Система "перекисное окисление липидов-антиоксиданты" у крыс на разных стадиях онтогенеза и канцерогенеза Арсланова Динара Ришатовна

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Обзор литературы 9

1.1 Яичник млекопитающих в процессе онтогенеза 9

1.1.1 Функциональная морфология яичников циклирующих млекопитающих 9

1.1.2 Возрастная периодизация функции яичников 13

1.2 Регуляторная функция компонентов системы ПОЛ-АО 16

1.2.1 Роль системы ПОЛ-АО в регуляции клеточного метаболизма 16

1.2.2 Кислородно-перекисная теория старения 22

1.2.3 Окислительный стресс в регуляции апоптоза и пролиферации...29

1.3 Система ПОЛ-АО в процессе развития опухолей 33

1.3.1 Изменения про- и антиоксидантных факторов в процессе экспериментального канцерогенеза 33

1.3.2 Проблема канцерогенеза на поздних этапах онтогенеза 37

Глава 2. Материалы и методы исследования 40

Глава 3. Результаты собственных исследований 44

3.1 Анализ системы ПО Л-АО в яичниках, эритроцитах и плазме крови крыс в процессе индивидуального развития 44

3.1.1 Показатели ПОЛ-АО в яичниках крыс в процессе онтогенеза 44

3.1.2 Показатели ПОЛ-АО в крови крыс в процессе онтогенеза 48

3.2 Уровень митоза и апоптоза в покровном эпителии яичников крыс на разных этапах индивидуального развития 53

3.3 Анализ параметров системы ПОЛ-АО в организме животных-опухоленосителей с асцитной опухолью яичников 56

Заключение 69

Выводы 78

Библиографический список 79

• Яичник млекопитающих в процессе онтогенеза
• Возрастная периодизация функции яичников
• Анализ системы ПО Л-АО в яичниках, эритроцитах и плазме крови крыс в процессе индивидуального развития
• Показатели ПОЛ-АО в крови крыс в процессе онтогенеза

Введение к работе

Перекисное окисление липидов (ПОЛ) — в строго ограниченных пределах - это физиологический процесс, который принимает участие в регуляции клеточных функций [37,69]. При повышении уровня свободнорадикального окисления возможно быстрое разрушение клеточных структур в результате их повреждения. Показано, что практически все патологические состояния помимо специфического ответа сопровождаются повышенным уровнем ПОЛ [4, 11, 44]. Повреждающим фактором при этом служит избыточный уровень активных форм кислорода (АФК), которые меняют свою физиологическую, сигнальную (регуляторную) роль на патогенетическую. Одним из универсальных механизмов защиты клетки от избыточного ПОЛ является многоуровневая система антиоксидантов. Оценить баланс прооксидантов и антиоксидантов позволяет соотношение ДПО-АО, предложенное Б.Н. Лю [53].

На сегодня показано, что процесс физиологического старения организма носит многофакторный, многоочаговый, необратимый характер. Современная свободно-радикальная теория старения предполагает, что наступающая с возрастом дезадаптация связана с повреждениями важных биомолекул продуктами ПОЛ [118, 130]. В ходе многочисленных экспериментов выяснено, что митохондрии - наиболее уязвимое и основное «стартовое» звено в старении клетки [71, 113, 128]. Внутриклеточная гипероксия, как результат первичного процесса старения митохондрий, становится фактором поражения не только всех субклеточных структур, но внеклеточных образований. Полагают также, что модификация структуры плазматической мембраны — один из наиболее вероятных механизмов нарушения регуляции тканевого метаболизма при старении [21]. Исследование параметров системы ПОЛ-АО в крови, тканях печени, мозга у животных разных возрастных групп позволило определить существенную роль избыточности процессов пероксидации и недостаточности антиоксидантной защиты в возрастных перестройках этих тканей [5, 25, 166].

5 . Однако работ, посвященных возрастной динамике в системе ПОЛ-АО в яичнике, являющимся; органом, рано подверженным инволютивным процессам, нет.

Накопление соматических мутаций в клетке, как. результат воздействия эндогенных метаболитов вообще и? продуктов повышенного ПОЛ в частности, может представлять,один из механизмов патогенеза — общий для процессов старения и канцерогенеза [31, 87, 103, 137]. Злокачественный рост, который является болезнью регуляции, в первую очередь регуляции размножения и дифференцировки, может сопровождаться изменениями или сбоями в работе системы ПОЛ-АО [12, 39, 48, 64, 109]. Установлено, что как для. малигнизации, так m для поддержания трансформированного состояния клеток активно растущих участков опухоли необходимо создание внутри, клеток гипероксических условий [54]. Однако оксидативный стресс, наблюдаемый в неопластической клетке, может возникнуть не только при; избыточности активных- форм кислорода; но и при недостаточности антиоксидантов.

Существует мнение, что дисбаланс в системе продукции и инактивации¹ АФК может с одной стороны вызывать, изменения функциональной активности яичников в процессе онтогенеза, а с другой, являться одной из причин, провоцирующей канцерогенную ситуацию [6,75]. Однако в доступной литературе отсутствуют данные, позволяющие оценить динамику компонентов системы ПОЛ-АО в яичнике в онтогенезе и на различных стадиях канцерогенеза.

Целью настоящей работы явилось изучение системы «перекисное окисление липидов - антиоксиданты» у крыс на разных стадиях онтогенеза и канцерогенеза¹.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

Г. Изучить динамику активности компонентов системы «перекисное окисление липидов: - антиоксиданты» в ткани яичников, плазме крови-и эритроцитах у крыс в процессе онтогенеза.

2. Оценить уровень митоза и апоптоза в покровном эпителии яичника крыс на разных стадиях онтогенеза.

3. Определить изменения в системе ПОЛ-АО в опухолевых клетках, асцитической жидкости, плазме крови и эритроцитах животных-опухоленосителей с асцитной опухолью яичника на разных стадиях канцерогенеза.

4. Изучить динамику в системе ПОЛ-АО в опухолевых клетках, асцитической* жидкости, плазме крови и эритроцитах у животных-опухоленосителей на разных стадиях онтогенеза.

Научная новизна. Получены новые данные об изменении системы ПОЛ-АО в яичниках крыс в процессе индивидуального развития и при прогрессировании асцитной опухоли яичника у крыс. Также впервые оценен уровень ферментативного» звена АОС (супероксиддисмутазы, каталазы, глутатион-редуктазы) в плазме и< эритроцитах крови животных-опухоленосителей. Проведены морфологические исследования покровного эпителия яичника крыс в процессе старения органа. Впервые установлена корреляционная? связь между накоплением продукта ПОЛ - МДА в яичниках крыс с возрастом животных, а также с уровнем митоза и апоптоза в. покровном эпителии яичников. Проведена оценка параметров системы ПОЛ-АО в опухолевых клетках, асцитической жидкости, плазме крови и эритроцитах крыс с асцитной опухолью яичников в логарифмическую и терминальную фазу процесса в разных возрастных группах.

Научно-практическая значимость. Результаты работы о роли липопероксидации в онтогенезе могут быть использованы в теоретической и прикладной геронтологии при разработке теории старения и методов коррекции оксидативного стресса на поздних этапах онтогенеза. Данные, полученные в результате оценки уровня ПОЛ в ткани яичников на разных этапах онтогенеза и канцерогенеза, могут быть использованы в онкогинекологии при оценке факторов риска заболевания раком яичников. Полученные показатели митотического и апоптотического индексов в

7 клетках покровного эпителия яичников, а также данные по оценке их коррелятивных связей с динамикой МДА могут быть использованы в возрастной физиологии при оценке функций репродуктивной системы. Результаты изучения активности ферментативного звена антиоксидантной системы в опухолевой ткани, асцитической жидкости, плазме и эритроцитах животных-опухоленосителей могут быть использованы в теоретической и практической онкогинекологии, а также в экспериментальной онкологии животных при разработке терапевтических схем на разных стадиях опухолевого процесса.

Положения, выносимые на защиту:

1. В ходе индивидуального развития в яичниках и крови крыс происходят разнонаправленные изменения в системе ПОЛ-АО. Старение яичника сопровождается накоплением МДА и снижением активности ферментов антиоксидантной защиты. Наиболее выраженный дисбаланс в системе ПОЛ-АО в ткани яичников наблюдается у старых животных в возрасте 21 месяц.

2. На исследуемых этапах онтогенеза (4, 9, 15, 21 месяц) одновременно с нарастанием уровня МДА в ткани яичников крыс в покровном эпителии отмечено снижение митотического индекса и возрастание апоптотического индекса.

3. Функционирование системы ПОЛ-АО в клетках асцитной опухоли яичников зависит от стадии роста опухоли. На терминальной стадии по сравнению с логарифмической наблюдается усиление окислительного стресса, что проявляется в снижении активности СОД и каталазы на фоне увеличения содержания МДА.

4. Рост асцитной опухоли яичников сопровождается увеличением
уровня МДА в асцитической жидкости, плазме крови и эритроцитах. У
молодых животных-опухоленосителей (4 месяца) по мере прогрессирования
опухоли степень и направленность динамики ферментов антиоксидантной

8 защиты в эритроцитах, плазме и асцитическои жидкости отлична от аналогичных показателей животных 15 месяцев.

5. Динамика активности компонентов системы ПОЛ-АО в яичниках крыс в процессе онтогенеза сходна с таковой в процессе канцерогенеза.

Апробация работы

Основные положения диссертации были доложены на Всероссийской
научной конференции «Механизмы индивидуальной адаптации» (Томск,
2006), конгрессе с международным участием «Паллиативная медицина и
реабилитация в здравоохранении» (Турция, 2006), на 2-й Всероссийской
конференции с международным участием «Медико-физиологические
проблемы экологии человека» (Ульяновск, 2007), Всероссийской
конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-

приспособительных процессов» (Новосибирск, 2007), I Всероссийской молодежной научной конференции «Молодежь и наука на севере», (Сыктывкар,2008), VIII Молодежной научной конференции Института физиологии Коми НЦ УрО РАН (Сыктывкаре 009).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, из них 2 - в изданиях, рекомендованных ВАК.

. 9 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Яичник млекопитающих в процессе онтогенеза

/. 1.1 Функциональная морфология яичников циклирующих млекопитающих Микроскопически яичник имеет неодинаковую структуру (рис. . 1). Хотя он является внутрибрюшинным органом, но брюшиной не покрыт; свободная поверхность образована однослойным кубическим недеятельным зачатковым эпителием, который располагается на соединительнотканной оболочке. Глубже белочной оболочки яичник образован: расположенным поверхностно более плотным корковым веществом железистой; тканью и расположенным центрально — мозговым; веществом, богатым сосудами и рыхлой соединительной тканью — стромой яичника; Корковое вещество в области ворот яичника постепенно уменьшается; Єтепеньразвития. коркового и мозгового вещества; зависит от возраста^ самки: Ві корковом веществе расположены фолликулы, находящиеся на разных стадияхразвития [18].

