Содержание к диссертации
Стр.
ВВЕДЕНИЕ . 4
ГЛАВА І. ЦИТОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
РАЗВИВАЮЩИХСЯ МИКРОСПОР И ПЫЛЬЦЕВЫХ ЗЕРЕН ИГ
SITU й Ш "ШЯЮ /ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ/ 10
Некоторые особенности дифференцировки мужского гаметофита in situ 10
Экспериментальное изучение развития микроспор
и пыльцевых зерен in vitro 26
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ 43
ГЛАВА 3. МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАЗВИТИЯ МЖРОСПОР
И ПЫЛЬЦЕВЫХ ЗЕРЕН КОРИАНДРА 52
Длительность стадий развития микроспор и пыльцевых зерен и их корреляция с размерами бутонов 53
Дифференцировка микроспор и пыльцевых зерен кориандра 57
ГЛАВА 4. ДИНАМИКА НАКОПЛЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ,БЕЖОВ И
ЗАПАСНЫХ ВЕЩЕСТВ В МИКРОСПОРАХ И ПЫЛЬЦЕВЫХ ЗЕРНАХ
КОРИАНДРА 66
Динамика содержания ДНК в ядрах микроспор и пыльцевых зерен в процессе их развития 67
Накопление РНК и общего белка в цитоплазме микроспор и пыльцевых зерен 77
Накопление запасных веществ в микроспорах и пыльцевых зернах 83
ГЛАВА 5. ИЗМЕНЕНИЕ ОБЪЕМОВ КЛЕТОК, ЯДЕР И ЯДРЫШЕК В
ПРОЦЕССЕ РАЗВИТИЯ МИКРОСПОР И ПЫЛЬЦЕВЫХ ЗЕРЕН
КОРИАНДРА 90
Изменение объема ядер в развивающихся микроспорах и пыльцевых зернах 90
Изменение объема клеток и ядерно-клеточного отношения в ходе дифференцировки микроспор
и пыльцевых зерен 99
Стр.
5.3. Динамика изменения объема ядрышка и ядрышко-
ядерного отношения в процессе развития микро
спор и пыльцевых зерен 103
ГЛАВА 6. КРИТИЧЕСКИЕ ПУНКТЫ РАЗВИТИЯ МИКРОСПОР И
ПЫЛЬЦЕВЫХ ЗЕРЕН КОРИАНДРА 109
ГЛАВА 7. ИНДУКЦИЯ АНДРОГЕННОГО РАЗВИТИЯ ПРИ КУЛЬТИВИРО
ВАНИИ ПЫЛЬНИКОВ И ИЗОЛИРОВАННЫХ МИКРОСПОР
КОРИАНДРА 122
7.1. Цитологические особенности индукции и первых
этапов андрогенного развития пыльцевых
зерен кориандра 123
7.2. Исследование действия предобработки на
индукцию андрогенного развития у кориандра.. 135
Влияние состава питательной среды на андро-генное развитие пыльцевых зерен кориандра... 148
Влияние стадии развития пыльника,физиологического состояния и генотипических особенностей донорных растений на развитие андроген-
ных пыльцевых зерен кориандра 158
7.5. Влияние некоторых условий культивирования
пыльников и изолированных микроспор на раз
витие андрогенных пыльцевых зерен 171
ОБСУЖДЕНИЕ ' 185
ВЫВОДЫ 198
ЛИТЕРАТУРА 201
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 233
ПРИЛОЖЕНИЯ 234
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время в селекции, помимо традиционных методов отбора и гибридизации, широко используют полиплоидию, искусственный мутагенез, ЦМС и гаплоидию. Широкое внедрение этих методов в селекционную практику требует их глубокого всестороннего исследования. На ХХУІ съезде КПСС, а также майском /1982 г./ Пленуме ЦК КПСС подчеркивалась необходимость укрепления теоретической базы селекции для успешного выведения высокопродуктивных сортов растений.
