Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Сателлитные клетки как тканеспецифические стволовые клетки взрослого организма 10
1.1.1. Идентификация сателлитных клеток и их концентрация в мышцах 12
1.1.2. Формирование пула сателлитных клеток 18
1.1.3. Роль генов семейства Pax 22
1.1.4. Альтернативные гипотезы происхождения мышечных сателлитных клеток в эмбриогенезе 25
1.2. Дифференцировка сателлитных клеток 27
1.2.1. Активация и асимметричное деление сателлитных клеток. Роль белкового фактора Numb 27
1.2.2. Роль факторов роста в процессе активации, пролиферации и дифференцировки сателлитных клеток 29
1.2.3. Слияние миобластов и формирование многоядерных миотуб. Роль генов семейства bHLH в регуляции миогенеза 34
1.2.4. Экспрессия мышечных генов и синтез структурных белков мышц в ходе миогенеза 36
1.2. Сходство и различия миогенеза в эмбриональном развитии и при активации сателлитных клеток 39
1.4. Роль Са в процессе дифференцировки сателлитных клеток и миобластов 40
1.5. Использование клеточных культур для изучения процессов миогенеза in vitro 42
Глава 2. Материалы и методы 45
2.1. Объект исследования 45
2.2. Получение и культивирование клеток 45
2.3. Гистологическое окрашивание 46
2.4. Приготовление криостатных срезов 47
2.5. Иммуноцитохимический анализ 47
2.6. Выделение тотальной РНК 49
2.7. Определение концентрации тотРНК в пробе 49
2.8. Выделение мРНК 50
2.8 Синтез кДНК 50
2.9. Конструирование праймеров 51
2.10. Нормировка кДНК библиотек 51
2.11. Полимеразная цепная реакция 52
2.12. Выделение ДНК из агарозного геля 53
2.13. Секвенирование 53
2.14. Подсчет количества сателлитных клеток и миобластов. Статистическая обработка результатов 54
Глава 3. Результаты исследований 55
3.1. Поведение миогенных клеток-предшественников в культуре 55
3.2. Иммуноцитохимическая характеристика культур миогенных клеток-предшественников, выделенных из мышц крыс на разных стадиях онтогенеза 59
3.3. Сравнительный анализ экспрессии генов маркеров миогенных клеток-предшественников 64
3.3.1. Исследование экспрессии гена Рах7 64
3.3.2. Иммуноцитохимический анализ экспрессии десмина и м-кадгерина 66
3.4. Влияние Са2+ на дифференцировку сателлитных клеток и одноядерных миобластов in vitro 71
3.5. Темпы дифференцировки миогенных клеток-предшествеников in vitro 74
3.5. Сравнительный анализ экспрессии генов маркеров миогенных клеток-предшественников в ходе дифференцировки 76
3.5.1. Исследование экспрессии гена Рах7 в процессе дифференцировки сателлитных клеток in vitro 76
3.5.2. Анализ экспрессия гена MyoD в процессе дифференцировки сателлитных клеток и миобластов 77
3.5.3 Анализ экспрессии гена, кодирующего м-кадгерин, в ходе дифференцировки миогенных клеток-предшественников 79
3.6. Исследование экспрессии различных изоформ тяжелых цепей миозина в процессе дифференцировки сателлитных клеток и миобластов in vitro 81
3.6.1. Иммуноцитохимический анализ экспрессии медленной и быстрых изоформ ТЦМ 81
3.6.2. Анализ экспрессии эмбриональной изоформы ТЦМ 87
3.6.3. Экспрессия перинатальной изоформы ТЦМ : 89
3.8.3. Анализ экспрессии изоформы р ТЦМ 91
3.8.4. Исследование экспрессии гена, кодирующего ТЦМ 2а 93
Глава 4. Обсуждение результатов 95
4.1. Сравнительная характеристика культур миогенных клеток-предшественников, выделенных из мышц животных на разных этапах онтогенеза 95
4.1.1. Адгезивные свойства миогенных клеток-предшественников 95
4.1.1. Экспрессия генов маркеров миогенных клеток-предшественников 99
