Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы и
1.1. Множественность форм протеасом, их структурная организация и физиологическая роль
1.1.1. 20S-npoTeacoMbi 12
1.1.2. 268-протеасомы 15
1.1.3. Смешанные или «гибридные» протеасомы 20
1.1.4. Иммунные протеасомы и их роль в иммунном ответе 21
1.2. Протеасомы в развитии животных 34
1.3. Система полиубиквитинирования белков 35
1.4. Сигналы убиквитинзависимой деградации белков 38
1.5. Изменения убиквитинзависимого протеолиза, связанные со злокачественной трансформацией 40
ГЛАВА 2. Материалы и методы
2.1. Животные и реактивы, используемые в работе 42
2.2. Препаративное выделение протеасом 43
2.2.1. Получение осветленного гомогенета и фракционирование протеасом сульфатом аммония 44
2.2.2. Гель-фильтрация на сефарозе 2В и
ультрацентрифугирование 45
2.3. Аналитическое выделение протеасом 46
2.4. Определение активности протеасом 47
2.5. Иммуноблоттинг 48
2.6. Получение 35[8]ОДК 48
2.7. Гистологическое исследование селезенки 50
ГЛАВА 3. Результаты
3.1. Разработка метода разделения пулов 26S- и 208-протеасом 52
3.2. Особенности формирования пулов 26S- и 208-протеасом в селезенке и печени крысы в постнатальном развитии 58
3.2.1. Изменение удельной активности и субъединичного состава пулов 26S- и 208-протеасом в селезенке и печени на 1, 5, 9, 12, 15, 23, 37 и 90 сутки развития крысы 59
3.2.2. Динамика появления иммунных субъединиц в пулах 26S- и 20S- протеасом в селезенке и печени крысы в постнатальном развитии 64
3.2.3. Динамика изменения удельной активности пулов 26S- и 208-протеасом в постнатальном развитии 65
3.2.4. Оценка количества протеасом в пулах 26S и 20S в селезенке и печени крысы в постнатальном развитии 68
3.3. Развитие белой пульпы селезенки в онтогенезе крысы 72
3.4. Особенности пула протеасом в клетках асцитной карциномы Krebs-II мыши 75
3.4.1. Пул 268-протеасом в селезенке, печени, легких и асцитной карциноме Krebs-II мыши 75
3.4.2. Пул 208-протеасом в селезенке, печени, легких и асцитной карциноме Krebs-II мыши 80
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов
4.1. Особенности формирования пула 26S- и пула 208-протеасом в печени и селезенке крысы в постнатальном развитии 84
4.2. Формирование иммунных протеасом и вторичных лимфоидных органов (селезенки) крысы в постнатальном развитии 87
4.3. Особенности пула протеасом в злокачественно трансформированных клетках 88
4.3.1. Иммунные протеасомы злокачественных клеток 88
4.3.2. Конститутивные 268-протеасомы злокачественных клеток 91
4.3.3. 208-протеасомы злокачественных клеток 92
Заключение 93
Выводы 95
Список литературы
- Смешанные или «гибридные» протеасомы
- Получение осветленного гомогенета и фракционирование протеасом сульфатом аммония
- Особенности формирования пулов 26S- и 208-протеасом в селезенке и печени крысы в постнатальном развитии
- Формирование иммунных протеасом и вторичных лимфоидных органов (селезенки) крысы в постнатальном развитии
Введение к работе
Актуальность темы.
Протеасомы - это мультисубъединичные и мультикаталитические протеиназные комплексы эукариотических клеток (Multicatalytic Proteinase Complex, МРС). Термин «протеасома» был предложен К. Танака и А. Голдбергом и отражает как протеолитическую (протеаза) функцию комплекса, так и его природу как дискретной частицы - сомы.
Клетки млекопитающих и человека содержат несколько форм и субтипов протеасом. Наиболее изученными формами являются 26S- и 20S-протеасомы. 268-протеасомы состоят из 208-субчастицы -протеолитического «ядра» - и фланкирующих ее 198-субчастиц. Они гидролизуют убиквитинированные белки в АТФ-зависимой реакции. 20S-протеасомы, помимо того, что являются протеолитическим «ядром» 26S-протеасом, способны, как самостоятельные частицы, гидролизовать некоторые белки без их предварительного убиквитинирования независимо от АТФ. Каждая из этих форм образована четырьмя субтипами, различающимися сочетанием конститутивных и иммунных протеолитических субъединиц.
