Содержание к диссертации
Введение
Введение 4
Обзор литературы. Механизмы специфической mактивности сперматозоидов 8
Сперматозоиды рыб 8
Сперматозоиды млекопитающих 13
Материалы и методы 19
Получение суспензии сперматозоидов 19
Сперматозоиды рыбы 19
Сперматозоиды м ыши 19
Анализ суспензий сперматозоидов 20
Протокол опыта по выживанию сперматозоидов мыши в трупе 23
Статистическая обработка и приемы формального анализа результатов исследования 24
Результаты исследования
Выживание сперматозоидов вьюна in vitro 29
Динамика численности элементов суспензии тестикулярных сперматозоидов вьюна 29
Двигательная активность сперматозоидов вьюна 33
Изменение численности способных к активации движения сперматозоидов 33
Изменение средней скорости движенияи пробега сперматозоидов 41
Изменение количества движения сперматозоидов 47
Динамика метящихся эозином сперматозоидов 50
Динамика метки йодистым пропидием 50
Динамика внутриклеточной концентрации АТФ в переживающих при различных температурах сперматозоидах 57
Динамика внутриклеточной концентрации АТФ после активации движения сперматозоидов 57
Динамика активности митохондрии сперматозоидов 62
Выживание сперматозоидов мыши in vitro
Морфологические структуры в суспензии содержимого семенного канальца мышей 63
Сперматозоиды мыши in vitro, 37 С 67
Динамика форм суспензии 67
Динамика функциональных показателей 74
Сперматозоиды мыши in vitro, 6 С 78
Динамика форм суспензии 78
Выживание сперматозоидов мыши в мертвом теле 86
Выживание сперматозоидов in vitro после извлечения из трупа 93
Обсуждение результатов
Об аномальных формах сперматозоидов теплокровных 101
Динамика показателей жизнеспособности сперматозоидов мыши in vitro 103
Динамика показателей жизнеспособности сперматозоидов рыбы in vitro 105
Стареют ли сперматозоиды? 106
Как гибнут сперматозоиды'? 107
Постмортальное переживание сперматозоидов in situ 110
Выводы 114
- Сперматозоиды млекопитающих
- Динамика численности элементов суспензии тестикулярных сперматозоидов вьюна
- Динамика метки йодистым пропидием
- Динамика функциональных показателей
Введение к работе
На протяжении последних десятилетий сперматозоиды различных животных служили предметом интенсивных исследований. Причины этого предопределены бурным развитием репродуктивных технологий животных и человека. Один из важнейших вопросов такого рода исследований - оценка фертильносте сперматозоидов в эякулятах, либо в тех или иных суспензиях сперматозоидов. Известно множество работ, в которых оценивалась жизнеспособность сперматозоидов в соответствии с их морфологическими, физиологическими и биохимическими показателями. Это, прежде всего, двигательная активность сперматозоидов; структура акросомы и выраженность акросомальной реакции; целостность мембраны клетки; активность митохондрий; морфология ядра и состояние хроматина. Однако, до сих пор нет методов, позволяющих гарантированно предсказать фертильность всякого эякулята по отдельно взятым показателям сперматозоидов.
Очевидно, что наиболее достоверной, исчерпывающей характеристикой качества сперматозоидов является успешность оплодотворения (при условии качественности женских гамет). Этот способ, однако, по сути процедуры, достаточно редко приобретает прогностическую ценность. Нарушение нормального (часто недостаточно четко определенного) статуса структурных компонентов сперматозоидов - каждого в отдельности, либо в тех или иных сочетаниях одного с другим - как правило, достаточно для прерывания сложнейшего каскада событий оплодотворения. Из этого следует, что оплодотворяющая способность сперматозоидов находится в прямой связи с их жизнеспособностью: непосредственно после получения, либо по мере хранения эякулята или суспензии in vitro.
Что такое "жизнеспособность" сперматозоидов? Как конкретизируется это понятие до уровня оцениваемых, измеряемых величин? Для ответа на эти вопросы следует обратиться к общеизвестной, но крайне редко употребляемой в сперматологии, общебиологической закономерности.
Факт полового размножения предполагает чередование различающихся плоидностью поколений, т.е. жизненный цикл организмов. В таком контексте зрелые половые клетки высших организмов есть ни что иное, как гаплоидная форма этих организмов. У позвоночных гаплоидная фаза существования представлена в крайне редуцированной форме. Внутреннее оплодотворение фактически исключает контакт гаплоидных особей с внешней средой многоклеточного протагониста, но предопределяет весьма специфическую среду обитания гамет.
Естественные изменения, происходящие со сформированными мужскими гаметами, нельзя назвать "дифференцировкой", поскольку клетки уже приобрели все черты специализации. Те события, которые происходят на протяжении спермиогенеза, в том числе события процесса капацитации сперматозоидов млекопитающих, более напоминают своего рода онтогенез - онтогенез гаплоидной формы организмов, -несомненно, имеющий собственные, отличные от онтогенеза многоклеточных диплоидных особей, закономерности.
События такого "онтогенеза" гаплоидных форм очевидно (1) осуществляются в пределах одной клетки (2) без регуляционной активности собственного генома.
