рчБуХЭ не позволяют эффективно использовать рекомбинантный фермент для профилактики отравлений ФОТ.
Для радикального увеличения времени полувыведения препарата рчБуХЭ из крови была предложена химическая модификация гомополимерами N-ацетил- нейраминовой кислоты - сиалирование. В отличие от полимеров этиленгликоля, широко применяемых для модификаций рекомбинантных белков, гетеро- и гомопо- лимеры сиаловой кислоты являются биодеградируемыми молекулами, не токсичны и не накапливаются в тканях и внутренних органах. Таким образом, модификация полисиаловыми кислотами позволяет снизить риск возможных побочных действий рчБуХЭ, тем самым лучше вписываясь в концепцию биологического антидота. Применение комбинаторного подхода позволило определить оптимальные условия реакции химического полисилирования рчБуХЭ, при которых удалось добиться не менее 80% выхода реакции при относительно невысокой (не более 10%) потере удельной активности рекомбинантного фермента.
Полученный конъюгат рчБуХЭ с гомополимерами сиаловой кислоты (рчБуХЭ-
САО27) был подвергнут всестороннему анализу in vitro и in vivo. Установлено, что химическая модификация полисиалированием не влияет на олигомеризацию рчБу- ХЭ. Масс-спектрометрическое исследование конъюгата рчБуХЭ-САО27 позволило выявить по меньшей мере 6 потенциальных сайтов модификации рекомбинантного фермента. Сравнение кинетических констант (KM, k, Kss и b) гидролиза бутирилти- охолин иодида модифицированной и немодифицированной рекомбинантной рчБуХЭ и БуХЭ из плазмы крови человека показало, что полученные значения отличались от известных из литературы в пределах ошибки, что свидетельствует об интактно- сти активного центра фермента и его окружения. Фармакокинетические испытания in vivo на мышах линии BALB/c свидетельствуют о том, что в результате химического полисиалирования время полувыведения конъюгата рчБуХЭ-САО27 возросло в 5,5 раз по сравнению с немодифицированной рчБуХЭ и стало сопоставимо со временем полувыведения препарата нативной БуХЭ плазмы крови человека. Таким образом впервые успешно применен метод химического полисиалирования для модификации сложного глобулярного фермента.
Способность рчБуХЭ и рчБуХЭ-САО27 эффективно связывать агент VR in vitro стала основанием для проведения эксперимента на животных. В результате испытания in vivo на беспородных мышах доказано, что препарат рекомбинантной БуХЭ плазмы крови человека, модифицированный полимерами N-ацетилнейраминой кислоты при внутривенном введении в дозировке 21 мг/кг живого веса, обеспечивает профилактическую защиту от действия 4,2 ЛД50 агента VR, не вызывая долгосрочных изменений в поведенческой активности и физической выносливости подопытных животных.
Настоящая работа описывает метод получения конъюгата рекомбинантной бути- рилхолинэстеразы плазмы крови человека с гомополимерами N-ацетилнейраминовой кислоты, полностью удовлетворяющего современным требованиям к биологическому антидоту.
Публикация и апробация работы
По теме диссертации опубликовано 2 статьи и подана заявка на патент. Результаты диссертации были представлены на 4 международных конференциях: XX зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физико- химической биологии и биотехнологии» (2008, Москва); Русско-французской конференции «Химия в молекулярной биологии» (2011, Москва); XXIV зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (2012, Москва); Международной научной конференции «The 11th Meeting on Cholinesterases» (2012, Казань). Структура и объем работы
Диссертация состоит из Введения, трех глав - «Литературный обзор», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», Выводов, Списка литературы, включающего 129 работы, и Приложений. Работа изложена на 107 страницах, включая 41 рисунок и 15 таблиц.
Реактивы и материалы
Силы, обеспечивающие связывание биомолекул с константами диссоциации комплексов 10"10 - 10"12 М, имеют одинаковую природу. Действительно, в образовании высокоаффинных комплексов ДНК-белок, гормон-рецептор, антиген-антитело, аналог переходного состояния ферментативной реакции-фермент участвуют водородные связи, Ван-дер-Ваальсовы, гидрофобные взаимодействия, ионные контакты. Согласно концепции Дженкса [53], взаимодействие фермент-аналог переходного состояния реакции можно имитировать связыванием антиген-антитело. Как отмечалось выше, идея Дженкса не получила в 1970-е гг. практически никакого подтверждения, так как требовала для своей практической реализации выделения «гомогенного по идентичным каталитическим центрам» препарата абзима, т.е. получения моноклональных антител.