Конститутивные 268-протеасомы участвуют в регуляции клеточных процессов, таких как репликация и репарация ДНК, транскрипция, передача сигналов, клеточный цикл, апоптоз, поскольку гидролизуют белки, осуществляющие эти процессы, строго контролируемым способом. Иммунные 268-протеасомы необходимы для развития иммунного ответа. Функции всех субтипов 20S-npOTeacoM связаны, главным образом, с уничтожением поврежденных белков.
Принимая во внимание неоднозначную роль протеасом в многочисленных клеточных процессах, можно ожидать, что на разных
этапах онтогенеза животных функции клеточного пула протеасом меняются, причем по-разному в различных органах и тканях. Литературные данные об изменениях пула протеасом в индивидуальном развитии животных малочисленны и разрозненны. Совсем нет сведений о функционировании протеасом в постнатальном развитии млекопитающих, сопряженном с интенсивными биохимическими и физиологическими перестройками организма. Исследования в этой области могут расширить представление о молекулярных механизмах онтогенеза и содействовать пониманию причин как врожденных, так и приобретенных заболеваний (в том числе злокачественных), связанных с нарушениями системы гидролиза белков в протеасомах.
Цели и задачи исследования.
Целью настоящей работы явилось исследование изменения пула 26S-и пула 208-протеасом в печени (нелимфоидном органе) и селезенке (лимфоидном органе) крысы в постнатальном развитии и в клетках асцитной карциномы Krebs-II мыши.
Для достижения поставленной цели требовалось решить следующие задачи:
Разработать метод разделения пулов 26S- и 208-протеасом для их сравнительного анализа в различных органах.
Изучить активность химотрипсинподобных центров и относительное количество протеасом в пулах 26S и 20S в селезенке и печени крысы в постнатальном развитии.
Исследовать динамику появления иммунных субъединиц LMP7 и LMP2 в пулах 26S- и 208-протеасом в селезенке и печени крысы.
Изучить динамику формирования периартериальных
лимфоидных оболочек (муфт) белой пульпы селезенки крысы.
5. Сравнить активность, состав и относительное количество протеасом в пулах 26S и 20S в клетках асцитной карциномы Krebs-II мыши с таковыми в клетках легких здоровых животных.
Научная новизна.
В работе впервые продемонстрирована возможность аналитического изучения нативных пулов 26S- и 20Б-протеасом в различных органах млекопитающих, проведено детальное исследование этих пулов в первые три недели постнатального развития в печени и селезенке крысы и прослежена динамика формирования в этих органах иммунных протеасом, выявлены особенности пула 26S-npoTeacoM в опухоли.
Научная и практическая значимость работы.
Полученные результаты свидетельствуют о появлении иммунных протеасом в лимфоидных (селезенке) и нелимфоидных органах (печени) в разные сроки в течение нескольких недель после рождения и отвечают на существующий до сих пор вопрос иммунологов, почему в эмбриональном и раннем постнатальном развитии млекопитающих при наличии Т- и В-лимфоцитов нет полноценного иммунного ответа. Не менее важным в понимании развития иммунной системы млекопитающих является и установленный нами факт, что формирование четких периартериальных лимфоидных оболочек белой пульпы селезенки совпадает в сроках постнатального развития с появлением иммунных протеасом в печени. Он позволяет понять механизм складывающихся в организме взаимоотношений лимфоидных и находящихся под их защитой
нелимфоидных органов. Полученные результаты раскрывают новые перспективы в изучении развития иммунной системы в онтогенезе млекопитающих, которое следует рассматривать не только как созревание и миграцию клеток иммунной системы, но и как образование иммунных протеасом во всем организме.
Проведенная нами работа по изучению особенностей пулов 26S- и 20S-npoTeacoM в клетках асцитной карциномы Krebs-II мыши дала результаты, которые представляют ценность для фундаментальной науки и со временем могут найти применение в практической медицине.
Работа полностью выполнена в Институте биологии развития им. Н.К, Кольцова РАН и поддержена Российским фондом фундаментальных исследований (гранты № № 03-04-49127, 06-04-48229).
Публикация результатов исследования и апробация работы.