4.2. Влияние Са~ на дифференцировку сателлитных клеток и одноядерных миобластов in vitro 103
4.3. Темпы дифференцировки сателлитных клеток и миобластов, вьщеленных из скелетных мышц крыс
на разных стадиях онтогенеза 106
4.5. Особенности экспрессии различных изоформ тяжелых цепей миозина в процессе дифференцировки миогенных клеток-предшественников in vitro 107
Выводы 112
Список литературы 114
- Идентификация сателлитных клеток и их концентрация в мышцах
- Активация и асимметричное деление сателлитных клеток. Роль белкового фактора Numb
- Гистологическое окрашивание
- Иммуноцитохимическая характеристика культур миогенных клеток-предшественников, выделенных из мышц крыс на разных стадиях онтогенеза
Введение к работе
Изучение процессов роста, диффереыцировки и восстановления мышечной ткани за счет стволовых клеток представляет собой одно из актуальных направлений современной биологии развития, молекулярной и клеточной биологии. В литературе имеются данные, что стволовые клетки скелетных мышц представляют собой гетерогенную популяцию, в которой имеется два типа клеток. Первый тип — сателлитные клетки, формирующие популяцию коммитированных клеток-предшественников миогеннои линии дифференцировкп (Zammit, Beauchamp, 2001; Charge, Rudnicki, 2004); второй - мультипотентные предшественники сателлитных клеток, которые и являются собственно стволовыми клетками мышц (Seale, Rudnicki, 2000). Однако большинство авторов придерживается общепризнанной точки зрения, согласно которой процессы роста и регенерации скелетных мышц обеспечиваются за счет популяции сателлитных клеток (Bailey et ah, 2001; Seale et ai, 2001; Zammit, Beauchamp, 2001; Charge, Rudnicki, 2004). Сателлитные клетки мышечной системы являются перспективной моделью для изучения клеточных и молекулярно-генетических механизмов пролиферации, дифференцировки, апоптоза и других процессов, протекающих в ходе развития мышц.
Исследования, которые проводятся в области биологии сателлитных клеток, направлены на изучение формирования их пула в период развития мышечной ткани в эмбриогенезе (Seale, Rudnicki, 2000; Gros et a!., 2005), регуляции самообновления и поддержания пула этих клеток в ходе индивидуального развития, контроля процессов активации, пролиферации и дифференцировки сателлитных клеток (Cooper et а!., 1999; Anderson, 2000; Shen et ai, 2002; Hill et ai, 2003; Charge, Rudnicki, 2004; Shinin et ai, 2006).
Поскольку сателлитные клетки образуются в эмбриогенезе в период формирования мышечной ткани и функционируют на протяжении всего онтогенеза, важно выяснить, существуют ли различия между сателлитными клетками, выделенными из мышц в эмбриональный и постнатальный периоды развития. Существенным является вопрос о том, способны ли сателлитные клетки к самоподдержанию в культуре, полученной из мышц животных на разных этапах индивидуального развития. Терминальный этап дифференцировки сателлитных клеток in vitro, как и in vivo - синтез белков сократительного аппарата, прежде всего миозина. Несмотря на многочисленные исследования генов различных изоформ миозина in vivo, в литературе отсутствуют данные о специфичности экспрессии этих генов в ходе дифференцировки in vitro миогенных клеток-предшественников, выделенных из мышц животных на разных этапах онтогенеза.
Цель настоящей диссертационной работы - сравнительное исследование процесса дифференцировки in vitro сателлитных клеток и миобластов, выделенных из мышц крыс на разных этапах онтогенеза.
