Содержание к диссертации
Введение
1. Структура и функции эукариотической РНК-полимеразы III 7
1.1. Структура промоторов, узнаваемых РНК-полимеразой III 7
1.2. Транскрипционные факторы и сборка инициаторного комплекса 9
1.3. Субъединичный состав ядерной РНК-полимеразы III 19
1.4. Элонгация, терминация и реинициация транскрипции с участием РНК-полимеразы III 30
1.5. Регуляция активности РНК-полимеразы III 33
1.6. Заключение 35
2. Структурно-функциональный анализ генов, кодирующих специфические субъединицы РНК-полимераз II и III Schizosaccharomycespombe 36
2.1. Гены, кодирующие малые специфические субъединицы РНК-полимеразы II Schizosaccharomyces pombe 36
2.1.1. Идентификация гена rpb-Ґ Sch. pombe и функциональное тестирование его кДНК в клетках S. cerevisiae 36
2.1.2. Клонирование и характеристика фрагмента генома Sch. pombe, содержащего ген незаменимой субъединицы Rpb ядерной РНК-полимеразы II 41
2.1.3. Установление хромосомной локализации гена rpb9+ Sch. pombe 47
2.2. РНК-полимераза III Sch. pombe: клонирование и структурнофункциональный анализ генов специфических субъединиц 51
2.2.1. Клонирование кДНК, кодирующих специфические субъединицы РНК-полимеразы III Sch. pombe 51
2.2.2. Сравнительный структурный и функциональный анализ специфических субъединиц РНК-полимеразы III Sch. pombe и S. cerevisiae 57
2.2.3. Очистка РНК-полимеразы III Sch. pombe и анализ ее субъединичного состава с помощью TOF-MALDI масс-спектрометрии 74
3. Материалы и методы 78
3.1. Материалы 78
3.2. Методы 86
Выводы 101
- Транскрипционные факторы и сборка инициаторного комплекса
- Элонгация, терминация и реинициация транскрипции с участием РНК-полимеразы III
- РНК-полимераза III Sch. pombe: клонирование и структурнофункциональный анализ генов специфических субъединиц
- Очистка РНК-полимеразы III Sch. pombe и анализ ее субъединичного состава с помощью TOF-MALDI масс-спектрометрии
Транскрипционные факторы и сборка инициаторного комплекса
В 1980 г. Сегалл и др., фракционируя экстракт клеток HeLa на колонке с фосфоцеллюлозой, обнаружили, что для инициации транскрипции с участием РНК-полимеразы Ш необходимы три фракции белков - А, В и С, которые смывались с колонки соответственно 100, 100-350 и 350-600 мМ хлоридом калия [41]. Эти ученые установили, что для инициации транскрипции с промоторов второго типа требуются белки фракций В и С, в то время как для инициации транскрипции с промоторов первого типа требуется наличие всех трех фракций. Впоследствии белки фракций А, В и С были названы транскрипционными факторами (Transcriptions Factors) РНК-полимеразы Ш FIIIA, TFII1B и TF1IIC. На сегодняшний день наиболее охарактеризованными являются инициаторные факторы транскрипционных систем S. cerevisiae и Homo sapiens. TFIIIA Регуляторная область ICR промоторов первого типа узнается транскрипционным фактором TFI1IA (рис. 2А). Комплекс TFIIIA-ДНК распознается фактором TFIIIC, который в свою очередь взаимодействует с TF111B. Фактор TFIIIA X. laevis стал первым эукариотическим фактором транскрипции, очищенным до гомогенного состояния [42], и первым фактором, кДНК которого была клонирована [43]. Этот фактор также явился первым членом семейства белков, содержащих цинковые пальцы - его 344 а.о. организованы в 9 тандемно повторяющихся доменов, осуществляющих связывание матрицы ДНК в присутствии ионов цинка [44]. Фактор TFITIA обладает способностью взаимодействовать с транскриптом 5S РНК, образуя цитоплазматическую частицу с коэффициентом седиментации 7S [45]. Полагают, что РНК-связывающая активность TFIIIA может использоваться как часть регуляции синтеза 5S РНК in vivo по принципу «обратной связи» [46-48]: белок ТРША не может связываться с 5S ДНК и 5S РНК одновременно, поэтому накопление транскриптов 5S РНК уменьшает количество «свободного» фактора TFIUA, что сокращает образование инициаторных комплексов на промоторе гена 5S РНК. Пространственная организация фактора TFIIIA X. laevis была установлена методами ЯМР и рентгеноструктурного анализа [49, 50]. Было показано, что с С-боксом промотора гена 5S рРНК взаимодействуют три N-концевых цинковых пальца (пальцы 1-3), с А-боксом контактируют пальцы 7-9, а три средних цинковых пальца (пальцы 4-6) взаимодействуют с промежуточным сегментом промотора.