Материалы диссертации апробированы на коллоквиумах лаборатории биохимии Института биологии развития им, Н.К.Кольцова РАН; Школе для молодых ученых, Научная биологическая станция Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН «Кропотово», июнь 2005 г.; 15-ом Международном конгрессе биологов развития, Австралия, сентябрь 2005 г.; конференции «Молекулярные механизмы процессов онтогенеза: эмбриогенез, геномы, эволюция», Москва, май 2006 г.; VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов», Москва, апрель 2007 г.
По материалам диссертации опубликовано четыре статьи и двое тезисов, одна статья и одни тезисы находятся в печати.
Смешанные или «гибридные» протеасомы
В смешанных, или «гибридных» 268-протеасомах один из двух активаторов РА700 замещен на активатор РА28 (11S) или РА200 (Rechsteiner, Hill, 2005; Cascio et al., 2002; Goldberg, 2007). PA28 -белковый комплекс, состоящий из семи субъединиц с молекулярной массой около 28 кДа каждая. Мультисубъединичная организация белка РА28 выражена в двух комбинациях: гетерогептамерной из трех а28- и четырех Р28-субъединиц и гомогептамерной из семи у28-субъединиц (Rechsteiner, Hill, 2005). Белок РА200 представляет собой единственный полипептид с молекулярной массой 200 кДа. Механизм действия РА28 и РА200 связан с открыванием канала, ведущего в протеолитическую камеру (Rechsteiner, Hill, 2005). Однако они не принимают участия во взаимодействии с убиквитинированными субстратными белками, поэтому роль их не совсем понятна, в отличие от активатора РА700. Предполагается, что РА28 и РА200 выполняют функции адапторов, определяя внутриклеточную локализацию протеасом. Комплекс РА28оф может играть определенную роль в иммунном ответе (см. главу «Иммунные протеасомы и их роль в иммунном ответе»).
Иммунные протеасомы. При определенных условиях, например, под действием у-интерферона (ИФу), основного иммуномодуляторного цитокина, в клетках образуются каталитические субъединицы, отличные от конститутивных и замещающие их в протеолитическом «ядре» протеасом (Rock, Goldberg, 1999). Они получили название иммунных субъединиц, а протеасомы, их содержащие, - иммунных протеасом. Замена конститутивных субъединиц на иммунные происходит в процессе сборки новых протеасом, при этом конститутивная X (05) субъединица заменяется на иммунную субъединицу LMP7 (05І), конститутивная Y (01) субъединица - на иммунную LMP2 (01 і) и конститутивная Z (02) субъединица - на иммунную LMP10, или MECL1 (32i). Субъединицы LMP2 и LMP10, как правило, встраиваются совместно, но независимо от LMP7. Включение LMP7 во вновь образующуюся протеасому, хотя и облегчается наличием LMP2 и LMP10, но может осуществляться и в их отсутствие (Groettrup et al., 1997; Griffin et al., 1998). В результате в клетках образуются три разновидности иммунных протеасом: протеасомы, содержащие все ИФу-индуцируемые каталитические субъединицы; протеасомы, содержащие субъединицы LMP2 и LMP10; протеасомы, обладающие только LMP7 (Dahlmann et al., 2000).
Таким образом, 268-протеасомы в клетках млекопитающих представлены четырьмя субтипами - конститутивными протеасомами и тремя формами иммунных (рис. 2). Конститутивные протеасомы регулируют уровень внутриклеточных белков, в то время как функции иммунных протеасом связаны с иммунным ответом.