Первый значительный успех в получении абзимов был достигнут Коэном и коллегами [54]. Полученные результаты свидетельствовали о катализе реакции в присутствии антител. Скорость процесса однако была низкой (v= 1.4-10"9 моль/мин.), что авторы объяснили медленной диссоциацией продуктов реакции (Кт=\\0 7 М). В 1988 г. группой исследователей Шульца и Лернера было получено антитело 50D8, гидролизующее карбоксиэфиры с ускорением в миллион раз (ккат=20 с1, Кт=1.5 мМ). Данное антитело также было получено на фосфонатный аналог переходного состояния реакции. Низкая величина связывания абзима с субстратом (Кт=1.5 мМ) и высокая - с аналогом переходного состояния реакции (К(=50 нМ) свидетельствует о гораздо более эффективной стабилизации переходного состояния, чем основного состояния реакции [55,56].
Метод иммунизации аналогом переходного состояния реакции оказался пригоден не только для стереоспецифичного катализа, но и для бимолекулярных реакций. Недавно был получен ряд антител, включая каталитическое антитело А. 17 и ряд его мутантов, способных эффективно связывать и превращать некоторые ФОТ и их аналоги [57,58]. Использование необратимых ингибиторов сериновых гидролаз, таких как фосфонаты, являющихся аналогами ФОТ по механизму действия, позволяет проводить селекцию по способности активных биокатализаторов образовывать с ними ковалентные комплексы.
Ранее в Лаборатории Биокатализа Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (ИБХ) методом фагового дисплея был осуществлен отбор на связывание с фосфонатом X антител из полусинтетической библиотеки сегментов вариабельных фрагментов генов иммуноглобулинов человека Griffin. 1 (MRC, Center for proteing engineering, Великобритания). Для проведения химической селекции и скрининга были использованы п-нитрофенил 8-метил-8-азабицикло[3.2.1]октан фенилфосфонат (X) и его биотинилированное производное (Bt-X) (Рис. 10V Кинетические характеристики реакции взаимодействия с фосфонатом X для всех отобранных реакционных одноцепочечных антител варьировались в очень узком диапазоне и наиболее активное одноцепочечное антитело А. 17 обладало реакционной способностью, сравнимой с таковой для природных сериновых гидролаз. Структурный анализ А. 17 показал сходство топологии активного центра абзима с активными центрами БуХЭ, АцХЭ (рис. 11)
Сравнение строения карманов каталитических центров эстеролитических антител ТЕРС-13, 49G7, 33F122, ацетил- и бутирилхолинэстеразы с каталитическим антителом А. 17: (А); Структура активного центра антитела А.17; (Б) Структура активного центра антитела А.17 в комплексе с фосфонатом; зеленой сферой отмечен ион СГ, присутствие которого характерно для катализа фосфоната абзимом А. 17 (В) [57]. Возможность использования антител в качестве гидролизующих ФОТ энзимов активно обсуждается в научном сообществе. Утверждается, что антитела не могут обеспечить правильного расположения аминокислотных остатков, необходимых для катализа, а также не обладают достаточной подвижностью для реализации катализа. Однако, в работе [57] авторы доказали возможность комбинирования иммунизации аналогом переходного состояния реакции и отбором на ковалентный катализ для получения каталических антител - абзимов. Отбор по способности к ковалентному взаимодействию имеет ряд преимуществ и позволяет применять жесткие условия селекции. Более того, условия реакции и выбор реагента могут изменяться для достижения кинетической или термодинамической селективности. Существует большое число ингибиторов сериновых гидролаз, образующих стабильные ковалентные комплексы по типу ацил-фермент. Одним из хорошо изученных необратимых ингибиторов сериновых гидролаз является диизопропилфторфосфат (ДФФ). Пептидил фосфонаты и фтор фосфонаты являются производными ДФФ и интенсивно изучаются. Образуя ковалентную связь ингибитор-фермент, фосфонаты имитируют стабильное переходное состояние реакции.