Фактор ТИПА быстро эволюционировал. Так, сравнение аминокислотных последовательностей белков ТРША S. cerevisiae, Sch. pombe и Н. sapiens [51] позволяет обнаружить, что сходство этих белков между собой ограничивается лишь цинк-связывающими доменами. Кроме того, в отличие от своих гомологов из S. cerevisiae и Н. sapiens, ТРША Sch. pombe содержит 10, а не 9 цинковых пальцев [52]. Пространственная организация инициаторого комплекса на промоторах первого типа, установленная для гена 5S РНК S. cerevisiae с использованием техники фотоактивируемых сшивок [25], представлена на рис. 2А. TFI1IC А и В-боксы промоторов второго типа узнаются мультибелковым комплексом TFIIIC [53]. Поскольку расстояние между А и В-боксами сильно варьирует даже среди генов тРНК одного организма, структура фактора должна быть уникальным образом адаптирована для одновременного связывания с А и В-боксами промотора. Фактор TFIIIC (или х) S. cerevisiae является мультисубъединичным белком, состоящим из 6 субъединиц: Tfc3/xl38, Tfc4/xl31/PCFl, Tfcl/x95, Tfc6/x91, Tfc8/x60 и Tfc7/x55 (табл. 1). Гены, кодирующие эти субъединицы, клонированы и показано, что разрушение любого из них ведет к летальному фенотипу дрожжевой клетки [54-60]. С помощью электронной микроскопии комплекса TFIIIC-ДНК было установлено, что шесть субъединиц фактора TFIHC организованы в два глобулярных домена, тд и хв [23], связанных очень гибким линкером, чувствительным к протеолизу. Именно из-за того, что линкерный домен может вытягиваться, придавая белку вид гантели, фактор TFHIC способен одновременно связываться с А- и В-боксами промотора гена тРНК, независимо от расстояния между ними [23] (рис. 2). Домены хд и тв получили свои названия из-за способности взаимодействовать соответственно с боксами А и В промотора гена тРНК. тв состоит из трех субъединиц: Tfc3/xl38, Tfc6/x91 и Tfc8/x60 [58, 60]. Субъединица Tfc8/x60 является линкером между доменами тд и Тв- Tfc6/x91 и Tfc3/xl38 участвуют в связывании ДНК [58], причем Tfc6/x91 располагается в дистальной части гена, перекрывая терминатор транскрипции [25, 58]. Субъединицы Tfc6/x95, Tfc4/xl31 и Tfc7/x55 образуют домен тд, который связывается с 5 -областью гена. Белок Tfc4/xl31 обладает интересной особенностью - он содержит 11 тетратрикопептидных повторов (TPR), участвующих в белок-белковых взаимодействиях [57]. Повтор состоит из 34 аминокислотных остатков, 8 из которых высококонсервативны или инвариантны в каждой копии повтора [61]. Девять TPR-повторов субъединицы Tfc4/xl31 фактора TFIIIC S. cerevisiae расположены в N-проксимальной части белка, образуя два кластера из 5 и 4 повторов. Еще два повтора, располагаясь отдельно друг от друга, находятся в С-концевой части. В структурном отношении TPR-мотив - это две антипараллельные ос-спирали [62, 63]. Именно TPR-повторы субъединицы Tfc4/xl31 осуществляют взаимодействие с субъединицей Brf фактора ТЕШВ [64]. Кроме TPR-повторов, Tfc4/xl31 содержит мотив «спираль-петля-спираль» [61]. Модель пространственной организации инициаторных комплексов, формируемых на промоторах генов 5S РНК и тРНК, построенная по результатам опытов с использованием техники двухгибридной системы и фотоафинных сшивок, представлена на рис. 2. Субъединица Tfc8 фактора TFIIIC изображена в наиболее вытянутой форме по отношению к другим субъединицам этого фактора, поскольку в белковом комплексе она связывает два домена TFIHC - хд и хв, а также взаимодействует с фактором TFlLLB.