Роль иммунных протеасом в представлении антигенных эпитопов Т-киллерам. Биологический диапазон действия иммунитета не ограничивается только защитой от инфекций, вызываемых патогенными микроорганизмами. Ежедневно в соматических клетках млекопитающих и человека возникает множество мутаций, которые могут привести к различным заболеваниям, в том числе и к образованию злокачественных опухолей. Иммунная система осуществляет постоянный контроль за качеством клеток, своевременно уничтожая те, которые экспрессируют продукты измененных (мутировавших) или чужеродных (вирусных) генов. Концепция иммунного надзора была сформулирована в 70-е годы известным австралийским ученым Ф.Бернетом (Burnet, 1971). Согласно этой концепции, главную роль в распознавании и уничтожении клеток, несущих аномальную или чужеродную генетическую информацию, играет Т-клеточное звено иммунной системы. В последнее десятилетие достигнут значительный прогресс в исследовании механизмов, позволяющих цитотоксическим Т-лимфоцитам, или Т-киллерам, распознавать дефектные клетки и вызывать их апоптоз (Rock, Goldberg, 1999; Ярилин, 1999; Галактионов, 2004). Начальное событие в этом многоступенчатом процессе - выявление в клетках генетически чужеродного продукта, его гидролиз и представление цитотоксическим Т-лимфоцитам. Мутантные или вирусные белки выявляют многочисленные ЕЗ-убиквитин-протеин-лигазы, маркирующие белки убиквитином для селективного гидролиза. Убиквитиновая метка делает их субстратами 268-протеасом. При этом белки расщепляются как конститутивными, так и иммунными протеасомами. Скорость гидролиза обеими формами протеасом сравнима, но существенно различается спектр образующихся олигопептидов: под действием иммунных протеасом в несколько раз возрастает выход олигопептидов длиной 8-11 аминокислотах остатков с «правильным» С концом, содержащим остатки гидрофобных аминокислот или аргинина (Shimbara et al., 1997; Cascio et al., 2001; Toes et al., 2001). Более длинные олигопептиды, образуемые иммунными протеасомами, укорачиваются до нужной длины под действием аминопептидаз (Dahlmann, 2005; Strehl et al., 2005). Олигопептиды такой длины соответствуют размерам антигенных эпитопов (Ярилин, 1999; Галактионов, 2004).
В ряде случаев антигенные эпитопы образуются не только с помощью иммунных протеасом, но и под влиянием активатора РА28ар\ входящего в состав смешанных протесом (Rechsteiner, Hill, 2005). При этом выход антигенных эпитопов увеличивается даже при наличии в протеасомах только конститутивных каталитических субъединиц. Механизм этого явления пока не понятен, но предполагается, что РА28ар\ раскрывая в протеасоме канал, ускоряет выход в цитоплазму олигопептидов. Это, по-видимому, предохраняет потенциальные антигенные олигопептиды от дальнейшего расщепления в протеолитической камере.
Поскольку рецептор цитотоксических Т-лимфоцитов взаимодействует только с комплексом антигенный пептид-белки ГКГ (главного комплекса гистосовместимости) класса I, антигенный олигопептид соединяется в цитоплазме с белками-транспортерами ТАРІ и ТАР2 (Transporter Associated with Antigen Presentation), которые переносят его в эндоплазматическую сеть, где он связывается с молекулами ГКГ класса I (Janeway, Travers, 1994; Rock, Goldberg, 1999; Ярилин, 1999; Галактионов, 2004). Молекулы ГКГ класса I представляют собой белковый димер, образованный а и р-цепями. Домены а-цепи формируют замкнутую с обоих концов щель Бьоркмана, которая по длине соответствует 8-9 аминокислотным остаткам. В случае незначительного превышения этой длины антигенный олигопептид выбухает из щели, образуя арку, поскольку место для него ограничено и оба его конца фиксированы. Комплекс молекул ГКГ класса I и антигенного олигопептида выносится на поверхность клетки в составе трансмембранного пузырька и является своеобразным «флажком, сигналящим о бедствии» (рис. 3). Цитотоксические Т-лимфоциты (Т-киллеры) распознают «флажки бедствия» на дефектных клетках-мишенях, контактируя с комплексом молекул ГКГ класса I и антигенного олигопептида с помощью рецептора и корецептора CDS. Помимо этого, интегрины Т-киллеров взаимодействуют с соответствующими рецепторами клеток-мишеней и стабилизируют межклеточные контакты. После такого сложного межклеточного взаимодействия Т-киллеры выделяют в межклеточное пространство мономеры белка перфорина и сериновые протеазы - гранзимы. Под воздействием перфорина в плазматической мембране клетки-мишени формируются поры, через которые внутрь клетки поступают гранзимы, запускающие путем активации каспаз цепочку реакций, приводящих к апоптозу (Janeway, Travers, 1994; Ярилин, 1999). Кроме того, Т-киллеры экспрессируют Fas-лиганд, взаимодействующий с Fas-рецептором клетки-мишени. На внутриклеточной части Fas-рецептора присутствует так называемый домен гибели (DD), с которым связана молекула FADD. В результате взаимодействия Fas-лиганда и Fas-рецептора FADD запускает сигнал, приводящий к развитию апоптоза (рис. 4).