Тем не менее, эффективный катализ антителами реакций, проходящих через образование высокоэнергетических переходных состояний и достигаемый ферментами с помощью сложного комплекса механизмов, в настоящий момент не реализован.
Бутирилхолинэстераза человека (БуХЭ, ЕС 3.1.1.8) - сериновая гидролаза, обнаруживаемая практически во всех тканях млекопитающих, в частности в тканях легких, кишечника, печени и в сыворотке крови [59]. Физиологическая функция БуХЭ не выявлена, но считается, что она играет важную роль в поддержании и контролировании активности нейтротрансмиттеров ацетилхолина в центральной нервной системе и нервно-мышечных окончаниях [60].
Бутирилхолинэстераза и ее мутанты способны гидролизовать разнообразные сложные эфиры, в том числе бутирилтиохолин, бутирилхолин, проприонилхолин, ацетилтиохолин, ацетилхолин, ацетил-р-метилтиохолин, бензоилтиохолин, бензоилхолин, сукцинилтиохолин, сукцинилхолин, 2-бензамин, героин, аспирин, кокаин, прокаин, хлорпрокаин, тетракаин и др. [61]. Обнаружена высокая реакционная способность БуХЭ стехиометрически связывать разнообразные токсины, ингибирующие ацетилхолинэстеразу. В частности, БуХЭ способна взаимодействовать с такими фосфорорганическими токсинами как зарин, зоман, агентами VX и VR и некоторыми пестицидами. Эти данные были получены в экспериментах на грызунах [62] и приматах [63]; при внутривенном или внутримышечном введении препарата очищенной БуХЭ из сыворотки крови человека у животных обнаруживалась длительная устойчивость к действию нейропаралитических газов [64].
Сыворотка крови человека содержит 5 мг БуХЭ на литр крови и практически не содержит АцХЭ. Фракция эритроцитов, составляющая 40% от объема крови, содержит 0,5 мг АцХЭ на литр. Таким образом, содержание АцХЭ во всей крови человека приблизительно равно 2,5-3 нМ, а содержание БуХЭ - 34-50 нМ, превышая содержание АцХЭ более, чем в 10 раз [65], что делает БуХЭ главным кандидатом на роль естественного стехиометрического биологического антидота.
Клеточные линии
Определение содержания активной формы фермента человеческой бутирил-холинэстеразы в культуральной жидкости методом Элмана (G.L.EUman) [104]. 50 мкл культуральной жидкости смешивали со 100 мкл стерильного lxPBS, 100 мкл полученного раствора переносили в лунку 96-луночного планшета. В качестве калибровки использовали бутирилхолинэстрезу из плазмы крови человека (Sigma, США). Перед началом измерения в лунки с образцами и калибровкой наносили 100 мкл раствора 50 мкМ дитионитробензойной кислоты и 100 мкМ бутирилтиохолин йодида в lxPBS. Измерения проводили на приборе TECAN GENios при длине волны 405 нм.
Выделение рекомбинантной БуХЭ человека из ростовой среды
Ростовую среду от клеток линии СНО центрифугировали при 800 g в течение 5 мин для удаления клеток и далее при 3500 g в течение 15 мин для удаления клеточного дебриса. Супернатант фильтровали через мембраны Millipore HPWH с диаметром пор 0,22 мкм для удаления остатков примесей. Далее очищенный супернатант три раза концентрировали на мембранах Pellicon PLCTK30 (Millipore, США) с последующим разведением буфером нанесения (50 мМ калий-фосфатный буфер рН 7.2, 1 мМ ЭДТА). Полученный концентрат среды наносили на афинную смолу Procainamide-Sepharose 4FF (GE Healthcare, США) в режиме рециркуляции на скорости 0,5 мл/мин в течении ночи при +4С. Рекомбинантную БуХЭ элюировали со смолы градиентом от 0 до 500 мМ NaCl 15 объемами колонки при скорости потока 0,5 мл/мин. Полученную фракцию белка концентрировали на мембранах Centricon 10 (Millipore, США) после чего дополнительно очищали методом гель-фильтрации с использованием колонки Superdex200 (GE Healthcare) или методом ионообменной хроматографии с использованием колонки monoQ (GE Healthcare).