Покровный эпителий - видоизмененный мезотелий;; образован, одним, слоем кубических клеток с многочисленными микроворсинками на выпуклых апикальных поверхностях. Регулярно разрывается при овуляции, затем быстро пролиферирует и мигрирует, замещая дефект в поверхности органа. Регенерация специализированного эпителия органов (печени, поджелудочной железы, почек, желез внутренней секреции) осуществляется по типу регенерационной гипертрофии: в участках повреждения ткань замещается рубцом, а по периферии его происходит гиперплазия и гипертрофия клеток паренхимы. Строма органа представлена плотной соединительнотканной белочной оболочкой, лежащей под покровным эпителием, и своеобразной соединительной тканью, в которой в виде завихрений плотно располагаются; веретеновидные фибробласты и фиброциты. У взрослых эпителий представляет собой упорядочение расположенные клетки, может инвагинировать вглубь яичника, образуя везикулярные или трубчатые (узкие крипты), обладают секреторной

10 активностью. Эпителиальные клетки лежат на тонкой базальной мембране, состоящей из гомогенного вещества с включением коллагеновых волокон. Клетки чаще имеют плоскую форму, а в тех участках, где они покрывают яичник между выступающими фолликулами, их форма кубическая или цилиндрическая. Ядра клеток вытянутой формы с ровными границами. Клетки контактируют друг с другом с помощью нексусов или десмосом [86]. Поверхностный эпителий яичника сохраняет свои особенности до глубокой старости, образуя бугристую структуру на выпуклой поверхности органа [19]. Функция и морфология фолликулярного аппарата яичника в процессе онтогенеза организма самки хорошо изучена, однако состояние покровного эпителия этого органа в процессе угасания репродуктивной функции практически не исследовано.

Рис. 1. Схематическое изображение микроскопического строения яичника:

1 - примордиальные фолликулы; 2 - преантральные фолликулы;

3 - строма яичника; 4 - антральный фолликул; 5 - атретический фолликул;

6 - преовуляторный фолликул; 7 - овуляция;8 - формирующееся желтое

тело; 9 - зрелое желтое тело; 10 — покровный эпителий; 11 — беловатое тело;

12 —кровеносные сосуды в воротах яичника

і і

І Процесе фолликулогенеза происходит непрерывно; он начинается в

, антенатальном периоде и заканчивается в постменопаузе. Основная масса

фолликулов редуцируется путем атрезии, которая может происходить на
- любой стадии развития фолликула. Только очень небольшая часть проходит

) полный цикл развития от примордиального до преовуляторного и участвует в

ч процессе овуляции. После овуляции образуется желтое тело, которое

подвергается регрессии в отсутствии беременности. Апоптоз клеток
гранулезы — характерный признак атрезии фолликула. Атретичные
фолликулы имеют меньшее количество гранулезы и более низкую секрецию
* эстрогенов по сравнению с растущими фолликулами аналогичного размера.

Атрезия фолликулов сопровождается морфологическими изменениями,

включая пикноз клеток гранулезы, уменьшение количества митозов,

изменения- базальной мембраны. A.J. Zeleznik [172] была первой, кто

) обнаружил в фолликулах и желтом* теле яичников мышей Са" / Mg" -

J зависимую эндонуклеазу, осуществляющую расщепление ДНК до

олигонуклеосом. Свойственная апоптозу фрагментация ДНК в клетках

гранулезы отмечена при атрезии фолликулов крыс, вызванной путем

, гонадотропной депривации. В регуляции апоптоза клеток гранулезы

f участвуют гормоны и цитокины. Эстрогены способствуют сохранению

'; жизнеспособности клеток гранулезы, а андрогены и агонисты гонадотропин-

рилизинг-гормона играют диаметрально противоположную роль, индуцируя

апоптоз в этих тканях. Эпидермальный фактор роста, интерферон-1,

интерлейкин-1, основной фактор роста фибробластов являются медиаторами

f антиапоптозного действия гонадотропинов, поддерживая жизнеспособность

I фолликулов. В то же время такие цитокины, как фактор некроза опухоли и

>

_s трансформирующий фактор роста способствуют гибели клетки.

, В^ первые 2 года после рождения яичники увеличиваются в размере

| вследствие развития интерстициальной и соединительной ткани. Кроме

\

\ этого, с возрастом число клеток соединительнотканной стромы коркового

) вещества повышается за счет элементов* внутренней теки атретических

12 фолликулов. Резко сокращается число овоцитов. К наступлению менархе (12-13 лет) в яичнике девочки их насчитывается до 15000 [150]. Таким образом, в период детства происходит активная физиологическая атрезия овоцитов и фолликулов на различных стадиях их развития. По мере полового созревания женского организма выявляются гетерохронность и последовательная функциональная активация звеньев, составляющих гипоталамо-гипофизарно-яичниковую ось. Вначале, нарастает секреция ФСГ (зависимо от содержания тестостерона и эстрогенов), при созревании гипоталамуса начинает продуцироваться рилизинг-гормон ЛГ. При установлении равновесия налаживаются нормальные овуляторные циклы. В течение пубертатного периода значительно усиливаются васкуляризация и иннервация коркового и мозгового вещества, клеток теки растущих фолликулов. В конце этого периода кровоснабжение и иннервация внутренней и наружной тек зреющих фолликулов значительно усложняются. Период половой зрелости характеризуется максимальной массой яичника при преобладании коркового вещества над мозговым. Кроме элементов стромы и половых клеток, в коре яичника половозрелой женщины находятся производные зрелых и дегенерирующих фолликулов: желтые, атретические и белые тела. В период полового созревания вследствие обширной дегенерации фолликулов особенно интенсивно разрастается соединительная ткань. Однако к 20 годам интенсивность этого роста снижается. В последующие годы отмечаются очаговость, неравномерная пролиферация коллагеновых волокон. Примерно с 30 лет начинается постепенный и впоследствии тотальный фиброз стромы коркового вещества яичников. Происходят уплотнение и огрубение волокнистых структур. Эти процессы особенно интенсивны в периферических слоях коркового вещества. Возрастные преобразования параллельно затрагивают не только пул половых клеток, но и гормонпродуцирующие и опорные ткани яичника, вызывая в архитектонике этого органа прогрессирующую с возрастом структурную дезорганизацию, которая в конечном итоге приводит к склерозированию яичников [18].

1.1.2 Возрастная периодизация функции яичников

Яичник функционирует циклично и, следовательно, его строение зависит от фазы менструального/овариального цикла, а также от фазы онтогенеза, в котором находится организм.

Основные этапы репродуктивного статуса белых крыс: 1-30 сутки — период новорожденности, в яичниках происходит первое мейотическое деление овоцитов и формирование примордиальных фолликулов; 30-60 сутки — завершается вскармливание молоком, оканчивается ювенильный период и начинается ранний этап полового созревания, в яичниках появляются полостные фолликулы; 60-90 сутки — период полового созревания, интенсивного роста; 90-180 сутки — неустойчивый половой статус в период ранней половозрелости, появляется первая течка (овуляция); 180-360 сутки — расцвет репродуктивной функции; 360-400 сутки — период зрелости, предшествующий старческому увяданию, более 400 суток — угасание половой функции [10, 36]. По мере взросления организма нейроэндокринная система животных приобретает большую устойчивость, что связано с формированием прямых и обратных гуморальных связей между различными уровнями регуляции, созреванием регуляторных центров. Таким образом, наиболее сильное влияние на репродуктивную систему оказывают факторы, действующие на ранних возрастных этапах и в критические периоды развития [19].

Известно, что корковое вещество яичника содержит все компоненты паренхимы, между которыми располагаются прослойки рыхлой соединительной ткани (строма). Паренхима образована фолликулами яичника на разных уровнях развития, желтыми телами на разных уровнях развития, интерстициальными клетками, белыми телами, атретическими фолликулами.

Существуют циклирующие (полиэстричные) животные, к которым относятся мышевидные грызуны, домашние свиньи, приматы, а также человек, и нециклирующие (моноэстричные) животные, которых

14 большинство. Поэтому крысы — удобный объект для биомедицинских исследований репродуктивной системы [10].

В течение всей жизни женщины в яичниках уменьшается число примордиальных фолликулов, содержащих ооциты; к 45 годам число ооцитов в среднем составляет всего 10 тысяч. В перименопаузальном периоде процесс гибели ооцитов и атрезии примордиальных фолликулов ускоряется. В фолликулах уменьшается число слоев гранулезы и тека-клеток - основных источников стероидов. На смену овуляторным циклам приходят циклы с недостаточностью желтого тела, затем ановуляторные. При отсутствии желтого тела синтез прогестерона резко снижается и возникает прогестерондефицитное состояние - основная причина климактерических дисфункциональных маточных кровотечений из гиперплазированного эндометрия [18].

Старение яичников связано с изменением их физиологической функции. По мнению Buchner F. [94], Кватер Е.И. [41], яичники раньше, чем весь организм подвергаются атрофическим инволюционным изменениям. Одна из особенностей старения организма женщины, вероятно, заключается в прогрессирующем ослаблении способности яичников вырабатывать гормоны и в ослаблении связей с высшими нервными центрами. К одной из самых ярких и глубоко разработанных концепций в геронтологии по праву следует отнести элевационную теорию старения и формирования возрастной патологии у высших организмов, придающей ключевое значение в этих процессах возрастному повышению порога чувствительности гипоталамуса к регуляторным гомеостатическим сигналам [27,28]. В серии экспериментальных исследований и клинических наблюдений было установлено, что именно этот процесс приводит к возрастному включению и выключению функции репродуктивной системы в женском организме, к возрастным изменениям в гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системе, обеспечивающей тонический уровень глюкокортикоидных

15: гормоновв крови, их циркадный ритм и повышение секреции при стрессе; и, как следствие, развитию состояния, обозначенному как "гиперадаптоз", т.е. изменению в трех основных "супергомеостатах" - репродуктивном, адаптационном и метаболическом. Следствием является нарастание с возрастом содержания; жира В: теле, снижение: чувствительности тканей к инсулину (предиабет) и развитие атеросклероза, а также формирование таких имеющих ключевое значение для; продолжительности жизни индивидуума феноменов, как метаболическая иммунодепрессия* и канкрофилия; то есть, формирование условий; способствующих возникновению злокачественных новообразований; BtMl Дйльман пришел к убеждению, что старение не запрограммировано; а является побочным; продуктом: реализации генетическойпрограммы,развития[26];.

У- крыс уже после 12'месяцев постнатальной* индивидуальной* жизни; происходит уменьшение: общего числа фолликулов.. К возрасту 1^8-мес: в яичнике наблюдается;; отсутствие, граафовых пузырьков,, а к 24 и 30 - резко уменьшено^ число'растущих, фолликулов^ ВІ яичнике .36' месячной;крысы не обнаруживается ни примордиальных, ни. растущих фолликулов[42]1ИЬ мере старения регулярные циклы у крыс, постепенно удлиняясь, заменяются персистирующим эструсом, который считается эквивалентом менопаузы у человека [10]. Возрастная стерильность у крыс развивается к 15-17 месяцам. Отмечено, что при некоторых фармакологических воздействиях на крыс с постоянной течкой, а также при пересадке яичников старых животных молодым овариоэктомированным крысам способность к циклической деятельности восстанавливается.[77].