Получение осветленного гомогенета и фракционирование протеасом сульфатом аммония
Печень (5г) взрослых крыс промывали стандартным физиологическим фосфатным солевым буфером (0,1 М фосфатный буфер с 0,9% NaCl, рН 7,5), измельчали ножницами и гомогенизировали в гомогенизаторе типа "Braun Melsungen" (стекло-стекло) в 15 мл буфера 1 (10 ходов пестика). Гомогенат центрифугировали сначала при 2000 g в течение 15 мин на центрифуге К-23 и затем при 105000 g в течение 1 ч на ультрацентрифуге L7-55 (Beckman, США) в роторе SW-41.
К осветленному гомогенату добавляли фосфокреатин (10 мМ) и фосфокреатинкиназу (10 мкг/мл) и инкубировали при 35С в течение 45 мин для АТФ-зависимого восстановления структуры 268-протеасом из 20S- и 198-субчастиц.
Белки осветленного гомогената фракционировали с помощью сульфата аммония в два этапа. Фракцию, обогащенную 268-протеасомами, получали добавлением сульфата аммония, взятого до 40% от насыщения, фракцию 20S- протеасом - добавлением сульфата аммония, взятого до 70% от насыщения. Сульфат аммония до 40%» от насыщения вносили порциями в течение 20 мин на магнитной мешалке. После полного растворения сульфата аммония препарат перемешивали еще в течение 20 мин до выпадения хлопьев белка, затем центрифугировали при 12500 об/мин на настольной центрифуге Heraeus (ФРГ) в течение 20 мин. Осадок (фракция 0-40%о) растворяли в 3 мл буфера 2 и подвергали гель-фильтрации на сефарозе 2В. К полученной надосадочной жидкости добавляли сульфат аммония до 70% от насыщения. Процедуру высаливания проводили, как указано выше. Осадок (фракция 40—70%) растворяли в 3 мл буфера 3 и подвергали гель-фильтрации на сефарозе 2В.
Колонку (1,5x72 см) набивали сефарозой-2В в буфере 2, в котором количество глицерина было увеличено до 60%). При промывке колонки количество глицерина постепенно снижали до 20%. Гель-фильтрацию белков во фракции 0-40% и фракции 40-70% осуществляли последовательно со скоростью 8 мл/ч. Гель-фильтрацию белков фракции 0-40%) проводили в буфере 2, затем колонку промывали буфером 3 и проводили гель-фильтрацию белков фракции 40-70% в буфере 3. В обоих случаях собирали аликвоты по 4 мл, в которых измеряли количество белка по методу Лоури (Lowry et al., 1951), а также с помощью увикорда (LKB Bromma, Швеция) по поглощению при длине волны 280 нм и анализировали активность протеасом. Аликвоты, полученные после гель-фильтрации белков фракции 0-40% и содержащие протеасомы, объединяли по три и подвергали высокоскоростному центрифугированию на ультрацентрифуге L7-55 в роторе SW-50.1 при 240000 g в течение 7 ч. В этих условиях протеасомы осаждаются благодаря своей высокой молекулярной массе. Осадки растворяли в 75 мкл буфера 4 каждый и хранили при -20С.
При исследовании пулов 26S- и 208-протеасом в ходе постнатального развития крысы (от 1-х до 90-х суток) печень и селезенку (по 0,6 г) гомогенизировали в гомогенизаторе типа «Braun Melsungen» (стекло-стекло) в 5 мл буфера 5 (10 ходов пестика). Полученный гомогенат осветляли центрифугированием сначала при 2000 g в течение 15 мин на центрифуге К-23 и затем при 105000 g в течение 1 ч на ультрацентрифуге L7-55 (Beckman, США) в роторе SW 50.1. Фракционирование осветленного гомогената сульфатом аммония проводили, как описано выше. Фракцию 0-40% растворяли в 250 мкл буфера 6, фракцию 40-70% растворяли в 250 мкл буфера 7 и проводили определение активности протеасом и иммуноблоттинг.