Электрофоретическое разделения белков в неденатурирующих условиях в ПААГ
Электрофоретическое разделение белков проводили по стандартной методике Laemmli. Для приготовления геля использовали водный стоковый раствор с соотношением акриламида:М,г ,1чГ,г\[ -метилен-бисакриламида 29:1. 4%-ный концентрирующий (верхний) гель готовили на буфере 0.125М Tris-HCl, рН 6,9. 8%-ный разделяющий (нижний) гель готовили на буфере 0.125М Tris-HCl, рН 8.8. Электрофоретическое разделение проводили в буфере: 50мМ глицин, 5мМ Tris-HCl, рН 8.0. Пробы наносили в буфере нанесения: 10% глицерин, 0,2М Tris-HCl, рН=7,5. Электрофорез в концентрирующем геле проводили при силе тока 8-10 мА на 1 пластину геля, а в разделяющем геле при 15-20 мА. Разделяющий гель использовали для дальнейшей работы.
Определение содержания изоформ БуХЭ методом M.J.Karnovski и L.Roots [105] Электрофоретическое разделение белков в неденатурирующих условиях условиях проводили по стандартной методике. Пробы наносили в буфере нанесения: 10%-ный глицерин, 0.2 М Трис-HCl, рН 7.5. Электрофорез в концентрирующем геле проводили при силе тока 8-10 мА на 1 пластину геля, а в разделяющем геле при 15-20 мА. По окончании электрофоретического разделения белков в неденатурирующем ПААГ пластина с гелем переносилась в раствор, содержащий 125 мМ NaOH, 125 мМ малеиновой кислоты, 11.6 мМ цитрата натрия, ЮмМ C11SO4, 550 мкМ гексацианоферрата(Ш) калия и 2-мМ бутирилтиохолин йодида. Гель инкубировали в растворе в течение 3-8 ч при комнатной температуре на орбитальном шейкере.
Определение кинетических констант рекомбинантной БуХЭ методом Элмана
Для получения кинетических констант чБуХЭ, рхБуХЭ или модифицированной рхБуХЭ известное количество фермента (3-10 мкМ) вносили в раствор, содержащий 1 мМ дитионитробензойную кислоту (DTNB) в 0.1 М калий-фосфатном буфере рН 7.2, концентрация бутирилтиохолин йодида (ВТС) варьировалась от 10 мкМ до 1000 мкМ. Для измерений использовали прибор CarryBio 50 (Varian, США). Полученные данные анализировали в программе SigmaPlot (ver. 11.0, SYSTAT Software). Количество активных центров БуХЭ определяли титроваванием с диизопропилфторфосфатом (ДФФ) по стандартной методике Элмана.
Для определения бимолекулярных констант ингибирования образцы рхБуХЭ и модифицированной рхБуХЭ прединкубировали с агентом VR в течение 1 мин в 0,1 М фосфатном буфере (рН = 7.4) при 25С, после чего проводили исследования по стандартной методике Элмана с 1 мМ ВТС и 0,5 мМ DTNB в качестве субстрата для определения остаточной активности. Бимолекулярные константы ингибирования расчитывали по уравнению: к t х СШ(АА,\5), где t - время ингибирования, мин; С - концентрация ингибитора, М; ААо -скорость гидролиза ВТС без ингибитора; ААІ - скорость гидролиза ВТС с ингибитором. Электрофоретическое разделение белков в денатурирующих условиях в ПААГ
Электрофоретическое разделение белков проводили по стандартной методике Laemmli. Для приготовления геля использовали водный стоковый раствор с соотношением акриламида:М, 1,г [ ,]Ч -метилен-бисакриламида 29:1. 5%-ный концентрирующий (верхний) гель готовили на буфере 0.1% ДСН, 0.125 М Tris-HCl, рН 6.8. Разделяющий (нижний) гель готовили на буфере 0.1% ДСН, 0.375 М Tris-HCl, рН 8.9; процентное содержание акриламида подбирали в зависимости от размера разделяемых белков (10-18%). Электрофоретическое разделение проводили в буфере: 50 мМ глицин, 0,02% ДСН, 5мМ Tris-HCl (рН 8.3). Пробы наносили в буфере нанесения: 100 мМ Р-меркаптоэтанол, 1% ДСН, 25 мМ Tris-HCl (рН 6.8), 2 мМ EDTA (рН 8.0), 5% глицерин, 0.125 мг/мл бромфеноловый синий, 4 М мочевина. Пробы перед нанесением прогревали 5 мин при 97С. Электрофорез в концентрирующем геле проводили при силе тока 8-10 мА на 1 пластину геля, а в разделяющем геле при 15-20 мА. Разделяющий гель использовали для дальнейшей работы.