Согласно овуляторной гипотезе возникновения эпителиальных опухолей [108]; циклическая пролиферация покровного эпителия і при непрерывных овуляторных циклах ведет к формированию кист включения: В дальнейшем под влиянием различных гормонов; вырабатываемых в строме яичника, пролиферирующие эпителиальные клетки, могут формировать аденомы. Высокий уровень» гонадотропинов также может обладать

стимулирующим эффектом на пролиферирующий эпителий. Однако остается спорным, что цистаденомы являются предшественниками опухолей с низкой степенью злокачественности (пограничных), которые, в свою очередь, развиваются в инвазивные формы эпителиальных карцином. Последние молекулярно-генетические исследования выявили, что гистологически доброкачественные кисты с очагами малигнизации имели мутации гена р53, ответственного за супрессию опухоли, тогда как в доброкачественных опухолях без очагов малигнизации не было отмечено мутации гена р53 [114]. Смысл гипотезы Fathalla M.F. [108] «Incessant ovulation hypothesis» в том, что овуляция каждый раз подвергает клетки покровного эпителия яичника сублетальным повреждениям ДНК (реактивные оксиданты, воспалительные медиаторы, индукция апоптоза) в момент разрыва фолликула. И'затем, во время реставрации поверхности - субмаксимальной стимуляции ростовыми факторами, усиленной пролиферации, эпителио-мезенхимальной трансформации. Таким образом, покровный' эпителий яичника, из которого развивается большинство злокачественных опухолей, подвергается пролиферации и репарации после каждого овуляторного цикла. Чем больше число овуляций, тем выше потенциальный риск отклонений в репаративных процессах, что ведет к злокачественной трансформации [74, 122].

1.2 Регуляторная функция компонентов системы ПОЛ-АО

1.2.1 Роль системы ПОЛ-АО в регуляции клеточного метаболизма Основные эффекты АФК обусловлены их способностью перестраивать физико-химическую систему регуляции клеточного метаболизма мембранами, изменять состав, структуру и функционирование мембран клеток [13], модифицировать воздействие протеинфосфатаз, протеинкиназ и факторов транскрипции на сигнальные пути в клетках [69, 131].

Величина А (ПО — АО), предложенная Б.Н. Лю [53], представляет некоторую условную количественную меру. Этот дисбаланс определяется многообразием инициаторов перекисного окисления и запаздыванием в эволюционном плане в формировании и совершенствовании адаптивных «решений». В начальный период развития старение как таковое ещё отсутствует, и негативная составляющая указанных выше физических факторов, своего рода «помеха», достаточно успешно нейтрализуется пока что не дестабилизированными на этом этапе системами защиты (антиоксидантной, микросомальной, репарационной, иммунологической и др.). Действительно к моменту рождения организма активность антиоксидантных ферментов, как, например, у крыс, максимальна, и это обеспечивает новорожденным животным высокую устойчивость к токсическому действию Ог и его радикалов. В таких защищенных условиях у них поддерживается высокая активность «пролиферативных» ферментов (РНК- и ДНК-полимераз, ДНК-метилтрансферазы и др.), с чем, очевидно, связана максимальная интенсивность пролиферации клеток большинства органов и тканей в пренатальный период и на первом этапе постнатального онтогенеза [135, 155].

Таким образом, существенно то, что в последующие месяцы и годы жизни ввиду постоянного присутствия фактора А (ПО — АО) отдельные звенья защитных систем организма, в том числе антиоксидантной, постепенно истощаются, а указанный дисбаланс, как уже отмечалось, также постепенно возрастает от некоторого начального (базового) его значения А_к (ПО - АО) до, в конечном счёте, «цитолизного» Ац(ПО — АО), проходя через промежуточные ведущие к старению значения Ас (ПО — АО). В результате с возрастом интенсивность ПОЛ и окислительная модификация различных макромолекул в клетках усиливаются, приводя ко многим негативным последствиям. Одним из примеров, подтверждающих указанные положения, служат результаты определения у долгожителей (возраст 100-105 лет) антиоксидантной активности в общей сыворотке крови и в

18 депротеинизированной её фракции путём измерения хемилюминесценции. У долгожителей эта активность по сравнению- с таковой у лиц в возрасте от 18 лет до 91 года значительно снижена, свидетельствуя о зависимости этого показателя от возраста. Наличие такого дисбаланса как фактора, инициирующего окислительный стресс, признаётся характерным для процесса старения [4, 37, 146]. Снижение активности антйоксидантных соединений ферментативной и неферментативной природы обнаруживается также в большинстве тканей стареющих животных [166].

Фактором, провоцирующим возрастзависимые изменения в системе ПО-АО, является- сама окружающая гипероксическая среда. Сложившиеся системы адаптации к гипероксии ослабляют, но не устраняют полностью условия для протекания разрушающих пероксигеназных процессов, которые рассматриваются как своеобразная «плата за жизнь» [59]. Более того, в этой ситуации антиоксидантная система клетки и, в первую очередь, её основная антикислородная ступень защиты, т.е. митохондрии и митохондриальное дыхание, также постепенно трансформируются и деградируют. В результате возникает необратимая тенденция к медленному, но неуклонному снижению потребления ими 0₂, что, естественно, ведёт к соответствующему повышению внутриклеточного уровня р0₂, усилению процессов неферментативного образования различных АФК, ПО липидов и других биологических структур в клетках и одновременно к падению в них эффективности остальных ступеней антиоксидантной системы. Эти объективные неотвратимые преобразования со временем нарастают и накапливаются, вызывая возрастные изменения в живом организме, непрерывно «работая» на его старение. Таким образом, по кислородно-перекисной концепции Лю Б.Н. [53], первостепенную определяющую роль избыточного содержания свободного 0₂ и постепенно нарастающего пероксидантного стресса в возрастном развитии организма.

Устойчивое прооксидантное состояние и избыточный уровень ПОЛ создают в клетке «канцерогенную» ситуацию, ведущую к нарушению в ней структуры и функции ключевых ферментов, мембран и органелл.

19 Образованию такой ситуации способствует процесс нормального старения, при котором дисбаланс Aj(nO — АО) в клетках j-ой ткани постепенно увеличивается с риском в определённых случаях закрепиться в опасном «канцерогенном» диапазоне (Дк)> По этой логике более «подготовленными» к возникновению злокачественных опухолей должны быть органы и ткани с обновляющимся клеточным составом и достаточно высоким уровнем пролиферации, так как при повышенных «пролиферативных» значениях (An)j вероятность их перехода из состояния нормального окислительного митогенеза в соседний диапазон (Ak)j существенно возрастает.

Образование активных форм кислорода и свободнорадикальное
окисление является естественным, физиологическим процессом, постоянно
протекающим в организме: в процессе переноса' электронов в
митохондриальной дыхательной цепи; в реакциях, которые катализируются
митохондриальной¹ цитохром-с-оксидазой, NADPH-оксидазой

фагоцитирующих клеток, ксантиноксидазой микросомальной

монооксигеназой; в реакциях автоокисления адреналина, неферментного окисления гемоглобина, ферредоксинов, хинонов, ксенобиотиков; в биологических системах с наличием ионов металлов с переменной валентностью и, прежде всего, железа (свободных атомов, так называемых внегемовых) [11, 17, 158]. Активные формы кислорода, столь опасные с позиции свободно-радикальной теории старения, организм вырабатывает целенаправленно. Так, при активации иммунных клеток крови, в частности, нейтрофилов, их фермент НАДФН-оксидаза более 90% кислорода восстанавливает до супероксид-анион радикала. Супероксид дисмутаза превращает его в перекись водорода, а миелопероксидаза катализирует окисление перекисью ионов хлора с образованием чрезвычайно активного окислителя — гипохлорита [55].

По своей химической природе ПОЛ — это вариант свободнорадикального окисления (СРО), реакциям которого подвержены все без исключения соединения, однако наиболее чувствительны к СРО липиды:

20 в первую очередь, ненасыщенные жирные кислоты как свободные, так и в составе фосфолипидов. Обнаружено также, что работа мембранных ферментов в высокой степени зависит от их липидного окружения, поэтому изменение состава биологических мембран в результате модификации процессов липопероксидации вызывает торможение активности одних и активацию других мембраносвязанных и мембранозависимых ферментов [8]. Важная физиологическая роль процессов липопероксидации подтверждается работами, показавшими, что синтез простагландинов и лейкотриенов нуждается в образовании перекисей ненасыщенных жирных кислот [22, 50]. Продукты липопероксидации участвуют в процессах фаго- и пиноцитоза и окислительной деструкции чужеродных и вредных веществ. Таким образом, ПОЛ является не только универсальным модификатором свойств биологических мембран, но и важным физиологическим регулятором* их структуры и функции, фактором, устанавливающим и поддерживающим стационарное функционирование,, ферментов, каналообразователей, рецепторов [30] (табл. 1).

Таблица 1 Наиболее важные изменения в мембранных структурах при перекисном окислении липидов [16]

21 Таким образом, активация свободнорадикального окисления связана с целым комплексом процессов внутриклеточного повреждения (рис. 2),

Воспаление,

фагоцитоз и

иммунный

ответ

Усиление продукции свободных радикалов

Ускоренный распад пуринов

Перекисное

окисление

мембранных

липидов

Вторичное

повреждение

клетки

«Сшивка» липидов и белков

Медиаторы воспаления

Апоптоз

Повреждения ДНК

Некробиоз

Токсины

Мутации

Инактивация

рецепторов

и ферментов

Перерождение и гибель клетки

Рис. 2. Патогенез свободнорадикальных повреждений клетки [35]

Экспериментально доказано, что не только разные ткани, но и различные организмы могут отреагировать в ответ на один и тот же сигнал по-разному — это может быть компенсация действия АФК или ее отсутствие и повреждение клетки. Это зависит как от генетически заложенной чувствительности данного вида клеток к действию внешних сигналов, так и от состояния клетки на данный момент. Таким образом, для определенного вида организма в данный момент времени характерно свое собственное, оригинальное соотношение прооксидантов и антиоксидантов, которое определяет его ответ на действие дополнительного АФК-сигнала [69]

Стресе, гипоксия, воспаление, высокие и низкие температуры, физическая нагрузка, практически все патологические состояния сопровождаются, помимо специфического ответа, повышением уровня АФК. Главным в реализации антиоксидантного ответа является дозированность окислительного стресса, т.е. необходимость, с одной стороны, активировать защитные системы, а с другой - не вызвать истощение клеточных ресурсов, срыв адаптации к новым условиям среды и в дальнейшем повреждение [8,126,162].

Таким образом, оксидативный стресс возникает не только при избыточности АФК, но и при недостаточности АОС (не только абсолютной, но и относительной), это сдвиг к преобладанию прооксидантов над антиоксидантами.

1.2.2 Кислородно-перекисная теория старения

Одной из наиболее плодотворно развивающихся в последние годы фундаментальных теорий является свободнорадикальная теория старения, практически одновременно выдвинутая D. Harman в 1956 г. [117] и Н.М. Эмануэлем в 1958 г. [81]. Наиболее значимым фактором, влияющим на клеточное старение, оказался окислительный метаболизм. Оказалось, что его интенсивность обратно пропорциональна продолжительности жизни для многих далеко отстоящих друг от друга видов, причем в расчете на единицу активности супероксиддисмутазы — ключевого фермента антиоксидантной защиты организма [24, 91]. Согласно этой теории, продуцируемые главным образом в митохондриях клеток молекулы супероксида (Ог-.), НоОч, гидроксильного радикала (НО") и, возможно, синглетного кислорода (-Ю₂) повреждают клеточные макромолекулы (ДНК, белки, липиды). Полагают, что активные формы кислорода вызывают повреждения мембран, коллагена, ДНК, хроматина, структурных белков, а также участвуют в эпигенетической регуляции экспрессии ядерных и митохондриальных генов, приводя к метилированию ДНК, влияют на внутриклеточный уровень кальция [43-48].