При изучении пулов протеасом в здоровых органах мыши и в злокачественно трансформированных клетках карциномы Krebs-II печень, селезенку и легкие (по 0,6 г) здоровых мышей гомогенизировали в гомогенизаторе типа «Braun Melsungen» (стекло-стекло) в 5 мл буфера 5 (10 ходов пестика). Клетки асцитной карциномы отделяли от асцитной жидкости центрифугированием при 1000 g в течение 10 мин, промывали физиологическим солевым фосфатным буфером и повторно центрифугировали в тех же условиях; 0,6 г клеток гомогенизировали в 5 мл буфера 5 (100 ходов пестика).
Особенности формирования пулов 26S- и 208-протеасом в селезенке и печени крысы в постнатальном развитии
Активность пула 26S- и пула 20S-npomeacoM определяли по гидролизу флуорогенного олигопептида Suc-LLVY-AMC, утилизирующегося химотрипсинподобными центрами обоих пулов протеасом. Для исключения вклада примесных протеолитических активностей применяли ингибитор протеолитических центров протеасом -MG132. Окончательные расчеты проводили по разнице между полной и остаточными активностями в присутствии 5 мкМ MG132.
Этот ингибитор не является строго специфическим по отношению к протеасомам, поскольку также подавляет активность кальпаинов. Однако известно, во-первых, что субстратами кальпаинов являются белки, но не короткие олигопептиды, во-вторых, in vitro они проявляют активность в присутствии высокой концентрации Са2+ (3 мМ) (Немова, Бондарева, 2005). Мы проверили возможность гидролиза олигопептида Suc-LLVY-АМС кальпаином II в наших экспериментах (т.е. в отсутствие Са ), а также в присутствии 3 мМ Са2+. Ни в том, ни в другом случае кальпаин активность не проявлял. Поэтому мы сочли возможным использовать MG132 в качестве селективного ингибитора протеасом.
Результаты измерений представлены на рис. 10, где видно, что активность как пула 268-протеасом (а), так и пула 208-протеасом (б), полученных из селезенки (1) и печени (2), изменяется в ходе развития. Так, к 5-м суткам отмечается постепенное падение активности в селезенке (рис. 10а, график 1) и незначительное увеличение активности в печени (рис. 10а, график 2) пула 268-протеасом и увеличение активности как в селезенке (рис 106, график 1), так и в печени (рис. 106, график 2) пула 20S протеасом. К 9-12 суткам развития наблюдается спад активностей обоих пулов протеасом в этих органах. К 37 суткам развития активность пулов в обоих органах возрастает, причем активность пула 268-протеасом увеличивается приблизительно в 1,5 раза, а пула 208-протеасом приблизительно в 4 раза. К 90-м суткам развития активность пула 268-протеасом практически не изменяется в селезенке, а в печени возрастает еще в 1,5 раза. Активность же пула 20Б-протеасом в исследуемых органах на этой стадии развития снижается.
Таким образом, в характере изменений активности протеасом наблюдается, во-первых, общая тенденция к увеличению активности как пула 26S-, так и пула 208-протеасом в обоих исследуемых органах взрослых крыс по сравнению с животными первых суток развития.
Во-вторых, обнаружено снижение активности обоих пулов протеасом и в печени, и в селезенке у 9-12-суточных животных.
В-третьих, для всех исследованных возрастов крысы (от 1 сут до 3 мес) активность каждого из этих двух пулов в печени практически близка к его активности в селезенке на той же стадии развития. В литературе есть зданные о примерно сходной общей активности протеасом в печени и селезенке, но только для взрослых крыс (Farout et al., 2000).
В-четвертых, активность пула 268-протеасом при измерении по гидролизу олигопептидов приблизительно на порядок ниже активности пула 20S.
Как следует из рис. 11А и 12A, Rpt6 выявляется в пуле 268-протеасом (нечетные дорожки), но не в пуле 208-протеасом (четные дорожки). И в селезенке (рис, 11), и в печени (рис, 12) пул 26S-npoTeacoM присутствует на всех исследованных сроках постнатального развития. Иммунная субъединица LMP2 в обоих органах отсутствует в первые несколько суток постнатального развития (рис. 11Б и 12Б) и обнаруживается в селезенке в период между 5-ми и 9-ми сут (рис. 11Б), а в печени только между 15-ми и 23-ми сут. Обращает внимание и то, что LMP2 в обоих органах обнаруживается как в пуле 26S-, так и в пуле 208-протеасом.