Признание гаплоидной формы существования организмов позволяет применить методологию и хорошо развитые приемы анализа выживаемости в популяции диплоидных, наделенных "сомой", организмов (Доронин, Максудов, 2002). Показатели выживаемости, по определению, опосредуют все многообразие жизненных проявлений, и могут служить исчерпывающей интегральной характеристиками. Ранее мы предприняли попытку такого рода по отношению к женским гаметам - неоплодотворенным, активированным икринкам костистой рыбы (Мохаммедзаде и др., 2002).
Сразу после помещения икринок в адекватный солевой раствор развивается активация яйца. Через 10-15 минут изменяется сферическая форма клетки. Неоплодотворенное яйцо "имитирует" характерные изменения зиготы: бедная желточными гранулами цитоплазма концентрируется на одном из полюсов. Часто протоплазматический бугорок разделяется на две части, имитируя форму двуклеточного зародыша. Позднее клетка отделяет несколько разновеликих фрагментов, часть из которых распадается. В перивителлиновом пространстве на фоне некротических масс длительное время сохраняются один или два отграниченные мембраной фрагменты яйца. В конечном итоге под вторичной яйцевой оболочкой остаются только некротические массы. Именно такие структуры служили свидетельством гибели яйца.
Полученные в результате этого исследования кривые выживания активированных икринок по форме соответствуют известным кривым выживания ряда лабораторных организмов - плодовой мушки, мыши. Такая, достаточно распространенная в животном мире форма кривой выживания свидетельствует о том, что вероятность гибели (полной деструкции) икринки возрастает по мере ее существования. Последнее, будучи в полном соответствии с общепринятым определением, позволяет заключить, что неоплодотворенные, активированные женские гаметы костистой рыбы, экспонированные во внешней среде, испытывают процесс, названный "старением".
Множество переживающих в тех или иных условиях in vitro половых клеток, например, сперматозоидов, возможно представить как своеобразную клеточную культуру. Поскольку эти клетки, по определению, не пролиферируют, такая культура должна быть признана "стационарной" и, соответственно, испытывать "стационарное старение" (Khokhlov, 2000). Старение клеточных культур на протяжении стационарной фазы их существования связывают с изменениями структуры и состояния ДНК (Виленчик, 1987, Хохлов 1988). Поскольку
гаметы транскрипционно пассивны, то последствия стационарного старения смогут проявиться только после активации их генома, т.е. после оплодотворения в составе диплоидного ядра, но никак не участвуют в собственно "старении" переживающих гамет. Иными словами, если гаметы стареют, то механизмы этого процесса следует полагать связанными с изменениями морфологии и функциональных проявлений образующих их структур, но только не ядер.
При исследовании выживания активированных рыбьих икринок мы столкнулись с простым, на первый взгляд, но в действительности очень серьезным вопросом: что считать гибелью яйца? Как следует из приведенного выше краткого изложения материалов исследования, мы приняли, что клетка гибнет тогда, когда полностью разрушаются пограничные мембраны каждого из фрагментов яйца. Можно было бы полагать, что клетка гибнет в момент нарушения исходной целостности, т.е. в момент фрагментации. Определение момента гибели сперматозоида, как следует из представленного ниже исследования, оказалось еще более сложной задачей.
Опираясь на изложенное выше, мы предприняли попытку оценить жизнеспособность зрелых мужских гамет как по динамике изменения их численности, так и в соответствии с "парциальной" динамикой изменения их функциональных проявлений. Для достижения этой цели мы воспользовались достаточно стандартными набором средств для оценки состояния клеточной мембраны, митохондриального аппарата и двигательной системы клеток, регистрируя эти показатели по мере существования суспензий сперматозоидов рыбы и мыши in vitro и сперматозоидов мыши in situ post mortem. Своего рода интегральной оценкой жизнеспособности сперматозоидов служила внутриклеточная концентрация АТФ. Этот показатель опосредует, как минимум, три из названных выше: двигательную активность, деятельность митохондриона и состояние клеточной мембраны.