Окрашивание ПААГ Кумасси синим R-250 с усилением контраста солью меди
Разделяющий гель 5 мин инкубировали в горячем растворе, содержащем 10% этанола и 10% уксусной кислоты. Далее на 10 мин его помещали в горячий раствор следующего состава: 15% этанола, 25%) уксусной кислоты, 0.3 г/л красителя Кумасси синий R-250 и 0.45 г/л пятиводного сульфата меди. Затем гель многократно отмывали в горячем растворе, содержащем 10% этилового спирта и 10% уксусной кислоты до полного исчезновения фонового окрашивания.
Методы работы с эукариотическими клетками линии СНО
Анализ олигомерного состава продуцируемой клоном A3 рБуХЭ по методу Карновского (Рис. 22) показал, что в основном рБуХЭ представлена в форме мономера, в то время как продукция тетрамера не велика. С фармакологической точки зрения представляет интерес именно тетрамер БуХЭ, поскольку время полувыведения тетрамера из организма составляет 3-4 дня, а мономера - несколько часов [63]. Ранее было показано, что при коэкспрессии БуХЭ и пептида PRAD - домена коллагеноподобного белка ColQ - количество тетрамеризованного продукта увеличивается [120]. Кроме этого, есть данные, что добавление в ростовую среду химически синтезированного пептида, входящего в состав БуХЭ, также способствует тетрамеризации рекомбинантного белка [68]. Пептиды PRAD и пролинбогатый пептид БуХЭ очень похожи по структуре и следовательно могут обладать близкими свойствами. Однако синтез пептидов, содержащих несколько пролинов подряд, осложнен, имеет невысокий выход и поэтому невыгоден в условиях биотехнологического производства. В связи с этим в работе было решено использовать коэкспрессию БуХЭ и пептида PRAD под контролем различных промоторов.
Культуральная среда клона A3 (1); образец плазмы крови человека (2); образец очищенной бутирилхолиэстеразы плазмы крови человека (3); Т - тетрамер, А - ковалентный димер сывороточного альбумина и мономера БуХЭ, Д- димер, М - мономер Создание экспрессионных конструкций пептида PRAD Исходная экспрессионная конструкция pRC/RSV-rQ45 была любезно предоставлена Оксаной Локридж [120].
Для создания конструкции pcDNA/CMV/PRAD плазмида pRc/RSV-rQ45 [120], содержащая последовательность, кодирующую пептид PRAD и FLAG-эпитоп, обрабатывалась эндонуклеазами рестрикции HindHI и Xhol. Фрагмент длиной 252 п.н. был очищен методом ЭФ в 10%-ном ПААГ с последующей электроэлюцией и лигирован в вектор pcDNA3.1/Hygro соответственно рестрицированный и дефосфорилированный. (Рис. 23. А)
Для создания конструкции pcDNA/EF/PRAD плазмида pBudCE/EF, содержащая EF-промотор, обрабатывалась эндонуклеазой рестрикции Bglll. Рестрицированную ДНК достраивали с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I и далее обрабатывали реакционную смесь эндонуклеазой рестрикции Nhel. Фрагмент, длиной 1223 п.н., был очищен методом ЭФ в 1%-ном агарозном геле с последующей электроэлюцией. ДНК плазмиды pcDNA/CMV/PRAD, обрабатывали эндонуклеазой рестрикции HindHI, достраивали с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I и далее обрабатывали реакционную смесь эндонуклеазой рестрикции Spel. Полученный в результате вектор был очищен, как описано выше, дефосфорилирован и лигирован с полученным ранее фрагментом ДНК, соответствующем EF-промотору (рис. 23. Б).