23 Выявлена положительная корреляция между продолжительностью жизни млекопитающих и резистентностью их клеток к окислительному стрессу, вызываемому различными агентами [123]. Установлена высокая корреляция между активностью основного обмена, активностью СОД и максимальной продолжительностью жизни у животных 14 видов, включая человека. Выявлено существенное накопление с возрастом продуктов окислительного повреждения белков свободными радикалами, генерируемыми нейтрофилами [147].

Сторонники митохондриальной теории старения полагают, что в основе старения лежит прогрессивная потеря функции митохондрий в различных тканях организма [113].

В пользу такой точки зрения свидетельствуют следующие данные:

- накопление в митохондриальной ДНК (мтДНК) больших делеций и
точковых мутаций в тканях пожилых индивидуумов и уменьшение
количества копий;

снижение с возрастом активности ферментов, обеспечивающих перенос электронов в дыхательной цепи, в лимфоцитах, скелетных мышцах и кардиомиоцитах;

как следствие этих процессов - увеличение продукции АКФ и прогрессивное перекисное окисление липидов и белков мембран;

изменения морфологической структуры митохондрий и снижение мембранного потенциала митохондрий, обеспечивающего энергию для синтеза АТФ;

клетки молодых крыс быстро стареют и подвергаются дегенерации, когда в них с помощью микроинъекции вводят митохондрии из фибробластов старых крыс;

- установлена обратная корреляция между продукцией перекиси
водорода митохондриями и максимальной продолжительностью жизни» вида.

Среди современных теорий старения, основанных на предположении, что ДНК является основной мишенью в клетке, доминирует теория

24 соматических мутаций, согласно которой старение является результатом взаимодействия различных эндогенных и экзогенных повреждающих агентов с генетическим материалом клетки и постепенного накопления случайных мутаций в геноме соматических клеток. Повреждения ядерной и митохондриальной ДНК соматических клеток, такие как точечные мутации, делеции и транслокации, приводят к активации или инактивации специфических генов, вовлеченных в регуляцию клеточного цикла и контроль роста [60, 167].

Накопление с возрастом таких мутаций в различных органах и тканях является основным фактором, определяющим развитие возрастной патологии, включая рак. В противоположность апоптозу, при клеточном старении не происходит элиминации дисфункциональных, поврежденных или потенциально неопластических клеток. При клеточном старении наблюдается необратимая остановка пролиферации таких клеток. При этом клеточное старение делает клетки неспособными к опухолевой трансформации, однако такие "старые" клетки персистируют в тканях, способствуя малигнизацни пренеопластических клеток [2, 3, 134].

Постулируемый современной кислородно-перекисной теорией старения и канцерогенеза дисбаланс А (ПО - АО) между про (ПО)- и антиоксиданти ыми (АО) процессами в сторону преобладания первых представляет, по существу, заложенное природой и развивающееся в самом организме главное противоречие, проявляющееся на всех этапах онтогенеза [53].

Б.Н. Лю предлагает для формирования общего представления о кислородно-перекисном механизме возрастного изменения организма следующие принципы, обобщённые в виде постулатов в ряде работ [57,76, 154].

а) старение - процесс необратимый, нерегулируемый и непрерывный. Это следует также из того, что дисбалансы Aj (ПО - АО) однонаправлены, т.е.

25 всегда положительны по знаку, а дестабилизирующее их действие в естественных условиях никогда не прекращается, полностью не компенсируется и, более того, возрастает в ходе онтогенеза. Можно лишь замедлить процесс старения за счёт искусственного повышения антиоксидантной составляющей АО в А,;

б) старение - процесс многоочаговый, так как повреждения
развиваются в разных частях и типах клеток, в различных молекулярных
циклах и в различных системах организма.

в) старение - процесс многопричинный, многофакторный.
Проявляющиеся при нём негативные сдвиги в большинстве своём могут быть
так или иначе представлены производными от состояния гипероксии и,
следовательно, избыточной пероксигенации — первичного и главного
фактора, ответственного за снижение с возрастом интенсивности и
полноценности всех жизненно важных процессов;

г) старение - процесс гетерохронный. Значения дисбаланса Лщ(ПО -
АО) и зависимой от него интенсивности старения (1ст)щ, изменяющиеся во
времени и в пространстве g-ой клетки j-ой ткани, будут характерны именно
для этой клетки, т.е. отражать клеточную индивидуальность в вопросе
старения. Значит, среди множества клеток данной ткани с различными А_Ё1 и
(1ст)_| обязательно должны быть и такие, которые по указанным показателям
наиболее чувствительны к «пероксигеназному» старению. В первую очередь,

> такое состояние неотвратимо наступает в клетках, где начинает нарушаться митохондриальное дыхание и соответственно падать эффективность их основной, антикислородной ступени защиты. Поэтому неудивительно, что наряду с атрофированными клетками, имеющими выраженные возрастные изменения, наблюдаются сохранные клетки, ничем не отличающиеся от клеток молодых организмов [53].

Накопление же конечных продуктов повреждения тканей может быть результатом иных процессов - прежде всего, результатом снижения

26
метаболизма и физиологической регенерации большинства

самообновляющихся тканей в старости — в этих условиях снижается обновление всех макромолекул и биологических структур, что создает возможности для персистенции измененных форм макромолекул вследствие общего увеличения длительности их жизни.

Сейчас все больше склоняются к мнению, что наиболее значимым при старении оказывается усиленное перекисное окисление белков, а не липидов, чему способствует снижение активности СОД как результат снижения общей продукции АФК [3].

Общий анализ данных об участии АФК в процессах старения и сопровождающих старение заболеваний позволяет ряду авторов утверждать, что повреждение под действием АФК макромолекул приводит к мутациям, нестабильности генома в целом и развитию ряда возрастных патологий: рак, сердечно-сосудистые заболевания, возрастная иммунодепрессия, дисфункция мозга, катаракта [47, 104, 156].

Считают также возможным возрастную модификацию структурной организации мембран, обусловленную уменьшением степени ненасыщенности жирных кислот, увеличением содержания лизоформ фосфолипидов, рассматривать как общебиологическую закономерность стареющих организмов [49].

Важным также является разнонаправленность изменений антиоксидантного статуса в различных органах, что соответствует и различной чувствительности к химическим канцерогенам и ионизирующему облучению [46, 63, 106, 170].

Возможно влияние АФК на ускоренное укорочение концевых (теломерных) участков ДНК — процесс, которому придают важную роль как в клеточном делении, так и в его ограничении [70]. Таким образом, окислительный стресс средней интенсивности приводит к индукции клеточной пролиферации.

27
В условиях избыточного рСЬ естественны различные негативные
процессы. Наглядный пример тому — достоверное увеличение с возрастом
отношения окисленного глутатиона к восстановленному (GSSG/GSH) в
митохондриях, выделенных из клеток печени, почек и головного мозга крыс
и мышей. В процессе старения наблюдается накопление окисленных
митохондриальных белков, содержащих реакционноспособные

карбонильные группы. Наличие последних создает возможность образования внутри- и межмолекулярных сшивок, что приводит к потере функциональной активности белков [85]. Изменённый фосфолипидный состав митохондрий гепатоцитов у 18- и 24-месячных крыс, тесно связанный с окислительным повреждением, играет важную роль в возрастном разрушении митохондрий в старости. У животных этих групп значительно увеличено содержание MDA и фосфолипазы А₂ по сравнению с получавшими предварительно витамин Е или с более молодыми [161].

А (ПО-АО) -

ПОЛ плазматической мембраны

Инактивизация

липидо

зависимой

аденилатциклазы

Уменьшение содержания цАМФ ^— в клетке

Снижение дыхания,

стимулируемого цАМФ

Возрастание внутриклеточного р0₂ *~ и дисбаланса А (ПО-АО)

Рис. 3. Система поддержания возрастного снижения уровня цАМФ в клетке и условий для ее старения [53]

Генетическая теория старения утверждает, что клеточное старение является результатом генетической программы, с помощью которой специфические гены ограничивают пролиферацию. Повреждение ядерной и митохондриальнои ДНК соматических клеток, накопление мутаций

28 определяют развитие возрастной патологии, включая рак. Ген белка р53 является чрезвычайно важным для контроля репликативного старения клеток [119]. В результате многих экспериментальных работ выяснено, что при старении сигналы апоптоза становятся неэффективными и потенциально опасные клетки остаются жизнеспособными.

Стресс-индуцируемый апоптоз вызывается слабыми повреждениями клетки. По-видимому, смерть играет биологически полезную роль в элиминации тех клеток, выживание которых вредно для организма в целом. Слабые повреждения способствуют накоплению мутаций в клетках, что в свою очередь может привести к нарушению их функций и онкотрансформации. Не вызывает сомнений, что митохондрии играют ключевую роль в регуляции стресс-индуцируемого апоптоза, так как помимо экспрессии апоптоз-супрессирующих генов семейства bcl-2 эти органеллы являются мишенями и источниками окислительного* стресса, NO и Са⁴⁴, которые в сою очередь являются медиаторами апоптоза [66].

Окисленные модификации липидов и\ белков появляются в» клетках,
вступивших на путь программированной клеточной гибели под действием
неоксидативных индукторов, таких как глюкокортикоиды и ингибиторы
топоизомеразы типа II. Добавление антиоксидантов способно во многих
случаях ингибировать апоптоз. Предполагаемый механизм

проапоптотического действия оксидантов, NO и кислородных радикалов связан с их способностью открывать митохондриальные поры и вызывать выброс AIF и цитохрома С.

Активация гена р53 происходит в ответ на повреждение ДНК, при активации онкогенов, при старении, гипоксии. В активном состоянии р53 белок способен либо временно останавливать клеточный цикл в фазе G1/S с помощью белка р21, либо стимулировать апоптоз через активацию гена Ьах и выходу свободных радикалов О? из митохондрий [52, 65, 66, 96, 112].

29 1.2.3 Окислительный стресс в регуляции апоптоза и пролиферации

внеклеточная среда

увеличение активации лейкоцитов

повышенная продукция гидропероксида

измененияв

метаболизме арахидоновой кислоты

высвобождение Fe²*H3 комплексов с ферретнном,

гемоглобином, миоглобином
трансферретином

повреждение мембран повреждение биомолекул

изменение проницаемости нарушение внутриклеточной

мембран передачи сигналов

некроз пролиферация апоптоз

"утечка" электронов из митохондрий

инактивация или

недостаток антиоксидантов

активация специфических сигнальных путей цитокинаии и ф акторами роста (IL1, TNFa)

активация ферментных коплексов (NADP-оксидаза цитохром Р 450-оксидаза. ксантиноксидаза)

внутриклеточная среда

изменение редокс-потенциала

t активация/ингибирование редокс чувствительных путей

компенсация стресса

Рис. 4. Основные причины возникновения оксидативного стресса и типы возможного клеточного ответа [37]

Существует мнение, что при умеренном оксидативном стрессе вклад свободных радикалов и продуктов СРО в патологию заключается в их взаимодействии с внутриклеточными сигнальными системами [168].