Сперматозоиды млекопитающих
Вопрос о судьбе сперматозоидов в половых путях самцов активно дискутировался еще в начале прошедшего столетия. Ряд исследователей (J. Benoit, В.Т. Baldwin, О. Nakano, R.M. Oslund) полагали, что неэиякулировавшие сперматозоиды выводятся из половых путей с мочой (Simeone, Young, 19...). Другие исследователи (C.S. Minot, Е. Wertheimer, С. Dubois, Н.А Marshall) считали, что невостребованные спермин деградируют в половых путях и поглощаются эпителием, либо клетками подлежащей ткани. Ряд исследователей (С. Wegelin, Z.Morgenstern, J.Lehner, A.Priesel, A. Nemiloff) выдвинули концепцию "сперматофагии", доказывая существование в половых путях "спермифагов". В результате исследований W.C.Young (1927, 1929 a,b, 1931) выяснилось следующее. Сперматозоиды поступают в эпидидимис незрелыми и дозревают по мере продвижения в этой структуре. Достигнув "зрелости" клетки, по определению автора "стареют", т.е. постепенно теряют способность к проявлению специфической функции и, далее, дегенерируют в cauda epididymis и vas deferens. Любопытно следующее заявление этого исследователя: "The death and degeneration which have been observed in this study are believed, therefore, to be a consequence of age and a natural sequence in a chain of events which is interrupted only if the spermatozoa are discharged". Иными словами, те проявления клетки, которые обычно полагают ее главным предназначением, являются лишь эпизодом ее естественной истории. В современной литературе чаще употребляется понятие "капацитация", определяемое как еще недостаточно понятый этап созревания сперматозоидов, естественным образом происходящий в половых путях, как самца, так и самки, либо, in vitro, в искусственно созданных средах. В результате этого процесса сперматозоиды млекопитающих приобретают способность к осуществлению акросомальной реакции и оплодотворению яйца (Visconti et al., 1995). Нужно подчеркнуть, что, поскольку у большинства млекопитающих сперматозоиды проявляют в той или иной степени выраженную двигательную активность еще в половых путях самцов, оплодотворяющая способность спермы связывают, главным образом, с успешностью и своевременностью акросомальнои реакции, хотя существуют данные, свидетельствующие о существенном изменении подвижности (гиперактивации) капацитировавших сперматозоидов (Neill, Olds-Clarke, 1987). Капацитация сопровождается реорганизацией состава и топологии поверхностных антигенов спермиев, изменением проницаемости мембраны, возрастанием внутриклеточного пула вторичных посредников (цАМФ, 1Р3, диацилглицерол) и уровня фосфорилирования белков (White, Aitken, 1989; Storey, 1995; Baldi et al., 1996; Visconti, Kopf, 1998).
Среда, окружающая сперматозоиды в период спермиогенеза и капацитации, существенно различается в разных отделах полового тракта. Концентрация ионов натрия в головке эпидидимиса составляет около 100 мМ, но снижается приблизительно вдвое в хвосте эпидидимиса (Jenkis et al., 1980). Концентрация ионов калия изменяется противоположным образом: в головке составляет около 20 мМ, и возрастает до 40 мМ в cauda epididymis. Возрастание концентрации ионов калия в дистальних отделах семявыводящих структур приводит к деполяризации наружной мембраны сперматозоидов и активирует потенциал-зависимые кальциевые каналы (Babcock, Pfeiffer, 1987; Сох, Peterson, 1989; Florman et al., 1992; Beltran et al., 1994). При этом преждевременное созревание сперматозоидов и спонтанная акросомальная реакция предотвращаются, вероятно, сравнительно низкой концентрацией в эпидидимальной жидкости ионов натрия (Jenkis et al., 1980) и кальция. Низкая концентрация ионов натрия во внешней среде обеспечивает, вероятно, смещение значений внутриклеточного рН в кислую область (Zeng et al., 1996). "Кальциевые депо" в сперматозоидах некоторых видов млекопитающих, вероятно, ассоциированы с акросомой, поскольку именно в области этой органеллы обнаружен кальретикулин (белок, связывающий ионы кальция) (Nakamura et al., 1993). Ряд факторов, содержащихся в семенной плазме и в жидкостях женского полового тракта, способны предотвращать чрезмерное повышение внутриклеточной концентрации кальция (Lakoski et al., 1988; Okamura et al., 1990; Boettgerong et al., 1993), приводящего к спонтанной акросомной реакции и к чрезмерной двигательной активности сперматозоидов (White, Aitken, 1989). Примером такого фактора может служить калтрин - белок, присутствующий в семенной плазме, который ингибирует высвобождение ионов кальция (Rufo et al., 1982; Clark et al., 1993). Гепарин, который используется для капацитации спермы быка, связываясь, вероятно, с соответствующими специфическими рецепторами на наружной мембране сперматозоидов, регулирует внутриклеточную концентрацию ионов кальция, модулируя активность потенциал-зависимых кальциевых каналов (Parrish et al., 1989; Calvete et al., 1996; Cordoba et al., 1997). Поздние стадии капацитации бычьих и человеческих сперматозоидов сопровождаются возрастанием проницаемости наружной мембраны к ионам калия. Это приводит к гиперполяризации клетки - мембранный потенциал возрастает от -30 мВ до -60 мВ (Zeng et al., 1995). Гиперполяризация, в свою очередь, влияет на активность потенциал-зависимых ионных каналов, особенно кальциевых (Lievano et al., 1996) и связана с повышением уровня фосфорилирования ряда белков. Состав липидов наружной мембраны влияет на ее текучесть и активность ионных каналов (Lundbaek et al., 1996). Например, количество холестерола в наружной мембране сперматозоидов быка и человека определяет уровень внутриклеточного рН (Cross, Razy-Faulkner, 1997). Очищенный от холестерола альбумин способен поглощать холестерол, содержащийся в клеточной мембране (Davis et al., 1979; Go, Wolf, 1985; Langlais, Roberts, 1985). В результате изменяется текучесть (вязкость) наружной мембраны сперматозоидов и ее проницаемость к ионам Са2+ и НСОэ (Visconti et al., 1995). Гиперактивация и фосфорилирование некоторых белков посредством тирозинкиназы требует присутствия НС03 - ионов в капацитирующеи среде. Этот эффект может быть связан с BSA---+- BSA-ХОЛЄСТЄрОЛ Использованные в опытах вьюны (Misgurnus fossilis L.) были отловлены в Мещерском районе Рязанской области. В лаборатории самки и самцы содержались отдельно в 20-литровых емкостях в холодильнике при температуре +4 - +8С. Рыбы умерщвлялась декапитацией. От ближайшей к выводному протоку части семенника отделяли небольшой участок, который измельчали в 10 мл раствора Рингера (NaCl - 0,65%, KCl - 0,025%, NaHCOs - 0,20%, CaCl2 0,03%).