В работе предстояло решить следующие задачи:
Получить культуры клеток из мышц крыс на 20-21 сут эмбриогенеза, 3-5 сут постнатального развития, а также из мышц взрослых половозрелых крыс;
Охарактеризовать полученные культуры с использованием иммуноцитохимических и молекулярно-генетических маркеров;
Сравнить адгезивные свойства и темпы дифференцировки миогенных клеток-предшественников, выделенных из мышц животных на разных этапах индивидуального развития;
Исследовать экспрессию гена Рах7 - основного транскрипционного фактора, ответственного за самообновление и поддержание пула сателлитных клеток;
Провести сравнительный анализ экспрессии генов-маркеров миогенной дифференцировки клеток-предшественников, полученных из мышц животных на разных этапах онтогенеза;
Проанализировать экспрессию различных изоформ тяжелых цепей миозина (эмбриональную, перинатальную, р- и 2а) при дифференцировке сателлитных клеток и миобластов, выделенных из мышц животных на разных этапах онтогенеза.
Идентификация сателлитных клеток и их концентрация в мышцах
Для идентификации сателлитных клеток используются несколько критериев. Один из важных критериев - морфологический. Эти клетки локализованы в углублениях между базальной ламиной и сарколеммой миофибрилл (рис. 1) и составляют 2-7 % в мышцах взрослого организма (Маиго, 1961).
Сателлитные клетки определяются также по экспрессии специфических генетических и белковых маркеров: прежде всего гена Рах7 и его белкового продукта — транскрипционного фактора Рах7, локализующегося в ядрах покоящихся и активированных сателлптных клеток. У нокаутных мышей, дефицитных по гену Рах7, скелетные мышцы не отличаются от мышц мышей дикого типа при рождении. Однако постепенно пул сателлитных клеток утрачивается и происходит атрофия скелетной мускулатуры, в результате чего животные обычно погибают в возрасте 2-х недель (Seale et al, 2000, 2001; Bailey et al, 2001; Charge, Rudnicki, 2004). Считается, что в покоящихся сателлитных клетках отсутствуют миогенные регуляторные факторы семейства bHLH (Myf5, MyoD, myogenin, MRF4). Однако в исследованиях последних лет было показано, что в покоящихся сателлитных клетках обнаруживается очень низкий уровень экспрессии Му/5, наличие которого характерно для ранних этапов миогенной дифференцировки (Cooper et al, 1999; Cornelison, Wold, 1997; Smith et al, 1994; Yablonka-Reuveni, Rivera, 1994). По мнению ряда авторов в сателлитных клетках выявляется также низкий уровень экспрессии гена M-Cadherin и его продукта, Са -зависимого белка клеточной адгезии (Irintchev et al, 1994; Moore, Walsh, 1993). В некоторых из этих работ было показано, что мембрана сателлитных клеток в области контакта с базальної! ламиной (базальная) характеризуется наличием интегрина а7(31, рецептора ламинина, тогда как в мембране, контактирующей с сарколеммой миофибриллы (апикальная) локализуется М-Cadherin, обеспечивающий адгезию сателлитных клеток с мышечным волокном (Corneloson, Wold, 1997; Burkin, Kaufman, 1999). Однако другими исследователями было установлено, что не все сателлитные клетки как in vivo, так и in vitro характеризуются экспрессией M-Cadherin (Beauchamp et al. 2000) или в сателлитных клетках этот белок вовсе отсутствует. Наличие транскриптов этого гена и соответствующего белка выявляют на стадии слияния миобластов (Hill et all., 2003). Таким образом, имеющиеся в литературе данные о специфичности экспрессии гена M-Cadherin и его белкового продукта достаточно противоречивы и требуют более детального рассмотрения.