Апоптоз (от rpe4.apoptosis - опадание, листопад) — биологически запрограммированная гибель клетки - процесс элиминации клеток, исчерпавших лимит деления, завершивших выполнение своих функций или клеток с нарушениями генетического аппарата. Гибель клетки путем апоптоза обычно не сопровождается развитием воспаления, так как целостность мембраны не нарушается.

Молекулярно-биологические исследования позволили

идентифицировать 2 основных механизма реализации апоптоза: первый

связан с присоединением особых факторов (семейства TNF-R) к так называемым «рецепторам смерти» (CD95/Fas/Apo-l или TNF-R1) на внешней стороне цитоплазматической мембраны. Этот путь часто называют внешним механизмом реализации апоптоза. Другой путь филогенетически более древний, получил название митохондриального или Bcl-2-регулируемого (по названию ключевого белка Вс1-2, поддерживающего инактивированное состояние проапоптотического белкового комплекса (в состав которого входят прокаспаза-9 (Apaf-З), адаптер Apaf-І, флавопротеин AIF, цитохром с, фактор Smac) [56].

Ключевую роль в механизмах апоптоза играют АФК. Они прямо или опосредованно индуцируют различные изменения на уровне ферментативных и неферментативных, транскрипционных и посттрансляционных процессов, которые в комплексе определяют апоптозные сдвиги в митохондриях, ядре, клеточной мембране и в других структурах клетки. При этом на разных этапах развития апоптоза приобретают синтез и модификация определенных онкогенов [52]. Было обнаружено, что при обработке клеток смесью ксантина и ксантиноксидазы образуются АФК, эффект которых зависит от концентрации этой смеси. Низкие ее концентрации вызывают апоптотическую фрагментацию ДНК, высокие же — индуцируют гибель клеток по типу некроза без типичной фрагментации ДНК [68].

Необходимыми начальными событиями в индукции как старения и возрастных патологий по кислородно-перекисному механизму, так и апоптотического эффекта признаются активная генерация в митохондриях АФК, прежде всего СЬ и продуктов его превращения. Биологическая целесообразность апоптоза некоторых клеток из числа пролиферирующих и дифференцированных может быть связана с необходимостью сохранения здорового жизнеспособного клеточного состава путем устранения клеток как пероксидативно «перегруженных» при окислительном митогенезе, так и

31 специализированных, если они отработали свой ресурс или дифференцируются с нарушением программы экспрессии генов [66].

Обобщенные данные литературы о связи апоптоза при снижении мембранного потенциала митохондрий, вызываемого действием ингибиторов дыхательной цепи, либо разобщителей оксилительного фосфорилирования. В этих же случаях имеет место избыточная генерация АФК и запуск окислительных процессов, причастных к открыванию пор во внутренней мембране митохондрий и к самому апоптозу [].

В отношении нормальных клеток прооксиданты являются индукторами апоптоза, антиоксиданты же однозначно тормозят этот процесс [144]. Прямая причастность АФК и перекисных соединений к индукции апоптоза показана и в отношении опухолевых клеток, причем они теряют способность к апоптозу при гипоксии [112]. Сильным окислителем, причастным к апоптозу различных клеток, является пероксинитрит, который так же известен как ингибитор митохондриального дыхания и марганец-содержащей супероксиддисмутазы, что не может не вызвать окислительный стресс [169].

Первоначальные морфологические признаки апоптоза состоят в уменьшении размеров, сморщивании клетки, уплотнении и фрагментации хроматина. В ядре формируются осмиофильные скопления хроматина, обычно прилежащие к ядерной оболочке. Эти изменения служат самым ранним проявлением апоптоза, предшествующим процессам деградации . На этой стадии прогрессирования апоптоза может быть приостановлено действие ингибиторов, в связи с чем данная стадия развития клеточной гибели обозначается как преапоптоз. Затем в ядерной мембране образуются инвагинации, и хроматиновые фрагменты отшнуровываются от ядра. Такие фрагменты, окруженные мембраной, называют апоптотическими тельцами.

Одно из основных проявлений апоптоза на биохимическом уровне реализуется в ядре клетки и состоит в фрагментации ДНК. Сначала происходит образование крупных фрагментов ДНК, содержащих 700, 200-250, 50-70 тысяч пар оснований (т.п.о.), позже 30-50 т.п.о. Уже на этой

32
стадии регистрируется конденсация хроматина и выпячивание ядерной
мембраны, характерные для апоптоза. Полагают, что именно эти начальный
этап фрагментации хроматина является ключевым событием апоптоза, после
осуществления которого процесс становится необратимым.

Следующий этап фрагментации ДНК - ее межнуклеосомная деградация, т.е. расщепление в результате формирования разрывов (в основном двунитевых) между нуклеосомами с формированием фрагментов, содержащих 180-190 п.о. Именно эти фрагменты выявляются в виде "лесенки" при электрофорезе ДНК апоптотических клеток [65, 68].

Апоптоз представляет собой актуальнейшую проблему современной биологии. Несомненно, что активные метаболиты кислорода и окислительные реакции с их участием в той или иной степени участвуют в этом процессе. Предполагается, что в результате апоптоза выбраковываются клетки с аномально высоким уровнем продукции АФК [71]. Вместе с тем вопрос участия АФК в процессе апоптоза нельзя считать решенным, так как показано, что в некоторых случаях процесс протекает даже в анаэробных условиях, для которых характерно существенное снижение продукции АФК [91]. Казалось бы, этот факт может служить прямым доказательством дополняющей (вторичной) роли окислительного стресса в индукции апоптоза. Однако нефизиологичность условий культивирования аэробных клеток в бескислородных условиях не позволяет принять данный факт за безусловный. Особое внимание в последние годы уделяется изучению роли активированных кислородных метаболитов (АКМ: 0₂, 0₂, Н₂0₂, NO и др.) в развитии апоптоза [160]. Это связано с тем, что высокореакционные АФК образуются во всех аэробных клетках. В физиологических условиях их деструктивное действие сдерживается многоуровневой системой антиоксидантов; нарушение баланса в системе "АФК-антиоксиданты" может привести к гибели клетки. Индуцированный глюкокортикоидами апоптоз тимоцитов значительно снижался в условиях гипоксии (при содержании кислорода в атмосфере менее 5%) [93]. Прямое действие Н₂0₂, NO,

33 пероксинитрита (ONOQ-), а также радиации, ультрафиолетового излучения, токсичных лекарственных препаратов, индуцирующих образование АКМ, вызывает апоптоз . При разных формах индуцированного апоптоза выявлены снижения активности элементов антиоксидантной защиты клеток [96].

Несмотря на очевидную взаимосвязь окислительного стресса с апоптозом, роль конкретных форм АКМ в саморазрушении клеток и механизмы реализации цитотоксичности неясны. Более того, нет однозначного ответа на вопрос, чем является окислительный стресс, следствием или индуктором функциональных изменений, сопровождающих развитие запрограммированной гибели клеток.

Таким образом, при умеренных повреждениях клетки в отсутствие гипоксии происходит редукция трансмембранного потенциала митохондрий и генерация ими АФК. Если- антиоксидантные системы клетки не компенсируют сдвига редокс-потенциала, процесс прогрессирует. При условии отсутствия выраженного энергодефицита' и сохранности генетического аппарата реализуется апоптоз, но глубокая гипоксия и выраженные повреждения ДНК инициируют некробиоз:

1.3 Система ПОЛ-АО в процессе развития опухолей

1.3.1 Изменения про- и антиоксидантних факторов в процессе экспериментального канцерогенеза

Функциональную «глухоту» опухолевых клеток определяют как нарушение регуляции многих метаболических процессов, выход из-под контроля размножения клеток, их контактных взаимодействий [38].

Одинаковые направления большинства биохимических изменений происходят в эмбриональных, регенерирующих и опухолевых клетках по сравнению с нормальными' тканями. Активно пролиферирующие клетки обычно обладают усиленным расходованием липидов, ускоренным

34 гликолизом, нуклеосинтезом, протеосинтезом, повышенной активностью пентозофосфатного пути окисления глюкозы.

При длительном состоянии ускоренной пролиферации любых клеток происходит определенная редукция клеточного метаболизма: например, некоторых специализированных ферментов, принимающие участие в функции нормальных тканей (аргиназа, каталаза, цитохромоксидаза, эстераза и др.), в опухолевых клетках отсутствуют или их активность очень низка (нарушается специфичный ферментный профиль).

Также происходит снижение эффективности работы метаболической
цепи в целом сокращение этапов синтетических процессов наиболее
вероятно в условиях обостренной конкуренции за макроэргические
соединения, выработка которых может затрудняться падением общей
продуктивности митохондриального окислительного фосфорилирования при
редукции митохондриального аппарата, либо при внутритканевой гипоксии
[82,90]. рН - фактор регулирующий направленность и интенсивность
множества внутриклеточных процессов (в опухолевой и нормальной ткани в
состоянии активной пролиферации рН снижается, в условиях, когда
пролиферация сопровождается гипоксией и дисфункцией

митохондриального аппарата. Эти изменения не являются ведущими в опухолевой трансформации и в малигнизации, а служат функциональным отражением или сопутствующим фоном реакции исполнительного аппарата клетки в ответ на регулирующие пролиферацию сигналы и изменения ее среды [29, 79].

В основе переключения клеточного метаболизма в норме лежит кооперативность мембран, их способность к генерализованным структурным переходам за счет перестроек в компонентах мембран (липидах и белках) [14, 37, 45]. Стационарность ПОЛ достигается за счет согласованной работы систем инициирования и регуляции реакции свободнорадикального окисления липидов.

Гипотеза о свободнорадикальном механизме регуляции размножения клеток предлагает считать процессы ПОЛ важными регуляторами в пролиферации клеток, причем антиоксиданты» являются активаторами, а свободные радикалы - ингибиторами данного процесса [53, 61].

Установлено, что в процессе развития асцитной опухоли в плазме крови опухоленосителя наблюдается высокий уровень окислительного стресса, что подтверждено увеличением числа фагоцитов (3-3,5 раза), их гиперактивностью (3-5 раз) и высоким уровнем АФК. Последствия этих процессов, проявились в увеличении концентрации продуктов ПОЛ, в снижении в 7 раз концентрации SH-групп белка и в возрастании уровня свободного гемоглобина до 0,8 г/л [64, 78]. Показано, что в асците концентрациям макрофагов, после миграции в. зону патологии монотонно падает, уровень АФК многократно снижается, (с 390до 4-5 нМэкв^НоОо), что создает благоприятные условия длжинтенсивного роста опухоли.

Также экспериментально, выяснено, что АОЗшлазмьікровиі в, процессе роста опухоли угнетена, что проявляется в понижении концентрации как низкомолекулярных антиоксидантов (а-токоферола и мочевой кислоты в 2,5-3 раза), так и в изменении соотношения белков-антиоксидантов (церулоплазмин-трансферрин), участвующих в регуляции гомеостаза внеклеточного Fe.