Плотность полученной суспензии определяли с помощью камеры Горяева и разводили раствором Рингера до окончательной концентрации - 10 клеток на мл. Образцы суспензий сохраняли в пластиковых пробирках при температурах 10С, 18С и 25С. Сперматозоиды мыши В опытах были использованы 25 половозрелых (9-месячных) самцов белых мышей (SHK) весом около 30 г. Животных умерщвляли методом цервикальной дислокации, вскрывали и извлекали один из семенников. Семявыводящий канатик (yas deferens) отделяли от связок и жировой ткани и отрезали его в области сразу после эпидидимиса и дистальнее места впадения протоков семенных желез. Фрагмент помещали в предварительно взвешенную пробирку с 1 мл нагретой до 37С среды «FertiCult » (Бельгия). Далее, пробирки повторно взвешивали для определения веса образца и, периодически встряхивая, инкубировали в течение 15 минут при 37. Концентрацию сперматозоидов в полученной таким образом суспензии оценивали с помощью камеры Горяева. Из исходной суспензии готовили рабочую суспензию с концентрацией 106 клеток в 1 мл. Полученные суспензии сперматозоидов инкубировали при температурах 37 и 6С. Анализ суспензий сперматозоидов Анализ суспензий состоял в определении ряда морфологических и функциональных показателей. 1. Численность головок сперматозоидов вьюна и каждого из 6 выделенных основных морфологических элементов эпидидимальной суспензии мышей (см. ниже) подсчитывали на микрофотографиях различных участков камеры Горяева. 2. Двигательную активность сперматозоидов вьюна определялась следующим образом. Сперматозоиды вьюна в растворе Рингера неподвижны. В гипотонической среде, т.е. при разбавлении раствора Рингера в 3 и более раз, активируется движение сперматозоидов. 5 мкл суспензии помещали на предметное стекло между двумя покровными стеклами. К капле суспензии добавляли 5 мкл дистиллированной воды и быстро накрывали третьим покровным стеклом, опирающимся на те, между которыми располагалась капля.
Динамика численности элементов суспензии тестикулярных сперматозоидов вьюна
Сперматозоиды вьюна - мелкие клетки с размером головки, равным 2 мкм и тонким и коротким хвостом длиной 30 - 40 мкм. Анализ компонентов суспензии тестикулярных сперматозоидов вьюна с помощью различных приемов световой микроскопии (фазовый контраст, темнопольная микроскопия), к сожалению, не позволяет с достаточным уровнем достоверности количественно характеризовать численность нормальных и аномальных сперматозоидов и фрагментов сперматозоидов. В связи с этим, мы ограничились определением численности головок сперматозоидов, без указания того, автономны ли они (т.е. являются ли они фрагментами клеток), либо включены в состав целостных сперматозоидов. Кривые изменения численности головок сперматозоидов в суспензиях, инкубировавшихся при температурах 10С, 18С и 25С, представленные на рис. 4-6, демонстрируют сравнительно слабо выраженную динамику убыли элементов. Между тем, в каждом из трех случаев, кривые наилучшим образом аппрокисимируются сигмоидальными зависимостями (по Гомпертцу, логистическими кривыми, простой сигмоидой), хотя каждую из них, приблизительно с той же степенью достоверности, возможно описать как линейной, так и простой экспоненциальной зависимостью (таблицы 1 - 3). При прочих равных условиях, последний способ аппроксимации наименее удачен. Двигательная активность сперматозоидов вьюна Результат одного тестирования двигательной активности сперматозоидов можно представить так, как изображено на рисунках 7 и 8. По оси X этих рисунков отложены градации скоростей движения сперматозоидов, по оси Y - время получения фотографии, т.е. время, прошедшее с момента активации, а по оси Z - относительная численность движущихся (т.е. активировавшихся) сперматозоидов. Гистограммы, на которых представлены изменения скоростей движения сперматозоидов в последовательные моменты после активации, большей частью представляют собой многовершинные распределения, с выраженным эксцессом и асимметрией (рис. 7-8). Средние величины не могут быть параметрами этих распределений, но вполне пригодны для характеристики общей тенденции изменений движения сперматозоидов в процессе тестирования.