Одним из новых методов, который интенсивно внедряется в селекционные программы, является метод экспериментального андрогене-за, то есть получение гаплоидов в культуре пыльников и изолированных микроспор. Возможность быстрого выявления мутаций на основе гаплоидных растений, а также получение в короткие сроки гомозиготных линий при их диплоидизации - делает этот метод чрезвычайно привлекательным для селекционеров. Кроме того, исследование андро-генеза в культуре пыльников имеет важное теоретическое значение при решении многих вопросов генетики, цитологии, физиологии.
Метод экспериментального андрогенеза возник сравнительно недавно, начиная с работ Гуха и Махешвари / Guha, Maheshwari, 1964,1967/. Однако он быстро развивается и в настоящее время гаплоидные растения в культуре пыльников получены более чем у 20 видов культурных растений и уже практически используются в аналитической селекции рапса, табака, тритикале, риса, ячменя и пшеницы /Ницше, Венцель,1980/. Вместе с тем у многих видов растений попытки получения андрогенных гаплоидов оказались безуспешны. Неудачи, с которыми сталкиваются исследователи при индукции андрогенеза, есть прежде всего результат недостаточного знания регуляторных
5 систем, направляющих микроспоры по пути андрогенного развития. Для разработки метода экспериментального андрогенеза необходимо исследовать закономерности индукции андрогенного развития и влияния на этот процесс различных факторов, действие которых очень видоспецифично, - предобработки, стадии эксплантации, времени года и условий выращивания донорных растений, питательной среды, условий культивирования пыльников и некоторых других. Выяснение механизмов индукции андрогенеза и разработка методов направленного влияния на метаболизм микроспор с целью получения андрогенных гаплоидов зависят от глубины познания закономерностей дифференцировки мужского гаметофита in situ . Это связано с тем, что необходимо установить тот критический период в развитии микроспоры, характеризующийся определенными физиолого-биохимическйми событиями, когда возможно осуществить переключение ее развития на путь андрогенеза. В настоящее время многие вопросы развития мужского гаметофита, которые могут быть связаны с индукцией андрогенеза, изучены пока недостаточно и лишь на примере нескольких видов. Сюда следует отнести вопросы биохимической дифференцировки на уровне нуклеиновых кислот и белков, ядерно-цитоплазматических взаимоотношений и в особенности критических событий в развитии микроспор. Поэтому первый этап исследований, связанных с индукцией андрогенных гаплоидов, предполагает изучение особенностей нормального развития клеток мужского гаметофита в естественных условиях.
Объектом данной работы является Кориандр / Coriandrum sativum L. / - основная эфиромасличная культура в СССР. Сорта кориандра характеризуются высокой гетерозиготностью по основным хозяйственно-ценным признакам, обусловленной перекрестным способом опыления. Получение чистых линий путем самоопыления является доволь-
но длительным и трудоемким процессом. Разработка метода получения андрогенных гаплоидов у кориандра диктуется необходимостью создания гомозиготных линий для гетерозисной селекции и ускорения процесса выведения сортов, отвечающих современным требованиям производства. Сведений о культивировании пыльников с целью индукции андрогенеза у этого вида и у других видов семейства зонтичных в литературе не имеется. Имеющиеся в литературе сведения о развитии микроспор и пыльцевых зерен кориандра ограничены морфологическими характеристиками, что недостаточно для изучения механизмов андро-генного развития. В связи с этим, для того, чтобы разработать метод получения гаплоидов у этого растения, необходимо изучить цитологические и физиолого-биохимические особенности развития микроспор и пыльцевых зерен in situ , а также первые этапы андроген-ного развития в культуре пыльников и изолированных микроспор.
Цель и задачи исследований. Целью наших исследований было: изучить особенности дифференцировки микроспор кориандра in situ и найти пути экспериментального воздействия на их развитие для индукции андрогенных гаплоидов. Предполагалось решить следующие задачи:
Выявить критические пункты в развитии микроспор и пыльцевых зерен, прохождение которых обусловливает их необратимую диф-ференцировку.
Выяснить закономерности накопления нуклеиновых кислот, белков и запасных веществ в микроспорах и пыльцевых зернах, связанные с прохождением критических пунктов.