Показано, что в экспериментах in vivo антиоксидант дигидрокверцетин тормозит развитие окислительного стресса и его последствий в плазме крови, тогда как в асците наблюдается повышение уровня АФК и регистрируется снижение концентрации опухолевых клеток, что приводит к увеличению продолжительности жизни опухоленосителя в 2-2,5 раза.

В терминальной фазе развития опухоли наблюдается многократное увеличение потенциальная способность полиморфноядерные лейкоциты (ПМЯЛ) генерировать АФК [78] , что может способствовать повышению уровню пероксидов в плазме крови. Примерно в этот же период наблюдается появление на> мазках теней эритроцитов: Увеличение уровня АФК

36 сопровождается не только разрушением эритроцитов, но и появлением свободнорадикальных процессов в плазме. Возможно недостающим звеном в объяснении эффекта повреждения мембраны эритроцитов является нарушение во внеклеточном гомеостазе Fe, вызванного изменениями уровней Цп и Тф.

Схема реализации защиты организма от окислительного стресса при росте асцитной опухоли выглядит следующим образом [78].

В плазме крови наблюдается усиление процессов генерации АФК активированными лейкоцитами, что приводит к понижению концентрации низкомолекулярных антиоксидантов и сульфгидрильных групп белков. Возрастание концентрации церулоплазмина вызывает увеличение в плазме крови соотношения концентраций Fe / Fe , что по всей видимости способствует возрастанию концентрации комплекса трансферрина с Fe, в результате чего интенсифицируется захват Fe лейкоцитами. В дальнейшем наблюдается снижение концентрации трансферрина в плазме.

Дополнительный поток Fe из эритроцитов в плазму крови в условиях развивающегося окисл. стресса. Процесс высвобождения гемоглобина из ускоряет накопление Fe в плазме генерацию все новых форм АФК и снижение концентрации трансферрин. В АЖ быстро пролиферирующие опухолевые клетки осуществляют захват Tf-2Fe~ из внеклеточного пространства, что вероятно вызывает обеднение внеклеточной среды по Fe, в результате чего снижается генерация гидроксил-радикалов в системе. В процессе роста опухоли наблюдается развитие гипоксии, что ведет к ингибированию генерации супероксид-аниона фагоцитами в асците, снижая таким образом уровень окислительного уровня в зоне опухоли.

Основной вклад в динамику изменения антиоксидантной активности плазмы крови и асцитной жидкости опухоленосителя вносят низкомолекулярные соединения - концентрация токоферола в ходе роста опухоли снижается как в плазме крови, так и в асцитной жидкости [64].

Показана активация свободнорадикальных процессов в крови онкологических больных, сопровождающаяся снижением содержания¹ и активности антиокислительных факторов. При этом имеются немногочисленные наблюдения, выявляющие зависимость уровня нарушений в системе антиоксидантов от стадии злокачественного процесса [7,75,89]. На ранних стадиях развития трансплантированных асцитных опухолей АФК-генерирующий потенциал ПМЯЛ снижен, а на поздних -наблюдается гиперактивация ПМЯЛ, который приводит к скачкообразному многократному усилению продукции АФК.

Злокачественный рост сопровождается экстремальным увеличением антиокислительной активности (АОА) липидов клеточных органелл как опухолевых клеток, так и клеток органов опухоленосителя (ядра, митохондрии, микросомы, эритроциты крови), причем, как правило, максимум АОА липидов в органелл ах из, тканей опухоленосителя наблюдается в более ранние сроки, нежели в субклеточных- частицах опухолевых клеток [48, 61].

Несбалансированность работы ферментов антиоксидантной защиты как в самой опухоли, так и в органах опухоленосителя на терминальных приходится на терминальные сроки ее роста, что приводит к резкой интенсификации ПОЛ в организме и подавлению этих процессов в опухолевых клетках [107].

1.3.2 Проблема канцерогенеза на поздних этапах онтогенеза Злокачественный рост, который является болезнью регуляции, в первую очередь регуляции размножения и дифференцировки, может сопровождаться изменениями или сбоями в работе системы^ ПОЛ-АО [7, 14, 23, 75].

Профессором Бернштейном Л.М. [9]* выявлены определенные черты сходства между особенностями старения репродуктивной системы и механизмами гормонального канцерогенеза. Показано, что. однократное

38 введение большой дозы эстрадиола вызывает у крыс хроническую ановуляцию, поликистозное перерождение яичников и в то же время специфическое, и селективное повреждение нейронов n.arcuatus гипоталамуса. Такого же характера повреждение отмечается и при длительном воздействии физиологических концентраций эстрадиола, что может свидетельствовать о роли эндогенных половых гормонов в развитии злокачественного процесса. Анализ подобного «самоудушающего» нейротоксического эффекта эстрадиола, вызывающего старение репродуктивной системы, позволил установить повышение активности пероксидазы в клетках аркуатного ядра, усиление перекисного окисления липидов нейрональных мембран, трансформацию эстрадиола в катехоллэстрогены и катализируемое пероксидазой превращение последних в свободные радикалы — ортосемихиноны, что, с одной стороны, приводит к гибели нейронов, с другой - в существенной степени соответствует «набору» биохимических реакций, обеспечивающих генотоксический вариант эстроген-индуцированного канцерогенеза [93].

В соответствии с точкой зрения профессора Дильмана В.М [26, 27], старение и связанные с ним болезни формируются не за счет снижения, угасания, а, напротив, усиления, перенапряжения деятельности систем, регулирующих энергетические процессы, адаптацию и размножение.

Таким образом, яичник в процессе онтогенеза испытывает морфологические перестройки, что, безусловно, отражается на его репродуктивной и гормон-продуцирующей функции. Вместе с тем на уровне целостного организма в результате возрастных перестроек (изменение баланса про- и антиоксидантов) нарастает состояние оксидативного стресса, способного индуцировать повреждения ДНК, неопластическую трансформацию клеток и некроз. На ранних этапах онтогенеза умеренно повышенный уровень ПОЛ способствует нормальному росту и развитию организма, которые с возрастом постепенно замедляются и сменяются усилением процесса старения. На каком-то этапе пероксидативная

39 составляющая повышается до значений, опасных в отношении канцерогенеза и других возрастных заболеваний. В позднем онтогенезе интенсивность окислительного метаболизма несколько снижается. В процессе канцерогенеза также показана изменчивость в активности антиоксидантных ферментов разных уровней. При этом есть специфичность для разных типов и стадии роста опухолей. В литературе активно обсуждается регуляторная роль АФК для организма в целом, поскольку многие физиологические состояния сопровождаются временной активацией системы ПОЛ-АО и только длительное состояние окислительного стресса способно запускать патогенетические реакции. Поэтому изучение системы ПОЛ-АО на уровне органа - яичника - в процессе возрастных изменений и прогрессирования неоплазмы является важным в понимании вопросов клеточного старения и дифференцировки.

Яичник млекопитающих в процессе онтогенеза

Микроскопически яичник имеет неодинаковую структуру (рис. . 1). Хотя он является внутрибрюшинным органом, но брюшиной не покрыт; свободная поверхность образована однослойным кубическим недеятельным зачатковым эпителием, который располагается на соединительнотканной оболочке. Глубже белочной оболочки яичник образован: расположенным поверхностно более плотным корковым веществом железистой; тканью и расположенным центрально — мозговым; веществом, богатым сосудами и рыхлой соединительной тканью — стромой яичника; Корковое вещество в области ворот яичника постепенно уменьшается; Єтепеньразвития. коркового и мозгового вещества; зависит от возраста самки: Ві корковом веществе расположены фолликулы, находящиеся на разных стадияхразвития [18].

Покровный эпителий - видоизмененный мезотелий;; образован, одним, слоем кубических клеток с многочисленными микроворсинками на выпуклых апикальных поверхностях. Регулярно разрывается при овуляции, затем быстро пролиферирует и мигрирует, замещая дефект в поверхности органа. Регенерация специализированного эпителия органов (печени, поджелудочной железы, почек, желез внутренней секреции) осуществляется по типу регенерационной гипертрофии: в участках повреждения ткань замещается рубцом, а по периферии его происходит гиперплазия и гипертрофия клеток паренхимы. Строма органа представлена плотной соединительнотканной белочной оболочкой, лежащей под покровным эпителием, и своеобразной соединительной тканью, в которой в виде завихрений плотно располагаются; веретеновидные фибробласты и фиброциты. У взрослых эпителий представляет собой упорядочение расположенные клетки, может инвагинировать вглубь яичника, образуя везикулярные или трубчатые (узкие крипты), обладают секреторной активностью. Эпителиальные клетки лежат на тонкой базальной мембране, состоящей из гомогенного вещества с включением коллагеновых волокон. Клетки чаще имеют плоскую форму, а в тех участках, где они покрывают яичник между выступающими фолликулами, их форма кубическая или цилиндрическая. Ядра клеток вытянутой формы с ровными границами. Клетки контактируют друг с другом с помощью нексусов или десмосом [86]. Поверхностный эпителий яичника сохраняет свои особенности до глубокой старости, образуя бугристую структуру на выпуклой поверхности органа [19]. Функция и морфология фолликулярного аппарата яичника в процессе онтогенеза организма самки хорошо изучена, однако состояние покровного эпителия этого органа в процессе угасания репродуктивной функции практически не исследовано.

Таким образом, в период детства происходит активная физиологическая атрезия овоцитов и фолликулов на различных стадиях их развития. По мере полового созревания женского организма выявляются гетерохронность и последовательная функциональная активация звеньев, составляющих гипоталамо-гипофизарно-яичниковую ось. Вначале, нарастает секреция ФСГ (зависимо от содержания тестостерона и эстрогенов), при созревании гипоталамуса начинает продуцироваться рилизинг-гормон ЛГ. При установлении равновесия налаживаются нормальные овуляторные циклы. В течение пубертатного периода значительно усиливаются васкуляризация и иннервация коркового и мозгового вещества, клеток теки растущих фолликулов. В конце этого периода кровоснабжение и иннервация внутренней и наружной тек зреющих фолликулов значительно усложняются. Период половой зрелости характеризуется максимальной массой яичника при преобладании коркового вещества над мозговым. Кроме элементов стромы и половых клеток, в коре яичника половозрелой женщины находятся производные зрелых и дегенерирующих фолликулов: желтые, атретические и белые тела. В период полового созревания вследствие обширной дегенерации фолликулов особенно интенсивно разрастается соединительная ткань. Однако к 20 годам интенсивность этого роста снижается. В последующие годы отмечаются очаговость, неравномерная пролиферация коллагеновых волокон. Примерно с 30 лет начинается постепенный и впоследствии тотальный фиброз стромы коркового вещества яичников. Происходят уплотнение и огрубение волокнистых структур. Эти процессы особенно интенсивны в периферических слоях коркового вещества. Возрастные преобразования параллельно затрагивают не только пул половых клеток, но и гормонпродуцирующие и опорные ткани яичника, вызывая в архитектонике этого органа прогрессирующую с возрастом структурную дезорганизацию, которая в конечном итоге приводит к склерозированию яичников [18]. 1.1.2 Возрастная периодизация функции яичников

Яичник функционирует циклично и, следовательно, его строение зависит от фазы менструального/овариального цикла, а также от фазы онтогенеза, в котором находится организм.