Изменение численности способных к активации движения сперматозоидов Изменения доли (%) двигательной активности сперматозоидов в каждом из последовательных тестирований в инкубировавшихся при разных температурах суспензиях на протяжении периода их сохранения in vitro достаточно однотипны и хорошо укладываются в «стандартный» набор относительно простых кривых (см. рис. 9 и 10). В большинстве случаев численность движущихся сперматозоидов монотонно убывает в течение 1-1,5 минут в соответствии с экспоненциальным законом. При некоторых тестированиях кривая убыли численности движущихся сперматозоидов становится фазической: монотонное убывание сменяется периодом возрастания численности движущихся сперматозоидов (например, через 4,5, через 6,35 и через 8,83 и 27,28 часа при инкубации в 25С, 18С и 10С, соответственно, рис.9 - 10). В каждом из режимов переживания клеток присутствует двухфазная кривая такого рода, амплитуда колебания численности существенно больше, чем на других аналогичных кривых: при тестировании через 7,8 часа в суспензии, инкубировавшейся при 25С; через 9,85 часа в суспензии, инкубировавшейся при 18С; через 31,53 часа в суспензии, инкубировавшейся при 10С. Двухфазные кривые такого рода могут свидетельствовать (1) о существовании, как минимум, двух популяций сперматозоидов -немедленно активирующихся при понижении осмотичности среды и латентных, начинающих движение с некоторой задержкой после разбавления раствора Рингера, - либо (2) о повторной активации движения сперматозоидов после завершения раунда движения, вызванного разбавлением среды. Второе представляется менее вероятным, чем первое предположение. Для сравнительной оценки вызванной двигательной активности сперматозоидов мы определили площади под кривыми, отражающими изменение двигательной активности сперматозоидов в течение каждого тестирования. Эти величины, очевидно, имеют размерность: (относительная численность движущихся клеток) X (время) и могут служить мерой суммарной двигательной активности на протяжении каждого тестирования. Распределение этого показателя на протяжении периода инкубации сперматозоидов представлено на рис. 11,А Эта кривая образована последовательностью максимумов и минимумов. Такой характер кривой свидетельствует о том, что состояние сперматозоидов изменяется по мере их содержания in vitro. При этом часть из них приобретают способность к движению в различные моменты времени, но вскоре, спонтанно, без всякой активации теряют эту способность. (В противном случае кривая выглядел бы монотонно возрастающей, но не многофазной). Иными словами, полученная в результате измерений кривая является дифференциальной кривой, отражающей изменения численности способных к активации движения сперматозоидов. Последнее позволяет реконструировать интегральную кривую, характеризующую убыль потенциально способных к движению сперматозоидов при их содержании in vitro в различных температурах (рис. 11, Б). Результат проверки соответствия полученных последовательностей точек различными сигмоидальными зависимостями представлен в таблице 3. Вопреки хорошему соответствию (см. значения R2 в таблице 3) аппроксимации такого рода имеют малую прогностическую ценность. Интегральные кривые, отражающие падение двигательной активности сперматозоидов по мере их сохранения, имеют очевидно ступенчатый характер, где каждая ступень отражает падение способности к движению последовательно «дозревающих» порций сперматозоидов.
Кажется вероятным, что динамика каждого такого «парциального» падения двигательной активности подчиняется сигмоидальной зависимости. Определить аналитически сколько-нибудь достоверно форму такой зависимости не представляется возможным, поскольку «ступени» накладываются одна на другую, и на каждую из них приходится малое количество экспериментально полученных точек. Изменение средней скорости движения и пробега сперматозоидов Так же, как в предыдущем случае, набор кривых, характеризующих среднюю скорость движения на протяжении каждого тестирования, достаточно однотипен (см. рис. 12 и 13). Это экспоненциальное падение скорости, либо фазические кривые, свидетельствующие об активации латентной (т.е. не активирующихся непосредственно после разбавления раствора Рингера) порции сперматозоидов. Площади под кривыми, отражающими изменение средней скорости движения сперматозоидов, суть усредненный пробег сперматозоидов после их активации. Кривые, отражающие изменения этого показателя на протяжении периода сохранения при различных температурах (рис. 14, А), так же как в предыдущем случае, представляют собой последовательность максимумов и минимумов, положение которых подобно таковым на рис. 11 А.. Очевидно, что кривая на рис. 14 А является дифференциальной кривой, на основании которой можно восстановить интегральную функцию, отражающую изменения потенциального пробега «дозревающих» (т.е. приобретающих способность к движению) сперматозоидов. Полученные интегральные кривые (рис. 14, Б) несколько отличаются от аналогичных кривых, отражающих динамику численности приобретающих способность к движению сперматозоидов (рис. 11,Б). Эти интегральные кривые хорошо аппрокисимируются рядом функций (см. таблицу 4), среди которых хуже всего соответствует последовательности точек простая экспоненциальная зависимость. Изменение количества движения сперматозоидов Представленные выше данные нетрудно объединить, получив исчерпывающую характеристику интенсивности движения (точнее, количества движения) сперматозоидов в результате каждого раунда активации по мере их сохранения in vitro. Как и следовали ожидать, дифференциальная (рис. 15, А) и интегральная (рис. 15, Б) кривые подобны представленным выше и описываются теми же зависимостями (см. таблицу 5), как предшествующие.