Электрокомпетентные клетки E.coli штамма DH5a или XL2-Blue трансформировали лигазными смесями. Первичный скрининг клонов проводили при помощи ПЦР с колоний. Плазмиды pcDNA/CMV/PRAD и pcDNA/EF/PRAD, выделенные из позитивных клонов, дополнительно характеризовали методом рестриктного анализа (рис. 24V Корректность сборки экспрессионных конструкций и векторов проверяли секвенированием по Сэнгеру.
Экспрессионные конструкции pcDNA/CMV/PRAD и pcDNA/EF/PRAD, несущие PRAD под контролем EF- или CMV-промотора, трансфицировали методом липофекции в клетки клона A3. Через 72 ч после проведения трансфекции количество тетрамерной формы рчБуХЭ в среде контролировали электрофоретически по методу Карновского. По результатам проведенного анализа (рис. 25) были выбраны клетки клона A3, трансфицированные плазмидой pcDNA/EF/PRAD. Использование EF-промотора в данном случае позволяет получать клетки, производящие большее количество тетрамерной формы рчБуХЭ в ростовую среду. 12 3 4 5 6 Ь
Культуральная среда клона A3 (1); культуральная среда клона A3 после временной трансфекции конструкцией pcDNA/CMV/PRAD (2); культуральная среда клона A3 после временной трансфекции конструкцией pcDNA/EF/PRAD (3); образец плазмы крови человека (4); образец коммерчески доступной бутирилхолинэстеразы плазмы крови человека (Sigma, США) (5); образец очищенной бутирилхолиэстеразы плазмы крови человека (б); Т - тетрамер, А - ковалентный димер сывороточного альбумина и мономера БуХЭ, Д- димер, М - мономер
Экспрессионную конструкцию pcDNA/EF/PRAD линеаризовали с помощью эндонуклеазы рестрикции Bglll и проводили трансфекцию методом липофекции в клетки клона A3 для получения стабильно продуцирующих клонов. Селекцию проводили добавлением в ростовую среду 1.5 мг/мл гигромицина Б и 600 мкг/мл зеоцина. После селекции и анализа, клетки рассевали на 96-лучные планшеты для получения моноклонов. Продукцию изоформ рчБуХЭ моноклонами определяли по методу Карновского. По результатам тестирования был отобран клон АЗН9 (рис. 26V После оптимизации условий экспрессии в ростовой среде ProCH04 (Lonza) по ранее описанной схеме удалось получить стабильно продуцирующий клон АЗН9, характерной особенностью которого является продукция тетрамерной и димерной формы рчБуХЭ при полной отсутствии продукции мономера.
Характеристики рекомбинантной БуХЭ
Характеристики препарата рчБуХЭ-СА027 in vitro и in vivo Полученный конъюгат рчБуХЭ-СА027 был подвергнут всестороннему анализу. Данные электрофоретического анализа (рис. 37), свидетельствуют о изменении молекулярной массы комплекса минимум на 20 кДа. При электрофоретическом разделении продуктов реакции химического сиалирования рчБуХЭ на 10% ПААГ наблюдалось возникновение полос (рис. 37. 2). начинающихся от основной полосы белка и заканчивающихся на границе концентрирующего и разделяющего гелей, что также свидетельствует о прохождении реакции. —120 кДа
Анализ препарата рчБуХЭ-СА027 по методике Карновского не выявил изменений олигомерного состава модифицированного рекомбинантного фермента (Рис. 28). Рекомбинантная БуХЭ человека
Анализ резорцинолом полученного рчБуХЭ-СА027 выявил, что в результате химической модификации полученный конъюгат содержал в среднем 6 молекул полисиаловой кислоты на каждый мономер рекомбинантного фермента. Эти данные подтверждаются результатами масс-спектрометрического исследования (рис. 39). которым удалось выявить шесть фрагментов рчБуХЭ, подвергнувшихся модификации: 45-51,453-499, 454-476, 514-544, 545-568 и 550-576 (табл. 1П. 1500 1S50 1600 1650 1700 1750 m/z
Масс-спектрометрический анализ химической модификации полисиаловыми кислотами. рчБуХЭ и рчБуХЭ-СА027 были обработаны а(2- 3,6,8,9) нейрамидазой и ацилированы йодацетамидом. Полученные смеси были очищены методом белкового ПААГ. Полосы белка, соответвующие десиалированной БуХЭ далее элюированы из геля и подвергнуты трипсинолизу. Полученные пептидные смеси изучали на масс-спектрографе с ионизацией электроспреем. Исследование выполнено на базе Института биохимической медицины РАМН