Основные этапы репродуктивного статуса белых крыс: 1-30 сутки — период новорожденности, в яичниках происходит первое мейотическое деление овоцитов и формирование примордиальных фолликулов; 30-60 сутки — завершается вскармливание молоком, оканчивается ювенильный период и начинается ранний этап полового созревания, в яичниках появляются полостные фолликулы; 60-90 сутки — период полового созревания, интенсивного роста; 90-180 сутки — неустойчивый половой статус в период ранней половозрелости, появляется первая течка (овуляция); 180-360 сутки — расцвет репродуктивной функции; 360-400 сутки — период зрелости, предшествующий старческому увяданию, более 400 суток — угасание половой функции [10, 36]. По мере взросления организма нейроэндокринная система животных приобретает большую устойчивость, что связано с формированием прямых и обратных гуморальных связей между различными уровнями регуляции, созреванием регуляторных центров. Таким образом, наиболее сильное влияние на репродуктивную систему оказывают факторы, действующие на ранних возрастных этапах и в критические периоды развития [19].

Возрастная периодизация функции яичников

Яичник функционирует циклично и, следовательно, его строение зависит от фазы менструального/овариального цикла, а также от фазы онтогенеза, в котором находится организм.

Основные этапы репродуктивного статуса белых крыс: 1-30 сутки — период новорожденности, в яичниках происходит первое мейотическое деление овоцитов и формирование примордиальных фолликулов; 30-60 сутки — завершается вскармливание молоком, оканчивается ювенильный период и начинается ранний этап полового созревания, в яичниках появляются полостные фолликулы; 60-90 сутки — период полового созревания, интенсивного роста; 90-180 сутки — неустойчивый половой статус в период ранней половозрелости, появляется первая течка (овуляция); 180-360 сутки — расцвет репродуктивной функции; 360-400 сутки — период зрелости, предшествующий старческому увяданию, более 400 суток — угасание половой функции [10, 36]. По мере взросления организма нейроэндокринная система животных приобретает большую устойчивость, что связано с формированием прямых и обратных гуморальных связей между различными уровнями регуляции, созреванием регуляторных центров. Таким образом, наиболее сильное влияние на репродуктивную систему оказывают факторы, действующие на ранних возрастных этапах и в критические периоды развития [19].

Известно, что корковое вещество яичника содержит все компоненты паренхимы, между которыми располагаются прослойки рыхлой соединительной ткани (строма). Паренхима образована фолликулами яичника на разных уровнях развития, желтыми телами на разных уровнях развития, интерстициальными клетками, белыми телами, атретическими фолликулами.

Существуют циклирующие (полиэстричные) животные, к которым относятся мышевидные грызуны, домашние свиньи, приматы, а также человек, и нециклирующие (моноэстричные) животные, которых большинство. Поэтому крысы — удобный объект для биомедицинских исследований репродуктивной системы [10].

В течение всей жизни женщины в яичниках уменьшается число примордиальных фолликулов, содержащих ооциты; к 45 годам число ооцитов в среднем составляет всего 10 тысяч. В перименопаузальном периоде процесс гибели ооцитов и атрезии примордиальных фолликулов ускоряется. В фолликулах уменьшается число слоев гранулезы и тека-клеток - основных источников стероидов. На смену овуляторным циклам приходят циклы с недостаточностью желтого тела, затем ановуляторные. При отсутствии желтого тела синтез прогестерона резко снижается и возникает прогестерондефицитное состояние - основная причина климактерических дисфункциональных маточных кровотечений из гиперплазированного эндометрия [18].

Старение яичников связано с изменением их физиологической функции. По мнению Buchner F. [94], Кватер Е.И. [41], яичники раньше, чем весь организм подвергаются атрофическим инволюционным изменениям. Одна из особенностей старения организма женщины, вероятно, заключается в прогрессирующем ослаблении способности яичников вырабатывать гормоны и в ослаблении связей с высшими нервными центрами. К одной из самых ярких и глубоко разработанных концепций в геронтологии по праву следует отнести элевационную теорию старения и формирования возрастной патологии у высших организмов, придающей ключевое значение в этих процессах возрастному повышению порога чувствительности гипоталамуса к регуляторным гомеостатическим сигналам [27,28]. В серии экспериментальных исследований и клинических наблюдений было установлено, что именно этот процесс приводит к возрастному включению и выключению функции репродуктивной системы в женском организме, к возрастным изменениям в гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системе, обеспечивающей тонический уровень глюкокортикоидных : гормоновв крови, их циркадный ритм и повышение секреции при стрессе; и, как следствие, развитию состояния, обозначенному как "гиперадаптоз", т.е. изменению в трех основных "супергомеостатах" - репродуктивном, адаптационном и метаболическом. Следствием является нарастание с возрастом содержания; жира В: теле, снижение: чувствительности тканей к инсулину (предиабет) и развитие атеросклероза, а также формирование таких имеющих ключевое значение для; продолжительности жизни индивидуума феноменов, как метаболическая иммунодепрессия и канкрофилия; то есть, формирование условий; способствующих возникновению злокачественных новообразований; BtMl Дйльман пришел к убеждению, что старение не запрограммировано; а является побочным; продуктом: реализации генетическойпрограммы,развития[26];.

У- крыс уже после 12 месяцев постнатальной индивидуальной жизни; происходит уменьшение: общего числа фолликулов.. К возрасту 1 8-мес: в яичнике наблюдается;; отсутствие, граафовых пузырьков,, а к 24 и 30 - резко уменьшено число растущих, фолликулов ВІ яичнике .36 месячной;крысы не обнаруживается ни примордиальных, ни. растущих фолликулов[42]1ИЬ мере старения регулярные циклы у крыс, постепенно удлиняясь, заменяются персистирующим эструсом, который считается эквивалентом менопаузы у человека [10]. Возрастная стерильность у крыс развивается к 15-17 месяцам. Отмечено, что при некоторых фармакологических воздействиях на крыс с постоянной течкой, а также при пересадке яичников старых животных молодым овариоэктомированным крысам способность к циклической деятельности восстанавливается.[77].

Согласно овуляторной гипотезе возникновения эпителиальных опухолей [108]; циклическая пролиферация покровного эпителия І при непрерывных овуляторных циклах ведет к формированию кист включения: В дальнейшем под влиянием различных гормонов; вырабатываемых в строме яичника, пролиферирующие эпителиальные клетки, могут формировать аденомы. Высокий уровень» гонадотропинов также может обладать стимулирующим эффектом на пролиферирующий эпителий. Однако остается спорным, что цистаденомы являются предшественниками опухолей с низкой степенью злокачественности (пограничных), которые, в свою очередь, развиваются в инвазивные формы эпителиальных карцином. Последние молекулярно-генетические исследования выявили, что гистологически доброкачественные кисты с очагами малигнизации имели мутации гена р53, ответственного за супрессию опухоли, тогда как в доброкачественных опухолях без очагов малигнизации не было отмечено мутации гена р53 [114]. Смысл гипотезы Fathalla M.F. [108] «Incessant ovulation hypothesis» в том, что овуляция каждый раз подвергает клетки покровного эпителия яичника сублетальным повреждениям ДНК (реактивные оксиданты, воспалительные медиаторы, индукция апоптоза) в момент разрыва фолликула. И затем, во время реставрации поверхности - субмаксимальной стимуляции ростовыми факторами, усиленной пролиферации, эпителио-мезенхимальной трансформации. Таким образом, покровный эпителий яичника, из которого развивается большинство злокачественных опухолей, подвергается пролиферации и репарации после каждого овуляторного цикла. Чем больше число овуляций, тем выше потенциальный риск отклонений в репаративных процессах, что ведет к злокачественной трансформации [74, 122].

Анализ системы ПО Л-АО в яичниках, эритроцитах и плазме крови крыс в процессе индивидуального развития

Изменяющийся в процессе развития организма баланс в системе ПОЛ-АО в клетке сопровождается изменением функциональной активности мембранных белков и липидов, митохондриальных ферментов, рецепторного аппарата. Также известно, что клетки, имеющие дефекты антиоксидантной защиты, наиболее чувствительны к воздействиям вызывающим их запрограммированную гибель [142].

Результаты оценки системы ПОЛ-АО в ткани яичников крыс на различных этапах онтогенеза представлены в таблице 3.

Следствием повышенного образования АФК является усиление процессов свободнорадикального окисления, что проявляется в увеличении концентрации продуктов окисления. О перекисном окислении липидов (ПОЛ) в тканях судят по количеству малонового диальдегида (МДА). Его активность поддерживается на определенном уровне при участии ферментов антиоксидантной защиты (АОЗ), что позволяет говорить о перекисном гомеостазе. В настоящее время все известные случаи активации ПОЛ сводятся к трем: снижение уровня АОЗ, гипоксия в клетках и образование свободных радикалов в биологической системе. Это подтверждает возможную распространенность и неспецифичность показателей ПОЛ.

В качестве косвенных критериев, указывающих на свободнорадикальный механизм процессов старения, могут служить увеличение продолжительности жизни и скорости пролиферации клеточных культур под влиянием различных антиоксидантов, уменьшение содержания продуктов перекисного окисления в органах и клетках в присутствии различных геропротекторов [6].

Данные такого рода получены в экспериментах путём исследования различных органов и тканей животных и человека на возрастное «пероксигеназное» повреждение. К примеру, с увеличением возраста мышей С57В1/6 с 1 до 15-ти мес. содержание малонового диальдегида (MDA) в печени соответственно возрастало, активность же антиоксидантных ферментов - ГП, каталазы, митохондриальной и цитозольной SODs понижалась [22].

В нашем исследовании уровень МДА в яичниках крыс, составляющий в возрасте 4 мес. 7,13±0,86 мкмоль/мг белка ткани в процессе онтогенеза статистически значимо возрастает, составляя 12,35±0,98 в 9 месяцев и 16,05±0,89 мкмоль/мг белка ткани у 15-месячных животных. У старых животных в 21 месяц происходит некоторое снижение уровня ПОЛ в яичниках до 14,72±0,84 мкмоль/мг белка (табл. 3).

Супероксидисмутаза — ключевой фермент антирадикальной защиты клеток, инактивирующий супероксид анион-радикал и работающий в клетке в каскаде с ферментами, способными разлагать перекись водорода -каталазой и глутатион-пероксидазой. Особенностью функционирования СОД является то обстоятельство, что в присутствии избыточного количества Н2О2 она может образовывать высокореакционно-способный гидроксильный радикал, который атакует белковую молекулу СОД, приводя к ее фрагментации и потере активности [30]. Известно, что интенсивность окислительного метаболизма обратно пропорциональна продолжительности жизни для многих далеко отстоящих друг от друга видов (в расчете на единицу активности супероксиддисмутазы) [2, 81]. При изучении продукции АФК тканями молодых и старых животных было показано, что в головном мозге и в печени старых животных почти в 2 раза снижена активность СОД, в сыворотке старых крыс существенно повышается содержание продуктов перекисного окисления липидов и белков при снижении активности СОД и общей антиокислительной активности сыворотки крови [4].