Результаты проведенной работы определили дальнейший ход исследований. Поскольку известно, что время полужизни протеасом составляет 12-15 суток (Tanaka, Ichihara, 1989), мы предположили, что к 9-м сут постнатального развития крыс запасенные до рождения пулы протеасом истощаются, после чего протеасомы синтезируются вновь. Логично также было предположить, что еще через 12 сут происходит следующая смена пулов протеасом. Поэтому на следующем этапе мы изучали пулы 26S- и 208-протеасом печени и селезенки крыс более детально.
Замена конститутивных субъединиц на иммунные происходит во вновь образующихся протеасомах при определенных условиях, например, под воздействием у-интерферона (Rock, Goldberg, 1999). При этом конститутивные Х(Р5), Y (pi) и Z(P2) каталитические субъединицы замещаются на LMP7 (p5i), LMP2 (pii) и LMPIO (p2i) иммунные субъединицы. Субъединицы LMP2 и LMP10 встраиваются совместно, но независимо от LMP7. Включение LMP7, хотя и облегчается наличием LMP2 и LMP10, но может осуществляться и без них. Таким образом, в пулах протеасом могут формироваться множественные субтипы иммунных протеасом.
Содержание иммунных субъединиц LMP7 (30 кДа) и LMP2 (23 кДа) в пулах протеасом селезенки и печени исследовали с помощью Вестерн-блоттинга с использованием поликлональных антител к этим субъединицам (рис. 13). По содержанию субъединицы LMP2 судили и о содержании включающейся вместе с ней субъединицы LMP10. Обе иммунные субъединицы, LMP7 и LMP2, выявляются данным методом в заметном количестве в селезенке на 7-е постнатальные сутки (рис. 13, блоты 1-4), причем как в пуле 268-протеасом (рис. 13, блоты 1, 3), так и в пуле 208-протеасом (рис. 13, блоты 2, 4). В печени же обе субъединицы выявляются в незначительном количестве только на 17-е сутки постнатального развития (рис. 13, блоты 5-8), на 19-е сутки содержание их возрастает и, как в селезенке, они входят в состав и 26S-npOTeacoM (рис. 13, блоты 5, 7), и 208-протеасом (рис. 13, блоты 6, 8).
Формирование иммунных протеасом и вторичных лимфоидных органов (селезенки) крысы в постнатальном развитии
Клетки иммунной системы созревают уже в ходе эмбрионального развития. У крыс предшественники В-лимфоцитов появляются в эмбриональной печени к 17-м сут и превращаются в В-лимфоциты, несущие на своей поверхности IgM (иммуноглобулины класса М), к 19-м сут (Van Rees et al., 1990). Относительно зрелые Т-лимфоциты обнаруживаются в эмбриональном тимусе крыс еще раньше - с 15-16-х сут. Однако функциональная активность Т- и В-лимфоцитов в эмбриональном и раннем постнатальном развитии выражена еще слабо. С одной стороны, данный факт можно объяснить незавершенной миграцией лимфоцитов во вторичные лимфоидные органы. Например, у крыс она продолжается в течение нескольких недель после рождения (Van Rees et al., 1990; Ярилин, 1999). С другой стороны, очевидно, что полноценный иммунный ответ невозможен без формирования всех компонентов, участвующих в развитии иммунных реакций. Полученные нами результаты, которые указывают на появление иммунных протеасом в печени и селезенке крысы в разные сроки в течение первых трех недель постнатального развития, по-видимому, объясняют причину неэффективного функционирования иммунной системы в эмбриональном и раннем постнатальном развитии.
Что же происходит с клетками иммунной системы в селезенке в этот период? На ранних стадиях развития Т- и В-лимфоциты в ней перемешаны, но в первые постнатальные дни растет количество концентрически расположенных клеток стромы в периартериальном пространстве белой пульпы, куда постепенно мигрируют Т-лимфоциты (Van Rees et al., 1990). Эта картина отражает процесс формирования в селезенке PALS-структур (Periarteriolar Lymphoid Sheath), или муфт, фактически являющихся зонами Т-лимфоцитов белой пульпы. Мы сравнили динамику формирования PALS-структур в селезенке и динамику появления иммунных субъединиц в селезенке и печени крысы. Оказалось, что четко выраженные PALS-структуры в селезенке образуются к 15-18-м сут постнатального развития, что совпадает по времени с формированием иммунных протеасом в печени. Иными словами, при возникновении дефектных клеток в печени, находящейся в зоне иммунной защиты селезенки, цитотоксические Т-лимфоциты могут перемещаться из белой пульпы селезенки с током крови и/или лимфы и уничтожать эти клетки к 17-19 сут постнатального развития. Селезенка, по всей видимости, готова к Т-клеточному иммунному ответу на более ранних этапах - к концу первой недели после рождения, когда в ней формируются иммунные протеасомы и уже присутствуют Т-лимфоциты и АПК. Способность организма к более раннему обеспечению иммунной защиты селезенки как органа иммунной системы представляется важной для становления иммунитета в целом.