3.Изучить цитоморфологические особенности развития микроспор и пыльцевых зерен in situ в связи с процессами дифференцировки мужского гаметофита.
4. Исследовать цитологические особенности пыльцевых зерен
in vitro , а также влияние ряда факторов на индукцию и дальнейшее развитие андрогенных пыльцевых зерен: предобработки, стадии развития пыльника, времени года, условий выращивания и генотипа донорных растений, питательной среды, условий культивирования пыльников и разработать экспериментальные методы индукции андро-генного развития.
В процессе микроспоро- и гаметогенеза мы изучали те этапы развития мужского гаметофита, на которых в соответствии с существующими литературными данными может произойти индукция андроген-ного развития. Этот период охватывает развитие спорогенных клеток, начиная с тетрад микроспор до сформировавшихся двуклеточных пыльцевых зерен. При этом, наряду с морфологической характеристикой развития микроспор и пыльцевых зерен, изучались особенности накопления нуклеиновых кислот и белков, а также пито- и кариометриче-ские параметры как показатели функциональной активности клеток мужского гаметофита. Для установления критических пунктов диффе-ренцировки микроспор применялся метод культуры изолированных пыльников и бутонов. Предпринята попытка индуцировать андрогенное развитие микроспор кориандра в культуре пыльников и изолированных микроспор.
Теоретическая и практическая значимость работы. В работе впервые выявлены биохимические и морфометрические особенности диффе-ренцировки микроспор и пыльцевых зерен двух сортов кориандра, а также критические пункты их развития. Установлена репликация ДНК в ядре вегетативной клетки и показано увеличение содержания цитоплазма ти чес кой РНК и белков на определенных этапах развития пыльцевого зерна. Полученные результаты представляют интерес для понимания процесса микроспоро- и гаметогенеза у кориандра, а также у других растений, имеющих трехклеточный мужской гаметофит.
Показана возможность индукции андрогенного развития у кориандра и изучено влияние на него ряда факторов: условий выращивания растений-доноров, времени года, стадии развития пыльников, предобработки, генотипических особенностей растений, состава питательной среды и условий культивирования пыльников. Данное исследование расширяет представления об общих закономерностях и механизмах индукции андрогенеза у растений, а также является первым этапом разработки метода получения андрогенных гаплоидов у кориандра. На основании проведенной работы предлагается методика получения андрогенных эмбриоидовв культуре пыльников кориандра.
Основные положения диссертационной работы, вынесенные на защиту:
Синтез ДНК в микроспорах кориандра имеет двухэтапный характер и в пыльцевых зернах осуществляется как в ядре генеративной, так и вегетативной клеток.
в микроспорах кориандра максимальное содержание РНК, белков и липидов, а также объем ядра, ядрышка и ядрышко-ядерное отношение установлено в поздней интерфазе.
Образование вегетативной и генеративной клеток детерминируется в поздней интерфазе микроспор, а программирование их дальнейшей постмитотической дифференцировки завершается на стадии молодых двуклеточных пыльцевых зерен.
Оптимальной для индукции андрогенеза у кориандра является стадия поздней интерфазы микроспор, характеризующаяся нестабильностью дифференцировки и высокой метаболической активностью.
На индукцию андрогенного развития у кориандра достоверно влияют генотипические особенности и условия выращивания донорных растений, холодовая предобработка, стадия изоляции, время года,
9 состав питательной среды и условия культивирования пыльников и микроспор,
- Установлены оптимальные условия индукции и изучены первые этапы андрогенного развития кориандра.
Работа выполнена в лаборатории экспериментальной биологии ВНИИЭМК /г.Симферополь/ в течение І978-І98І гг. в соответствии с планом научно-исследовательских работ института по теме 01.30 иРазработать методы и получить андрогенные гаплоиды эфиромаслич-ных культур /кориандра, шалфея, лаванды/ с целью создания генофонда и интенсификации селекционного процесса" / № госрегистрации 81095790/.