В литературе также встречаются данные о структурной и функциональной неоднородности митохондрий старых животных, однако по генерации супероксидного радикала митохондриями значимых отличий старых от молодых животных не было выявлено [53, 71]. Также и в микросомах — другом значимом источнике супероксидных радикалов, в старости генерируется в 2 раза меньше АФК, снижение же активности СОД цитоплазмы происходит всего на 40%, что явно компенсирует эти изменения [23]. По данным Снитинского В.В. [53], в тканях скелетных мышц, сердца, лёгких и семенников 1-дневных поросят регистрируется высокое содержание продуктов ПОЛ (MDA, гидроперекисей липидов) и высокая активность SOD при низкой активности глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы. Таким образом, несмотря на относительно высокую - у новорожденных эффективность антиоксидантной системы, в самом раннем постнатальном периоде отмечается усиление окислительной модификации липидов и белков.

В нашем исследовании активность антиоксидантных ферментов в ткани яичников крыс в процессе онтогенеза менялась неоднородно. Так, активность СОД, составляющая в яичниках 4-месячных животных 80,64±4,90 усл.ед/мг белка, также возрастала в процессе онтогенеза и была равна соответственно в 9 месяцев 113,18±11,85. К 15 месяцам активность СОД статистически значимо не изменялась и резко падала у старых животных, составляя в 21 месяц 59,70±6,33 усл.ед/мг белка (табл. 3).

Сходная динамика наблюдалась в отношении уровня каталазы. Так, активность каталазы в яичниках 4-месячных крыс составляла 3,44±0,29ммоль/мг Б и статистически значимо нарастала к 15 месяцам до 4,08±0,15ммоль/мг Б и резко снижалась у старых животных (табл. 3).

Глутатион-редуктаза обеспечивает регенерацию глутатиона из окисленной формы в восстановленную, при этом глутатион, являясь акцептором АФК, способен ингибировать свободнорадикальное окисление.

Максимальный уровень ГР и GSH наблюдается у 9- и 15-месячных животных (табл. 3). Наблюдаемая динамика компонентов системы ПОЛ-АО в ткани яичников крыс свидетельствует об однонаправленных изменениях в возрасте 9 и 15 месяцев и о переходе в эти периоды онтогенеза на более высокий уровень функционирования системы.

Уровень МДА в ткани яичников 21-месячных крыс остается существенно повышенным по сравнению с таковым в 4 месяца. А уровень антиоксидантных ферментов, а также уровень ОБИвосстановленного в ткани яичников животных 21 месяца оказывается статистически значимо и существенно ниже по сравнению с аналогичными показателями у животных в 4 месяца. Таким образом, в 21 месяц у старых животных ДПО-АО оказывается существенно выше по сравнению с ДПО-АО во всех других возрастных группах.

Уровень МДА в эритроцитах является весьма информативным показателем интенсивности процессов свободнорадикального окисления в мембранах. Усиление процессов ПОЛ приводит к уменьшению содержания полиненасыщенных жирных кислот, снижения активности мембрансвязанных ферментов, что в свою очередь приводит к окислительному гемолизу эритроцитов. В настоящее время повышенную активность физиологической антиоксидантной системы и интенсификацию процессов ПОЛ рассматривают как естественный адаптационно-компенсаторный процесс, поскольку гидроперекиси являются активаторами синтеза простагландинов, влияющих на поддержание тромбоцитарно-сосудистого гемостаза [45].

Показатели ПОЛ-АО в крови крыс в процессе онтогенеза

Обязательным условием ПОЛ является наличие в системе свободных радикалов, инициирующих реакции окисления. Известно, что супероксидный радикал и перекись водорода в низких концентрациях стимулируют деление клеток [83]. Вследствие относительно слабой утилизации Оз дефектными митохондриями опухолевых клеток устанавливается состояние внутриклеточной гипероксии [46]. Возникающий при этом окислительный стресс является важным повреждающим фактором для всех компонентов клетки [41,114].

Известно, что при развитии опухолевого процесса существенно нарушаются ферментные системы защиты организма от токсического действия продуктов перекисного окисления липидов. Несмотря на повышение активности этих ферментов в органах животного-опухоленосителя на некоторые сроки развития неоплазмы, все же наблюдается существенное накопление перекисей, вносящих определенный вклад в состояние кахексии, наступающее в организме на поздних стадиях опухолевого процесса [76].

Уровень ПОЛ служат отражением адаптационных реакций организма на клеточном уровне. Длительная активация ПОЛ приводит к накоплению конечных токсических продуктов (свободных радикалов жирных кислот, липоперекисей, альдегидов, кетонов, оксикислот) и развитию синдрома липидной пероксидации.

Существуют данные литературы, согласно которым возрастание митотической активности злокачественных опухолей может сопровождаться увеличением продукции супероксидного радикала. В опухолевых клетках не происходит должной элиминации активированных метаболитов кислорода. Установлено также, что активность СОД снижается в организме животных, начиная с ранних стадий опухолевого роста и достигая минимума к моменту гибели [64, 80]. Также экспериментально показано, что активность супероксиддисмутазы и каталазы в асцитных опухолях ниже, чем в солидной опухоли и стационарная фаза опухолевого роста характеризовалась повышением активности супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы [66].

На модели рака лёгкого Льюис показано, что развитие неопластического процесса в организме носит системный характер. Это обусловлено постепенным перерастанием местного процесса в поражение большинства систем организма, вызванное каскадом нарушений метаболических процессов в других, отдалённых от первичного очага поражения, органах и тканях [49]. При развитии спонтанного лейкоза происходит нарушение регуляции процессов образования и детоксикации АФК, которое наибольшим было в митохондриях печени. В этих органеллах обнаружено повышение стационарной концентрации 02 , а в цитозоле и митохондриях клеток печени - падение содержания восстановленного GSH и величины отношения активностей SOD/GPX. Все эти сдвиги свидетельствовали об установлении в клетках «лейкозного» организма прооксидантного состояния, что, судя и по литературным данным, характерно для пренеопластических изменений в метаболизме в данном случае клеток печени [14].

Нами установлено, что активность каталазы в клетках опухоли яичников у молодых животных на терминальной стадии ниже, чем на логарифмической (0,385±0,49 против 0,412±0,057 ммоль/мин/мг белка, соответственно). Та же динамика данного фермента сохраняется и с увеличением возраста животного-опухоленосителя - активность каталазы в опухоли падает с 0,460±0,042 до 0,327±0,051 ммоль/мин/мг белка (рис. 19).

При исследовании уровня ПОЛ в асцитической жидкости крыс с опухолью яичников нами было обнаружено, что у животных в процессе увеличения опухолевых клеток в асците происходит накопление вторичного продукта ПОЛ-МДА. Так, у 4-месячных животных на логарифмической стадии роста уровень МДА в асците составляет 3,87±0,42 мкмоль/л, а на терминальной - 5,16±0,78 мкмоль/л (табл. 5). У 21 месячных животных уровень МДА также возрастает с 4,25±0,31 мкмоль/л на log-фазе до 7,43±0,57 мкмоль/л на term-фазе.

Активность ГР также возрастает по мере роста опухоли в брюшной полости, составляя в начале роста 3,16±0,33, а на терминальной фазе-4,02±0,25 ммоль/мин/мг белка (рис. 22) у животных 4 месяцов, у 21-месячных животных также наблюдается тенденция к росту активности фермента (2,65±0,17 на log-фазе против 2,97±0,13 ммоль/мин/мг белка на терминальной фазе).

Активность ГР (ммоль/мг белка) в асцитической жидкости в зависимости от стадии роста ОЯ и возраста животных-опухоленосителей Развитие опухолевого процесса сопровождается реакцией неспецифического иммунного ответа, включающего изменение активности, численности и локализации эффекторных клеток (нейтрофилы, моноциты). Подобные изменения в картине крови способствуют увеличению лейкоцитарной секреции активных форм кислорода (АФК) [63].

Уровень АФК является результатом как минимум двух разнонаправленных процессов, а именно — выработки АФК фагоцитами и деградации этих соединений антиоксидантами плазмы крови. В исследовании Шаталина И.Я. [78] показано, что к середине 2-й фазы развития гепатомы Зайделя уровень АФК в плазме повышается более чем в 2,5 раза, что согласуется с увеличением АФК-генерирующей активности полиморфноядерных лейкоцитов крови в 4-5 раз и с увеличением концентрации лейкоцитов в 6-7 раз [58].

Выход в общий кровоток и распространение по всему организму АФК, продуктов ПОЛ, ингибиторов дыхания, изоферментов гексокиназы и других веществ, продуцируемых неоплазмой, с одной стороны, и транспорт различных антиоксидантов, глюкозы, липидов, азотистых соединений в неоплазму из отдалённых тканей — с другой, изменяют метаболизм в этих тканях по типу опухолевого. Одни факторы (антиоксиданты) в порядке защиты мобилизуются организмом для подавления опухолевого процесса, другие же (липиды, глюкоза, азотистые соединения), напротив, захватываются неоплазмой для поддержания своего роста. В подобном взаимодействии организма и опухоли кроется вероятная причина известной деспециализации и уменьшения управляемости клеток тканей, непосредственно не поражённых опухолью, постепенное перепрограммирование в них процессов в сторону, характерную для самого новообразования. Такие проявления системного действия опухоли на организм были подробно изложены еще в монографиях Шапота [79] и Кавецкого [38].

Похожие диссертации на Система "перекисное окисление липидов-антиоксиданты" у крыс на разных стадиях онтогенеза и канцерогенеза

Окислительно-восстановительный гомеостаз на примере системы "активированные нейтрофилы - пероксидантное окисление липидов - антиоксиданты" в различные периоды подготовки пловцовВеличко, Татьяна Ивановна

Особенности адаптации системы перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы (ПОЛ-АОС) к регулярным занятиям плаванием у детей 7-9 летГригорьева Наталья Михайловна

Состояние системы "перекисное окисление липидов-антиоксидантная защита" под влиянием аэробных физических нагрузок у женщин 20-39 летЗаварухина Светлана Александровна

Циркадианная ритмичность показателей перекисного окисления липидов у женщин с нейроциркуляторной дистониейКодуа Людмила Семеновна

Влияние гипербарической оксигенации в клинических режимах на перекисное окисление липидов и антиоксидантную защиту головного мозга здорового организмаШепелева Ярослава Викторовна

Влияние гипербарической оксигенации в клинически применяемых режимах на перекисное окисление липидов и антиоксидантную активность легких здорового организмаЯковлев Николай Викторович

Морфофункциональный статус, состояние микроциркуляции и перекисное окисление липидов у детей 8-10 лет, проживающих в крупном промышленном городеМухамедиева Альфия Рахимовна

Процессы перекисного окисления липидов и некоторые показатели липидного обмена у женщин 40-58 лет, занимающихся аэробикойЛиханов Николай Анатольевич

Исследование влияния физических и химических воздействий на перекисное окисление липидов и функциональное состояние организма крысКирилов Алексей Александрович

Возрастные и тканеспецифические особенности перекисного окисления липидов и белков при остром стрессе и введении -токоферола на разных этапах постнатального онтогенезаЧумакова Анна Сергеевна