В связи с известным свойством злокачественных клеток преодолевать иммуннологический контроль, наш интерес, прежде всего, был направлен на изучение уровня иммунных субъединиц в пулах протеасом в асцитной карциноме в сравнении с протеасомами здоровых органов. В норме практически все клетки (за редким исключением) млекопитающих и человека, начинающие синтезировать мутантные белки, образуют из них антигенные эпитопы с помощью иммунных протеолитически активных субъединиц протеасом с тем, чтобы представить их в комплексе с молекулами ГКГ класса 1 цитотоксическим Т-лимфоцитам. Последние распознают такой комплекс и запускают апоптоз дефектных клеток, иными словами, иммунная система не излечивает эти клетки, а уничтожает их ради выживания целого организма. Логично предположить, что в случае частичного или полного исключения иммунных субъединиц из состава протеасом, клетка могла бы потерять способность продуцировать антигенные эпитопы в достаточном количестве и, избегая контакта с цитотоксическими Т-лимфоцитами, накапливать необходимый «комплект» мутаций и, в конечном итоге, давать начало злокачественной опухоли. Действительно, с помощью иммуноблоттинга нами показано, что в асцитной карциноме Krebs-II уровень иммунной субъединицы LMP7 в 12 раз ниже, чем в контрольных клетках легких, и в 4-5 раз ниже, чем в селезенке и печени, из расчета на мг белка осветленных гомогенатов. Иммунная субъединица LMP2 в клетках асцитной карциномы, в отличие от легких, селезенки и печени, не выявлялась вовсе.
Нужно отметить, что в многочисленных клеточных линиях злокачественных опухолей грызунов и человека с помощью RT PCR-анализа исследованы уровни мРНК полипептидов, участвующих в образовании и представлении антигенных эпитопов клеткам иммунной системы, - ТАРІ, ТАР2, LMP2, LMP10, LMP7, РА28а, РА28(3 (Maeurer et al., 1996; Johnsen et al., 1998; Delp et al., 2000; Seliger et al., 2000; Matsui et al., 2002; Miyagi et al., 2003; Krishnakumar et al., 2004). В ряде клеточных линий опухолей различного гистогенеза выявлены низкие уровни мРНК (или мРНК не выявлена совсем) иммунных субъединиц протеасом и белков транспортеров ТАРІ и ТАР2, которые повышались после обработки клеток у-интерфероном. При этом в качестве внутреннего контроля использовалась мРНК Р-актина. Однако авторы этих исследований сами отмечают несоответствие результатов, полученных ими при анализе уровня мРНК иммунной субъединицы LMP2 и исследовании этой субъединицы Вестерн-блоттингом в клеточной линии почечной карциномы мыши (Seliger et al., 2000). Мы полагаем, что более корректный подход заключается в сравнении уровня и мРНК, и белка в опухолевых и контрольных клетках. Это тем более важно потому, что в разных клетках соотношение субтипов иммунных протеасом различно. Как мы показали в данной работе, в здоровых клетках легких мыши уровень субъединицы LMP2 существенно ниже уровня субъединицы LMP7. Если проводить исследование опухолей без учета особенностей контрольных клеток, можно придти к неверным выводам. Тем не менее, серия указанных статей дает основание полагать, что резкое сокращение количества иммунных субъединиц протеасом в асцитной карциноме Krebs-II мыши обусловлено скорее низким уровнем мРНК, чем подавлением их синтеза или посттрансляционными процессами. Это предположение очерчивает пути поиска механизмов, определяющих количественный уровень иммунных протеасом, в направлении исследования регуляции транскрипции генов, кодирующих иммунные субъединицы.