Цитоплазматическийбелок промежуточныхфиламентов ECaichinsky et al, 1994; Shefer et al, 2001; Day et al, 2007 В сателлитных клетках экспрессируются маркерные гены, характерные и для других СК: c-Met, рецептор фактора роста гепатоцитов (HGF); MNFa- и /?-сплайсформы; Msxl (Bailey et al, 2001; Charge, Rudnicki, 2004; Seale et al, 2001); VCAM1 (Jesse et al, 1998); N-CAM (Covault, Sanes, 1986); CD34, маркер гематопоэтических СК; Syndecan3 и Syndecan4, гепарансульфат протеогликаны (Cornelison et al, 2001); (табл.1). Кроме того, в работах по изучению дифференцировки сателлитных клеток in vitro были опубликованы данные об экспрессии нестина, маркера нейрональных клеток-предшественников, в пролиферирующих и дифференцирующихся потомках сателлитных клеток (Kaichinsky et al., 1994; Shefer et al., 2001), что явилось отправной точкой для дальнейших исследований в этой области. В 2007 году были опубликованы результаты, согласно которым экспрессия гена нестина и его белкового продукта была выявлена в покоящихся сателлитных клетках (Day et al, 2007).
Ранее считалось, что процентное содержание сателлитных клеток на протяжении онтогенеза остается относительно постоянным, что было установлено на основе анализа мышц мышей в возрасте от 2-х мес. до 2 лет и более (McGeachie, Grounds, 1995). Однако при более детальном анализе с использованием животных самых ранних этапов развития было показано, что у мыши при рождении отмечается самый высокий процент сателлитных клеток. Начиная с 2-месячного возраста процентное содержание сателлитных клеток почти в 7 раз ниже, и после наступления полового созревания этот показатель продолжает снижаться (Gibson, Schultz, 1983; Charge et al., 2002; Charge, Rudnicki, 2004) (табл. 2). Такой важный показатель состояния организма, как снижение мышечной массы с возрастом связано, как предполагается, с изменением микроокружения сателлитных клеток in vivo, которое регулирует процессы активации, самообновления и дифференцировки этих клеток (Seale et al., 2001; Sanes, 2003; Gopinath, Rando, 2008; Kuang et al., 2008). Изменение микроокружения приводит к возможному нарушению вовлечения сателлитных клеток в процесс естественного обновления мышц.
Процентное содержание сателлитных клеток отличается также и в разных типах мышц (Schmalbmch, Hellhammer, 1997; Snow, 1983). Так в медленных (красных) мышечных фибриллах сателлитных клеток больше по сравнению с быстрыми (белыми) волокнами. Процент сателлитных клеток во взрослой медленной камбаловидной мышце {musculus. soleus) в 2-3 раза выше по сравнению со взрослыми быстрыми передней болыпеберцовой мышцей {т. tibialis anterior) и длинным разгибателем пальцев {т. extensor digitorum longus).
Активация и асимметричное деление сателлитных клеток. Роль белкового фактора Numb
Сателлитные клетки в ходе заместительных и восстановительных процессов в мышцах взрослых животных проходят в основном тот же путь дифференцировки, что и миогенные клетки в период эмбрионального развития. Важнейшим элементом регуляции восстановительного потенциала мышц служит активация сателлитных клеток в ответ на те или иные воздействия или повреждение. Покоящиеся сателлитные клетки активируются во взрослых мышцах в ответ на многие стимулы: физическая нагрузка, повреждение, электростимуляция, дегенеративные заболевания (мышечная дистрофия) (Озернюк, Балан, 2007; Charge, Rudnicki, 2004; Seale et ah, 2001). Активация сателлитных клеток не ограничивается местом повреждения мышечного волокна. Повреждение одного конца миофибриллы активирует сателлитные клетки по всей ее длине. Активированные сателлитные клетки вступают в митоз и дают начало миогенным клеткам-предшественникам. Ключевым этапом активации сателлитных клеток при повреждении мышц служит переход от пролиферации к дифференцировке (Charge, Rudnicki, 2004; Shinin et ai, 2006). Особый интерес представляет анализ клеточных и молекулярных механизмов такого перехода.