Динамика метки йодистым пропидием
При содержании суспензии сперматозоидов при 25 С доля метящихся эозином клеток монотонно возрастает (рис. 16, А). В суспензиях, содержавшихся при 18С и 10С, кинетика возрастания численности эозинофильных клеток достаточно сложна и, что наиболее интересно, имеет фазовый характер, т.е. 1-2 максимума (рис. 17А, 18А). Последнее обстоятельство позволяет полагать, что способность к окраске эозином, эозинофилия, так же как способность к движению, при сохранении клеток in vitro развивается самопроизвольно. Из этих кривых следует также, что в суспензиях, сохраняющихся при 18С и 10С, находятся как минимум две популяции, достигающие максимальной эозинофильности через 8-10 часов и 25 - 30 часов культивирования. Характер полученных в результате измерений кривых позволяет, так же как в случае с двигательной активностью, восстановить интегральную кривую, характеризующую потенциальную эозинофилию по мере их содержания in vitro (рис. 16Б, 17Б, 18Б). Интегральные кривые, характеризующие этот показатель, описываются сигмоидальными зависимостями по Гомпертцу существенно лучше, чем экспоненциальными (таблица 6). Динамика метки йодистым пропидием По мере сохранения суспензии тестикулярных сперматозоидов при температурах 10, 18 и 25С возрастает доля метящихся (и, соответственно, падает доля не метящихся) йодистым пропидием ядер. Динамика этих процессов существенно варьирует для суспензий, полученных от различных рыб (рис. ...). Вопреки этому различию, мы попытались оценить кинетику этого процесса, аппроксимируя разброс точек, полученных в трех экспериментах, экспоненциальной, линейной и сигмоидальной зависимостями (таблица ...). В каждом из трех случаев данные наилучшим образом описываются сигмоидальными зависимостями по Гомпертцу. Динамика внутриклеточной концентрации АТФ в переживающих при различных температурах сперматозоидах Как следует из рис. .20, содержание (концентрация) АТФ в пересчете на одну клетку падает по мере сохранения тестикулярных суспензий вьюна. Это падение зависит от температуры инкубации суспензии и хорошо аппроксимируется как экспоненциальной, так и сигмоидальной зависимостями (таблица 8).
При прочих равных условиях, аппроксимация сигмоидальными (4-х параметрическими логистическими) кривыми представляется более адекватной разбросу полученных данных. Иными словами, не следует ожидать снижения концентрации АТФ до 0: достигнув нижнего предела (0,22»10"13, 0,47»10" 13, 0,58-Ю"13 мМ/мл при 25С, 18С и 10С, соответственно), концентрация АТФ более не изменяется. Динамика внутриклеточной концентрации АТФ после активации движения сперматозоидов Изменения концентрации АТФ, определенное сразу после активации сперматозоидов и через каждые 15 последующих секунд до полного завершения их движения в четырех образцах тестикулярных суспензий, представлена на рис 21. Активация движения сопровождается 1,5 - 1, 2 - кратным падением концентрации АТФ на протяжении 1,5-1, 7 минут. Очевидно, что градуальность падения концентрации АТФ обеспечена градуальным падением количества движущихся сперматозоидов и, вероятно, градуальным замедлением движения отдельных сперматозоидов. Стационарный уровень содержания АТФ после прекращения движения, вероятно, обеспечен, внутриклеточной концентрацией АТФ в неактивировавшихся сперматозоидах и «остаточной» концентрацией АТФ в активировавшихся и завершивших движение сперматозоидов. Динамика активности митохондрии сперматозоидов Как следует из рис. 22, относительное количество метящихся родамином 123 клеток не изменяется при инкубации суспензии при трех температурах. Уравнения линейных трендов, аппроксимирующих эту динамику очевидно не различаются одно от другого и от линии, параллельной оси X, пересекающей ось Y в координате 1. Выживание сперматозоидов мыши in vitro Морфологические структуры в суспензии содержимого семенного канальца мышей На рисунке 23 представлено изображение образца суспензии, полученной из полости семенного канатика. Микроскопический анализ суспензий, полученных от различных животных, позволяет выделить следующие, наиболее обычные морфологические структуры: (1) -морфологически нормальные сперматозоиды (рис. 23, 1); (2) -сперматозоиды с перегибом шейки, в результате которого головка оказывается смещенной дистально. В этой группе достаточно часты сперматозоиды, у которых проксимальная область шейки контактирует с дистальной, образуя характерное кольцо, в непосредственной близости с которым находится головка (рис. 23, 2); (3) сперматозоиды, у которых хвост скручен в циркулярную структуру (или, реже, - образует несколько замысловатых колец), к которой примыкает головка (рис. 23, 3). Помимо таких форм целостностных сперматозоидов, в суспензиях встречаются фрагменты спермиев: (4) отдельные головки (рис. 24, 4), (5) отдельные хвосты (точнее, комплексы собственно хвостовой части и шейки) (рис.23, 5), (6) комплексы головки и шейки сперматозоидов (рис. 23, 6). Частота встречаемости и вариабельность выделенных форм в суспензиях, полученных от разных животных, охарактеризованы в таблице 9. На протяжении периода наблюдений (около 3,5 суток) численность морфологически нормальных сперматозоидов, сперматозоидов с изогнутыми хвостами достоверно снижается.
