Введение к работе
Актуальность проблемы. Все типы нейральных клеток центральной нервной системы позвоночных животных являются производными нейральных стволовых клеток (НСК). НСК очень пластичны и демонстрируют в ходе развития разные морфо-функциональные свойства: в период эмбриогенеза они представлены клетками нейроэпителия и радиальной глии, а во взрослом мозге проявляют свойства астроцитов (Merkle et al., 2006). Фундаментальное свойство нейрогенеза - генерация из НСК разных типов клеток в строгой пространственно-временной последовательности: сначала нейроны, затем глия. Во взрослом мозге НСК сохраняются в структурах переднего мозга -субвентрикулярной зоне (СВЗ) латеральных желудочков и субгранулярной зоне (СГЗ) зубчатой извилины гиппокампа (Colucci-D'Amato et al., 2008) в течение всей жизни, обеспечивая постоянный нейрогенез.
В развитии из нейроэпителиальных клеток переднего мозгового пузыря помимо неокортекса мозга формируется сетчатка глаза. Как и в неокортикальных отделах, НСК сетчатки в развитии генерируют клетки разных типов в строгой временной последовательности. Зоны постоянного нейрогенеза отсутствуют в сетчатке глаза взрослых млекопитающих, но ее клетки проявляют мультипотентные свойства при травме и in vitro (Klassen et al., 2004).
НСК и клетки-предшественники можно выделять из эмбрионального и взрослого мозга и сетчатки, размножать в культуре, где они способны спонтанно дифференцироваться во все типы нейральных клеток.
Важную роль в регуляции пластичности НСК в эмбриональном развитии играют гены, кодирующие специфические транскрипционные факторы (ТФ). Для неокортикальных отделов мозга характерна экспрессия РАХ6, PROX1, SIX3, SOX2, DLX2, ЕМХ1, NKX2.1 и др.; для сетчатки глаза РАХб, PROX1, SIX3, SOX2, RXl, ОТХ2, LHX2, SIX6 и др. Имеются данные, что на ранних этапах нейрогенеза экспрессируются гены ОСТ4, NANOG - маркеры плюрипотентных клеток. Транскрипционные механизмы, которые регулируют пластичность
HCK, в развитии сетчатки глаза и неокортекса мозга схожи, что приводит к подобному морфогенезу этих слоистых структур ЦНС. В связи с этим появляется необходимость исследования активности общих для обеих структур генов в ходе развития.
У человека и грызунов НСК имеют значительные отличия по экспрессии ряда генов и по поведению клеток. В связи с чем изучение пролиферативного потенциала и дифференцировки НСК человека, как в организме, так и при культивировании имеет особое значение.
В нашем исследовании внимание уделено генам РАХ6, PROX1, ОСТ4 и NANOG. Считается, что продукт гена РАХ6 в неокортексе мозга и сетчатке глаза является маркером нейральных стволовых клеток. К таким маркерам может быть отнесён и ген PROX1, который экспрессируется в субпопуляции клеток-предшественников сетчатки глаза и мозга. Важно, что экспрессия этих транскрипционных факторов продолжается в нейрогенных зонах во взрослом мозге в СВЗ и СГЗ. Поскольку имеются данные об экспрессии генов ОСТ4 и NANOG в стволовых клетках ряда опухолей мозга (Du et al, 2009; Heddleston et al., 2009), было важно определить их участие в поддержании пластичности НСК в развитии.
Цель и задачи исследования. Настоящая работа посвящена исследованию молекулярно-генетических механизмов нейрогенеза неокортекса и сетчатки человека in vivo и in vitro.
В работе были поставлены следующие задачи:
Провести анализ экспрессии генов РАХб, PROX1, ОСТ4, NANOG и белков-маркеров нейральной дифференцировки в неокортексе мозга и сетчатке глаза в развитии плодов человека.
Получить культуры клеток неокортекса мозга и сетчатки глаза плодов человека с целью определения потенций к дифференцировке стволовых клеток и клеток-предшественников.
3. Провести сравнительный анализ экспрессии генов РАХб, PROX1,
ОСТ4, NANOG и белков-маркеров нейральной дифференцировки в
неокортексе и сетчатке человека in vivo и in vitro.
Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые проведен комплексный анализ экспрессии РАХб и PROX1, кодирующих транскрипционные факторы - маркеры НСК, и ОСТ4 и NANOG, кодирующих маркеры плюрипотентных клеток, в развитии неокортекса мозга и сетчатки глаза человека in vivo и in vitro.
Впервые проведено сравнение характера экспрессия ОСТ4 и NANOG в неокортексе мозга и в сетчатке глаза в ходе нейрогенеза на 8-12 и 18-20 нед. развития. В культуре клетки сетчатки сохраняют сходство с нативной тканью по экспрессии ОСТ4 и NANOG, в то время как клетки неокортекса его теряют.
Впервые показано, что экспрессия РАХб в исследованный период нейрогенеза находится на постоянном уровне, как в неокортексе, так и сетчатке глаза. Уровень экспрессии РАХб в сетчатке значительно выше, чем в неокортексе. В клеточных культурах неокортекса мозга и сетчатки глаза при стандартных условиях культивирования уровень экспрессии РАХб такой же, как в нативных тканях.
Впервые обнаружена экспрессия PROX1 в неокортексе мозга плода человека. В клеточной культуре сетчатки глаза экспрессия этого гена сохраняется, а в культуре неокортекса мозга отсутствует.
Проведенное исследование расширяет представления о молекулярных механизмах в развитии клеток неокортекса мозга и сетчатки глаза человека, что создает предпосылки для дальнейшего изучения биологии НСК. Полученные результаты могут применяться при разработке методов трансплантационной терапии нейродегенеративных заболеваний. Данные настоящего исследования могут быть использованы в курсе лекций по биологии развития и клеточной биологии.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на V-ой Конференции молодых ученых России с международным
участием (Москва, 2008), Четвертом международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, 2008), Российском медицинском форуме-2007 (Москва, 2007), Всероссийском симпозиуме «Культивируемые клетки как основа клеточных технологий» (Санкт-Петербург, 2009) и на конференциях молодых ученых ИБР РАН (2007, 2008, 2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 2 статьи в журналах из Перечня ВАК, тезисов докладов и материалов конференций - 7.
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 140 страницах и содержит 44 рисунка и 3 таблицы и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов, списка литературы, включающего 260 цитируемых источников.
Похожие диссертации на Исследование молекулярно-генетических механизмов нейрогенеза неокортекса и сетчатки человека in vivo и in vitro