Сигналом к переходу сателлитных клеток от состояния пролиферации к дифференцировке служит обычно повреждение мышц. Каким образом осуществляется этот переход? Последнее клеточное деление сателлитных клеток, предшествующее началу их дифференцировки, должно завершаться образованием одной дочерней клетки, сохраняющей свойства стволовой, а другая дочерняя должна вступить на путь дифференцировки. Это означает, что такое клеточное деление должно быть асимметричным (Терских, 2007; Chenn, McConnell, 1995; Conboy, Rando, 2002; Shinin et a!., 2006; Wolpert, 1988). Идея асимметричного деления клеток была сформулирована Вольпертом в 1988 г. (Wolpert, 1988) и значение такого деления для самообновления стволовых клеток и их дифференцировки очевидно.
Асимметричное деление было описано для некоторых типов клеток (Chenn, McConnell, 1995; Lin, Schagat, 1997; Reugels el al, 2006; Shen et al, 2002), в том числе и для сателлитных клеток скелетных мышц мыши (Conboy, Rando, 2002; Shinin et al, 2006). В этих типах клеток обнаружены специфические белковые факторы, которые в ходе митоза попадают только в одну из дочерних клеток, остающуюся стволовой. Для сателлитных клеток мышц это белковый фактор Numb, сегрегирующийся при митозе асимметрично (Conboy, Rando, 2002; Shinin et al., 2006). Данный результат получен при мечении сателлитных клеток бромдезоксиуридином, в результате чего была получена субпопуляция этих клеток, удерживающих метку в течение роста и при повреждении мышц. Оказалось, что часть таких клеток содержат фактор Numb, сегрегирующийся в процессе митоза в одну из дочерних клеток. Асимметричная сегрегация фактора Numb и других подобных факторов, связывающихся с ДНК при делении сателлитных клеток, рассматривается как возможный механизм защиты их генома от ошибок репликации ДНК (Conboy, Rando, 2002; Shinin et ai, 2006).
Асимметричное деление с участием специфических детерминант (факторов Numb, Prospero, Pten) установлено для многих типов стволовых и прогениторных клеток: нейробластов дрозофилы (Lin, Schagat, 1997), нейроэпнтелиальных клеток данио (Reugels et ai, 2006), клеток церебрального кортекса хорька (Chenn, McConnell, 1995), нейробластов и клеток церебрального кортекса мыши (Shen et al, 2002), гематопоэтических стволовых клеток (Rossi, Weissman, 2006).
Активация сателлитных клеток в направлении миогенной дифференцировки при повреждении мышц осуществляется при помощи различных факторов роста, прежде всего, фактора роста гепатоцитов (HGF) (Allen et al, 1995; Tatsumi et ai, 1998), а также других факторов роста и дифференцировки: FGF (FGF-2 и FGF-6), TGFp, IGF-1, IL-6, LIF, NO (Charge, Rudnicki, 2004; Seale, Rudnicki, 2000). Эти факторы, взаимодействуя со своими рецепторами на поверхности клеток, активируют внутриклеточные сигнальные пути, что приводит к экспрессии специфических миогенных регуляторов, прежде всего, транскрипционных факторов семейства bHLH. Как уже отмечалось, характер экспрессии миогенных регуляторных факторов этого семейства (MyoD, Myf5, myogenin, MRF4) при формировании миофибрилл в эмбриогенезе и из активированных сателлитных клеток мышц взрослых животных в основном сходный, но порядок их экспрессии несколько отличается (Seale et al., 2001).
На ранних этапах формирования мышц наблюдается экспрессия генов -специфических регуляторов ранних этапов миогенеза: Myf5 и MyoD. Показано, что у взрослых мышей, не содержащих ген MyoD, происходит заметная редукция днфференцировочного потенциала сателлитных клеток при увеличении их количества (Cornelison et al, 2000; Sabourin et al, 1999).