Плотность «скрученных» сперматозоидов остается постоянной (см. рис. 26 и таблицу 10). В целом, численность сохраняющих целостность сперматозоидов на протяжении периода наблюдений падает, в то время как численность фрагментов клеток остается неизменной (рис. 27, табл. 11). Такое соотношение динамики компонентов суспензии свидетельствует о том, что в первую очередь происходит деструкция сперматозоидов на составные элементы, и лишь после этого полностью деградируют клеточные фрагменты. Численность отдельных головок достоверно возрастает, причем по темпам сопоставимо с убылью нормальных спермиев, в то время как численность отдельных хвостов остается неизменной. Последнее может свидетельствовать о кратковременности существования отброшенных хвостов. Отдельные головки сперматозоидов, напротив, длительно сохраняются и накапливаются в суспензии. Численность отдельных комплексов головки и хвоста достоверно снижается, что может служить еще одним свидетельством в пользу предложенной выше последовательности событий: первичности деструкции и лишь последующей деградации составных элементов клетки. Кривые убывания численности нормальных сперматозоидов и сперматозоидов с изогнутыми хвостами по существу отражают динамику выживания (дожития) этих элементов in vitro при 37С. В этой связи, экстраполяция динамики дожития линейной зависимостью представляется бессодержательным по существу вопроса, и использована нами только для оценки и сравнения общих тенденций. Смысловую нагрузку приобретает приложение к экспериментально полученным данным трех функциональных зависимостей: экспоненциальной, уравнения Гомпертца (в форме, приложимой к кривым дожития) и уравнения Вейбулла (также в форме, применяемой для описания кривых дожития). В тех случаях, когда кривая дожития экстраполируется экспоненциальной зависимостью (т.е. задается условие неизменности вероятности гибели структур на протяжении всего периода их существования), говорят об отсутствии процесса старения. (Напомним, что единственным и общепринятым феноменологическим определением процесса старения является повышение вероятности гибели структур по мере их существования.) Уравнения Гомпертца и Вейбулла a priori содержат посылку о повышении вероятности гибели структур по мере их существования. Однако первое из них предполагает старения как присущее объекту непреложное свойство, а второе - как результат отказа тех или иных подсистем, входящих в состав исследуемой структуры.
Динамика функциональных показателей
Результаты исследования выживания спермиев в мертвом теле представлены в сводной таблице 22 и на графиках (рис 36, 37). Из таблицы 22 следует поразительный итог: на протяжении 18-дневного пребывания в трупе большинство показателей суспензии эпидидимальных сперматозоидов остаются неизменными (таблица 23). Исключение составляют лишь два показателя: достоверно снижаются доля метящихся родамином 123 структур и концентрация АТФ в митохондрионсодержащих структурах суспензии. Оба показателя положительно коррелируют один с другим (параметрическая корреляция: R = 0,525, р = 0,024; непараметрическая корреляция - по Кендаллу: р = 0,007; по Спирмену: р = 0,007). Достаточно очевидно, что дисперсия данных, вероятно, неизбежная в тех случаях, когда каждая точка представляет собой результат исследования материала от одного животного, - существенно маскирует временную динамику тех или иных показателей. В подтверждение этой мысли, приведем следующие наблюдения. Как указывалось в разделе «Материалы и методы», один семенник извлекали из целостного трупа, а другой - через сутки после вскрытия трупа. На рис. 38 и 39 представлена динамика тех же показателей, что на рис. 36 и 37, но данные сгруппированы в двух выборках, в соответствии со сроками извлечения из трупа. Временная динамика показателей как будто указывают на влияние атмосферного кислорода: сперматозоиды во вскрытых трупах (в сравнении со сперматозоидами, полученными из целостных, невскрытых трупов) медленнее теряют двигательную активность, медленнее сокращается численность сперматозоидов с активными митохондриями, лучше (в большем числе) сохраняются целостные сперматозоиды, медленнее накапливаются в суспензии фрагменты сперматозоидов. К сожалению, все эти явления следует полагать не более, чем неподтвержденными предположениями. Регрессии, описывающие динамику показателей, не различаются статистически, за исключением той, которая отражает динамику количества клеток в пересчете на 1 мг извлеченной из трупа ткани. Коэффициенты линейных регрессий, описывающих динамику этого показателя в суспензиях из невскрытых и вскрытых трупов, достоверно отличаются один от другого (р = 0,049); коэффициент первой регрессии (суспензия из невскрытых трупов) достоверно отличается от 0 (р = 0,037), в то время как коэффициент второй регрессии (суспензии из вскрытых трупов) не отличаются от 0 (р = 0,644). Выживание сперматозоидов in vitro после извлечения из трупа Полученные от трупов различного срока суспензии сохраняли in vitro в питательной среде при 6С.