На поверхности каждого мономера чБуХЭ имеется 23 остатка лизина, некоторые из них расположены в непосредственной близости от активного центра фермента. Модификация стерически объемными полимерами полисиаловой кислоты могла осложнить доступ субстрата в активный центр рчБуХЭ, изменить кинетические параметры фермента. Определение кинетических параметров очищенного препарата рчБуХЭ и конъюгата рчБуХЭ-СА027 проводили в диапазоне концентраций субстрата от 10 мкМ до 1000 мкМ при концентрации фермента 5 нМ (табл. 12). На основании этих данных были рассчитаны индивидуальные кинетические параметры реакции гидролиза. Сравнение кинетических констант модифицированной и не модифицированной рекомбинантной БуХЭ и БуХЭ из плазмы крови человека показало, что в пределах ошибки расчетов Км одинаковы и составляют 28±2 мкМ, 25±1 мкМ и 23±2 мкМ [96] соответственно, а константы кг (830+20 с , 830+10 с"1 и 665+30 с1 [96] соответственно) лишь незначительно различаются, что, по-видимому, связано с различными способами определения концентрация активных центров изучаемых ферментов. Для определения эффекта полисиалирования на фармакокинетические параметры рчБуХЭ-СА027 были проведены испытания на животных. Самцы мышей Balb/c весом 25-30 г были разделены на две группы по 10 животных в каждой. Каждой группе внутривенно вводили препараты рчБуХЭ или рчБуХЭ-СА027 в количестве 100 ед. акт. на животное быстрой инъекцией в хвостовую вену. После введения препарата 10 мкл крови отбирали из глазного синуса в разные временные промежутки в течение пяти дней. Образцы крови разводили в PBS, полученный раствор использовали для определения остаточной активности БуХЭ. По полученным данным была построена фармакокинетическая кривая (рис. 40). по которой, исходя из двух-камерной фармакокинетической модели, были рассчитаны среднее время удержания, время полураспределения и полувыведения (табл. 13).
Полученные данные свидетельствуют о том, что в результате химического полисиалирования время полувыведения рчБуХЭ-СА027 по сравнению с немодифицированной рчБуХЭ возросло в 6 раз и составило 1000±140 мин и 180±30 мин соответственно. Таким образом, можно сделать следующие выводы: химическое полисиалирование не влияет на олигомерный состав рчБуХЭ и не изменяет кинетические параметры рчБуХЭ; в результате химического полисиалирования время полувыведения рчБуХЭ-СА027 увеличилось в 6 раз по сравнению с модифицированным рекомбинантным ферментом и стало сопоставимо с временем полувыведения БуХЭ плазмы крови человека. Исследование защитной эффективности модифицированной рчБуХЭ in vivo
Для определения защитной эффективности конъюгата рчБуХЭ-СА027 на первом этапе эксперимента были определены бимолекулярные константы ингибирования модифицированного и не модифицированного фермента агентом VR (рис. 1. Н). Полученные данные (табл. 14) свидетельствуют, во-первых, о способности чБуХЭ и рчБуХЭ эффективно связывать агент VR и, во-вторых, о том, что химическое полисиалирование не влияет на способность рчБуХЭ связывать данный ФОТ.
Способность рчБуХЭ эффективно связывать агент VR стало основанием для проведения эксперимента на животных. Мышам внутривенно вводили препараты рчБуХЭ-СА027 и чБуХЭ в количестве 21 мг/кг быстрой инъекцией в хвостовую вену; через 30 мин после введения антидота внутримышечно вводили водный раствор агента VR в объеме 50-100 мкл инъекцией в большую ягодничную мышцу. Дозу агента VR варьировали от летальной (ЛДюо) до нелетальной для точного определения ЛД50. Животных наблюдали в течение пяти дней, падеж считали через 30 минут после введения агента VR.
Похожие диссертации на Исследование функциональной активности химически модифицированной рекомбинантной бутирилхолинэстеразы человека in vitro и in vivo
-