В восстановление скелетных мышц после повреждения вовлечены многие процессы и один из основных - пролиферация сателлитных клеток взрослого животного с последующей дифференцировкой в миогенном направлении. Активация сателлитных клеток регулируется при помощи экспрессии генов, принадлежащих к нескольким семействам: HGF, FGF, TGF-Д IGF, TNF-a, IL-6 (Charge, Rudnicki, 2004; Seale, Rudnicki, 2000). Эти факторы регулируют соотношение между пролиферацией и дифференцировкой сателлитных клеток. Следует отметить, что роль перечисленных факторов в активации сателлитных клеток установлена в основном в опытах in vitro. В экспериментах in vivo показано участие лишь немногих из этих факторов.
Очевидно, что не только перечисленные факторы роста, но и их рецепторы обеспечивают регуляцию активации сателлитных клеток в мышцах взрослого организма при их повреждении (Charge, Rudnicki, 2004; Seale, Rudnicki, 2000).
HGF - один из основных регуляторов активности сателлитных клеток в ходе регенерации мышц. Впервые этот фактор роста (транскрипты HGF и соответствующий белок) был обнаружен на ранних этапах регенерации скелетных мышц (Jennische et al, 1993). В опытах in vitro было установлено, что HGF способен стимулировать покоящиеся сателлитные клетки к делению. Кроме того, данный фактор роста может участвовать в регуляции миграции сателлитных клеток к месту повреждения мышцы.
HGF локализован во внеклеточном матриксе, и в последнее время получены данные об особенностях высвобождения этого фактора роста из внеклеточного пространства при повреждении базальной ламины. В опытах in vivo и in vitro получены данные, позволяющие предполагать, что при повреждении мышцы из под базальной ламины высвобождается NO-синтаза, продуцирующая NO. Последний может активировать высвобождение HGF из его связи во внеклеточном матриксе с протеогликаном гепаран-сульфатом (Anderson, 2000; Tatsumi et al, 1998).
Гистологическое окрашивание
Для гистологического анализа применяли стандартную методику окрашивания клеток азур-эозином по Романовскому - Гимза. Сателлитные клетки и миобласты промывали раствором Хэнкса (БиоЛот) и фиксировали 96% этиловым спиртом в течение 10-15 мин. После фиксации для испарения остатков этилового спирта клетки оставляли сохнуть при комнатной температуре. Окрашивание проводили в течение 40-45 мин азур-эозином (ПапЭко), приготовленным на 0,1 М фосфатно-солевом буфере (PBS) рН 6,8 из расчета 1 : 20. После окрашивания дважды промывали 0,1 М PBS рН 6,8. Гистологическую реакцию анализировали с помощью светового микроскопа Olympus АН-3 (Австрия).
Для приготовления криостатных срезов мышечную ткань фиксировали в 4% параформальдегіде, приготовленном на 0.1 М PBS (рН 7.4), в течение 24 ч при комнатной температуре. Затем мышцы отмывали в 3 сменах 0.1 М PBS. Последовательно выдерживали в 5% и 10% сахарозе по 10-15 мин и оставляли на ночь в 20% сахарозе при 4С. На следующие сутки мышечную ткань помещали в смесь Tissue Тес О.СТ. (Leica, Германия) и 0,1 М PBS с 20%-ной сахарозой в соотношении 1 : 1 и замораживали при -70С. На криотоме изготовляли поперечные срезы толщиной 7-10 мкм. Перед инкубацией с антителами срезы отмывали в 0.1 М PBS (30 мин).