Тренды численности сохраняющих свою целостность сперматозоидов и фрагментов разрушенных сперматозоидов представлены на рис. 40- 42. Коэффициенты наклона линейных функций, аппроксимирующих эту динамику, в подавляющем большинстве случаев оказались незначимыми (т.е. не отличающимися от 0). Иными словами, численность целых сперматозоидов следует полагать неизменной на протяжении каждого из наблюдений (табл. 24). Более того, динамика численности целостных сперматозоидов, извлеченных сразу после умерщвления животного, не отличается от таковой в суспензиях, полученных от трупов разного срока (см. табл. 24). «Скрученные» сперматозоиды и сперматозоиды с изогнутыми хвостами ("spermatozoa, with tails bent midway along the tail", Sankai et al., 2001) - явления достаточно обычное в эякулятах и суспензиях эпидидимальных сперматозоидов млекопитающих. Дефекты такого рода описаны в семени высокопородных быков и получили специальное наименование «dag defects» (Blom, 1966). В эякулятах 833 (Schwartz et al., 1984) и 214 (Bujan et al., 1988) мужчин эти формы составляют 10,5% (5,8 и 4,7%, соответственно) и 12,2% (7 и 5,2%) от общей численности сперматозоидов. В эякулятах кролика доля скрученных сперматозоидов и сперматозоидов с изогнутыми хвостами равна 9,1% и 1,3%, соответственно (Kuzminsky et al., 1996). Описан случай, когда семя жеребца в начале сезона размножения содержало 90% неподвижных сперматозоидов со скрученными и изогнутыми хвостами. Осеменение, между тем, этой спермой привело к беременности в 44% случаях. На основании этого заключили, что фертильность такого семени оказалась существенно выше, чем ожидалось, исходя из морфологических особенностей сперматозоидов этого самца (Hellander et al., 1991). Между тем, сперматозоиды с изогнутыми хвостами, по всей видимости, способны к движению. В работе Санкаи с соавторами (Sankai et al., 2001) приведен рисунок, на котором восстановлены фазы движения таких сперматозоидов, в изобилии, судя по фотографии, представленных в эпидидимальной суспензии мыши. Сперматозоиды со скрученными хвостами появляются в процессе миграции спермиев в эпидидимисе. Промежуточные формы этой аномалии обнаружены в corpus epididymidis, и в заметных количествах в более дистальных отделах семявыводящего тракта. Предполагается, что
патогенез сперматозоидов со скрученными хвостами связан с нарушением смещения и отделения капель ризидуальнои цитоплазмы (Holt, 1982). Формирование сперматозоидов с изогнутыми и скрученными хвостами связано с нарушением структуры (разрывами, изломами) и смещением центральных осевых пучков, ацентрическим смещением митохондрии. Самое поразительное состоит в том, что сперматозоиды со скрученными хвостами полностью заключены в общую мембрану (Lobl, Mathews, 1978; Andersen Berg et al., 1996; Molnar et al., 2001). Помимо того, что сперматозоиды с изогнутыми и скрученными хвостами встречаются у высокоимбредных животных, их появление может индуцироваться рядом внешних воздействий. Например, - 1-(2,4-дихлорбензил)-индазол-3-карбоксиловой кислотой у макак резусов (Lobl, Mathews, 1978), прибавлением в среду инкубирования теофиллина, семенной плазмы и альбумина (Cornwall et al., 1986); ассоциировано с накоплением цинка в гаметах (Blom, Wolstrup, 1976). Изгиб хвоста эпидидимальных сперматозоидов при активации их движения теофиллином, семенной плазмой и альбумином удается блокировать добавлением гидразина, т.е. стимуляцией окисления сульфоксидных групп (Cornwall et al., 1988). Санкаи с соавторами (Sankai et al., 2001) полагают, что сперматозоиды с изогнутыми и скрученными хвостами формировались в из-за повреждения мембраны, вызванной повышением ригидности фосфолипидов в связи с пониженной температурой (+10С), при которой сохранялись сперматозоиды.
Последнее - низка положительная температура как причина появления сперматозоидов со смещенными головками - кажется маловероятной, поскольку такие сперматозоиды присутствуют в достаточном количестве в свежеприготовленной суспензии (т.е. сразу после извлечения из среды с температурой около 37С). Приведенные выше сведения о сперматозоидах млекопитающих с характерными формами хвоста (изогнутыми и скрученными) позволяет предположить следующее. В соответствии с прагматической логикой, сперматозоиды, не исполняющие своего предназначения - неподвижные и неспособные оплодотворять яйцо - есть аномальные сперматозоиды. Безразличная к антропоцентрической логике логика естественных событий подсказывает, что аномальные сперматозоиды, вероятнее всего, являются формами, в которые превращаются "нормальные" сперматозоиды, невостребованные для оплодотворения и не испытавшие гиперактивацию. Иными словами, мы полагаем, что гаплоидные формы организма (см. выше) могут проявляются в форме нормальных, способные к активному поступательному движению и оплодотворению спермиев, «ангулярных» клеток с изогнутыми на 180 градусов хвостами, и, наконец, в виде сперматозоидов со скрученными в спираль хвостами, заключенными в общую плазматическую мембрану. В таком контексте неудивительно высокое содержание сперматозоидов с изогнутыми и скрученными хвостами в эпидидимальной суспензии, полученной от самцов, длительное время лишенных полового контакта, так же как отсутствие какой-либо динамики численности сперматозоидов со скрученными хвостами по мере сохранения суспензии in vitro. Динамика показателей жизнеспособности сперматозоидов мыши in vitro Считается, что наружная мембрана клеток непроницаема для йодида пропидия, и лишь при нарушении ее целостности краситель проникает в цитоплазму и далее связывается с ядерной ДНК. В этой связи окрашиваемость ядер йодидом пропидия полагают маркером «мертвых» клеток. Между тем, свойства мембраны каждой из форм целостных сперматозоидов в суспензиях, несомненно, отличаются от общепринятого стандарта.