Для иммуноцитохимических исследований с использованием флуоресцентной метки культуры клеток фиксировали 4% параформальдегидом, приготовленном на 0.1 М PBS (рН 7.4), в течение 10 мнн при 20 С. После фиксации клетки промывали PBS и пермабилизировали в 0.25%) растворе Triton Х-100 30 минут. Для уменьшения неспецифического связывания антител клетки инкубировали в блокирующем растворе 3% бычьего сывороточного альбумина (Sigma) в течение 30 мин. Растворы Triton Х-100 и БСА готовили на 0.1 М PBS с добавлением 0.1% T\veen-20. Список использованных антител, названия, фирмы производители и разведения представлены в таблице 4. Рабочее разведение антител определяли с помощью титрования с учетом данных, указанных в паспорте. Инкубацию с первичными антителами, разведенными в блокирующем растворе, проводили в течение 18 ч при 4 С, после чего клетки промывали PBS 4 раза по 5 минут и наносили вторичные антитела, конъюгированные с флуорохромом Alexa Fluor 488 или 546 (Molecular Probes, США). Для окрашивания ядер клеток использовали Hoechst 33342 (1 : 1000, Sigma) или PI (йодистый пропидий) (1 : 100, Sigma). При использовании PI клетки предварительно обрабатывали РНКазой. После инкубации со вторыми антителами клетки промывали PBS и заключали под покровные стекла в глицерин. Специфичность антител подтверждали в контрольных экспериментах. В качестве положительного контроля для Рах7 использовали криостатные срезы бедренной мышцы крысы, для CD34 и CD45 - отпечатки селезенки этого же животного.
Тотальную РНК (тотРНК) выделяли из культур миогенных клеток-предшественников (сателлитные клетки и одноядерные миобласты) на разных стадиях дифференцировки in vitro, а также из скелетных мышц бедра крыс на 20-21 сут эмбрионального эмбриогенеза, 3-5 сут постнатального развития, а также из мышц взрослых животных (3-6 месяцев). Выделение тотРНК осуществляли с помощью TRI Reagent (Sigma). После добавления 1/5 объема хлороформа пробирку встряхивали и помещали в лед на 5 мин. Далее суспензию центрифугировали при 14,000 g в течение 15 мин при 4С - на центрифуге типа EPPENDORF 5417R. Водную фазу переносили в чистую пробирку, добавляли изопропанол, перемешивали и оставляли на 15 мин при 4С. Затем образцы центрифугировали при 14,000 g в течение 15 мин при 4С. После центрифугирования надосадочную жидкость удаляли, а осадок тотРНК промывали 75% этанолом и снова центрифугировали при 12,000 g в течение 8 мин при 4С. После удаления этанола осадок тотРНК подсушивали в течение нескольких минут при комнатной температуре и добавляли 50 мкл воды, свободной от РНКаз.
Концентрацию тотРНК в пробе определяли спектрофотометрическим методом. Критерием чистоты являлось отношение A260/A28OJ которое отражает наличие примеси белка в пробе.
Иммуноцитохимическая характеристика культур миогенных клеток-предшественников, выделенных из мышц крыс на разных стадиях онтогенеза
Субпопуляцию сателлитных клеток идентифицировали по наличию транскрипционного фактора Рах7 и мембранного белка CD34. Данные по иммуноцихимическому выявлению Рах7, CD34 приведены на рисунках 6 и 7. Одноядерные миобласты выявляли по окрашиванию антителами к десмину и м-кадгерину (рис. 8). Источником миофибрилл в культуре могут служить также мышечные SP(side-population)-ioieTKH, поэтому было важно оценить присутствие в культуре клеток этого типа. Отрицательная реакция при окрашивании антителами к CD45 свидетельствует о том, что культуры клеток-предшествеников не содержали миогенных SP-клеток (рис. 7а , б , в ). Согласно данным литературы (Asakura et al, 2002; Bachrach et al., 2006; Gussoni et ah, 1999), миогенные SP-клетки выявляются по коэкспрессии CD34 и CD45, а также по способности выводить витальные красители, в частности, Hoechst 33342.
Таким образом, культуры миогенных клеток-предшественников полученные нами из мышц животных на 20-21Э, 3-5П, а также из мышц взрослых крыс, характеризовались высоким содержанием сателлитных клеток и небольшим процентом одноядерных миобластов и отсутствием миогенных SP-клеток.
Важной задачей настоящей работы был сравнительный анализ экспрессии ряда генетических маркеров сателлитных клеток и миобластов в культурах миогенных клеток-предшественников, полученных из мышц животных на разных стадиях индивидуального развития.
Из данных литературы известно, что важную роль в процессе самообновления PI поддержания пула сателлитных клеток in vivo играет транскрипционный фактор Рах7.
В связи с этим представлялось интересным сравнительное исследование экспрессии гена Рах7 в культурах миогенных клеток-предшественников, выделенных из мышц животных на 20-21Э, 3-5П, а таюке из мышц взрослых крыс. С помощью ПЦР-анализа и иммуноцитохимического метода была показано наличие транскриптов гена Рах7 и соответствующего белка в культурах клеток, полученных из мышц животных на разных стадиях онтогенеза. Для изучения экспрессии гена Рах7 были получены кДНК-библиотеки, синтезированные на мРНК из миогенных клеток-предшественников, выделенных из мышц крыс на разных стадиях индивидуального развития. Для получения ПЦР-фрагментов были сконструированы пары праймеров по нуклеотидным последовательностям гена Рах7. Результаты ПЦР-анализа экспрессии Рах7 в первичных культурах миогенных клеток-предшественников представлены на рисунке 9. Существенных различий в уровне экспрессии Рах7 в культурах клеток, полученных из мышц животных на разных стадиях онтогенеза, не наблюдается, что несомненно свидетельствует о способности сателлитных клеток к самоподдержанию. Как было отмечено выше, исследуемые клеточные культуры были гетерогенны и помимо сателлитных клеток включали субпопуляцию одноядерных миобластов. Идентификацию миобластов проводили по экспрессии специфического маркера десмина. Известно, что цитоплазматический белок десмин в процессе дифференцировки впервые появляется в одноядерных миобластах и детектируется практически на протяжении всего миогенеза вплоть до формирования многоядерных миофибрилл. Использование антител к этому белку позволило нам идентифицировать все миобласты, входящие в эту субпопуляцию, это и пролиферирующие миобласты, и миобласты вышедшие из клеточного цикла и готовые к слиянию. Пролиферативную активность клеток оценивали по наличию в ядрах клеток специфического белка КІ67, который присутствует на всех стадиях клеточного цикла за исключением фазы Go (стадия пролиферативного покоя). Результаты иммуноцитохимического окрашивания антителами к десмину, КІ67 и м-кадгерину представлены на рис. 10,11,12. Субпопуляция одноядерных миобластов в составе гетерогенной клеточной культуры была представлена пролиферирующими Ki67(+) клетками и закончившими деление м-кадгерин(+) клетками. Следует отметить, что уровень экспрессии КІ67 и м-кадгерина в миобластах, выделенных из мышц животных на разных стадиях онтогенеза, существенно отличался. Так, субпопуляция миобластов в культуре клеток из мышц животных 20-21Э была представлена в основном м-кадгерин(+) миобластами, и только единичные клетки давали положительное окрашивание на антитела к КІ67 (рис. 10). В культуре клеток из мышц крыс 3-5П и взрослых животных, наоборот, преобладали миобласты с пммунопознтивной реакцией на КІ67 и незначительное количество клеток экспрессировали м-кадгерин (рис. 11, 12).
Была проведена также визуальная оценка распределения десмина, м-кадгерина и КІ67 в миобластах, выделенных из мышц 20-21Э, 3-5П и взрослых животных (табл. 6). Исследование распределения маркеров м-кадгерина и КІ67 выявило различия в культурах клеток, выделенных из мышц животных на разных стадиях онтогенеза. В субпопуляции миобластов в культуре клеток-предшественников, полученных из мышц животных на 20-21Э, в отличие от клеток из мышц 3-5П и взрослых животных, преобладают миобласты, коммутированные к слиянию.
Похожие диссертации на Анализ дифференцировки in vitro сателлитных клеток и миобластов, выделенных из скелетных мышц крыс на разных стадиях онтогенеза