В геноме Sch. pombe с помощью программы BLAST было обнаружено пять белков, обладающих сходством по первичной структуре с субъединицами фактора TFIIIC S. cerevisiae [51]. На сегодняшний день клонированы гены четырех субъединиц этого фактора и показано, что белковые продукты этих генов способны образовывать ДНК-связывающий комплекс с транскрипционной активностью, присущей фактору TFIIIC [65] Человеческий фактор hTFfflC отличается от такового у дрожжей S. cerevisiae (табл. 1). Хроматографически он может быть разделен на два компонента - hTFUICl и hTFITIC2 [66-68]. hTFHIC2 является наиболее изученным белковым комлексом фактора hTFfflC и состоит из пяти субъединиц с молекулярными массами 220,110,102, 90 и 63 кДа [68, 69], которые имеют гомологов среди субъединиц фактора TFffiC S. cerevisiae. Большая субъединица hTFIIIC-220 фактора hTFIIIC2 обладает способностью взаимодействовать с В-боксом промотора и является функциональным гомологом субъединицы Tfc3/xl38 S. cerevisiae, хотя степень гомологии первичных структур очень низка. Субъединица hTFIIIC-102 содержит 11 TPR-повторов и гомологична дрожжевой субъедининце Tfc4/xl31. Установлено, что фактор hBrf человека (hTFHIB70) взаимодействует с субъединицей hTFIIIC-102 посредством TPR-доменов. Субъединица hTFIIIC-63 фактора hTFITJC2 связывается с А-боксом промотора и является гомологом субъединицы Тгс1/т95 почкующихся дрожжей. Субъединицы hTFinC-220, hTFDIC-110 и hTFIHC90 фактора hTFIEC человека обладают гистон-ацетилтрансферазной активностью [70, 71]. На сегодняшний день это единственно известный случай наличия сразу трех белков с ацетилтрансферазной активностью в одном белковом комплексе. Возможно, это свойство является уникальной особенностью фактора hTFIIIC2 человека. Субъединицы комплекса TF11IC S. cerevisiae гистон-ацетилтрансферазной активностью не обладают [4] Известно, что субъединицы hTFinC-102, hTFIIIC-63 и hTFinC90 фактора hTFIEO способны взаимодействовать с субъединицей hBrf71FlllB70 [70, 72], hTFIIIC-102 и hTFinC-63 связываются с ТВР, а субъединицы hTFIIIC-63 и hTFIIIC-90 - с РНК-полимеразой III.
Элонгация, терминация и реинициация транскрипции с участием РНК-полимеразы III
Элонгация. В процессе инциации РНК-полимераза Ш расплетает двойную спираль ДНК в районе точки начала транскрипции. Плавление ДНК является температуро-зависимым процессом [159]. Этот процесс требует участия фактора TFlllB, поскольку было установлено, что мутации в Brf7TFlllB70 или B"/TFII1B90 препятствуют образованию открытого промоторного комплекса [160]. После образования открытого комплекса РНК-полимераза Ш, как и другие многосубъединичные РНК-полимеразы, вступает в фазу абортивной инициации, в ходе которой ею синтезируются короткие транскрипты длиной в несколько (2-5) рибонуклеотидов [161]. РНК-полимераза III остается связанной с TFlllB пока синтезируемая цепь РНК не достигнет длины по-крайней мере в 5 нуклеотидов [159]. Движение РНК-полимеразы III по матрице не является монотонным, в некоторых местах фермент совершает остановки (задержки, паузы). Так, например, для транскрипции in vitro с 17 по 46 нуклеотид в гене SUP4 тРНКТуг при 20С РНК-полимеразе требуется 3 сек; но уже 4,1 сек необходимы для того, чтобы синтезировать следующие 9 нуклеотидов [162]. В узнавание труднопроходимых участков, где и происходят задержки, вовлечена субъединица РНК-полимеразы Ш Rpcll [146]. В то время как РНК-полимеразам I и П для эффективной элонгации требуется набор вспомогательных факторов, РНК-полимераза Ш, по-видимому, не нуждается в каких-либо добавочных белках. Возможно это связано с тем, что, во-первых, субъединица Rpcl 1 (TFIIS-подобная субъединица РНК-полимеразы Ш) выполняет функции фактора элонгации, и во-вторых, транскрипты, синтезируемые РНК-полимеразой Ш, отличаются небольшой протяженностью (100-200 п.о.). Большой белковый комплекс, образованный факторами транскрипции на внутригенных промоторах, не вытесняется РНК-полимеразой во время ее продвижения вдоль гена [163]. Многочисленные контакты внутри транскрипционного комплекса (как белок-белковые, так и белок-ДНК) являются необходимыми для сохранения его целостности в процессе транскрипции. Предполагают, что РНК-полимераза Ш во время синтеза РНК временно вытесняет какой-то один фактор с его участка связывания на ДНК, но фактор по-прежнему остается в комплексе благодаря белок-белковым контактам с другими факторами, все еще взаимодействующими с ДНК. Взаимодействие TFHIB с ДНК перед точкой начала транскрипции в этом смысле является особенно важным, поскольку благодаря именно этому взаимодействию факторы TFIIIC и ТИПА не вытесняются РНК-полимеразой Ш с внутригенных промоторов [163]. Терминация. Процесс терминации включает узнавание терминаторных последовательностей и разрушение элонгационного комплекса с высвобождением новосинтезированного транскрипта. РНК-полимераза Ш дрожжей - единственная из всех ядерных РНК-полимераз, которая способна осуществлять остановку синтеза РНК без каких-либо добавочных факторов. РНК-полимераза Ш распознает сигналы терминации, которые представлены политимидиновыми последовательностями в кодирующей цепи [51, 164, 165]: четыре остатка тимидина подряд вызывают терминацию РНК-полимеразы Ш Xenopus и человека, 5 - Sch. pombe, и 6 - S. cerevisiae.
Способность расщеплять новосинтезированный РНК-транскрипт присуща самой РНК-полимеразе Ш и стимулируется субъединицей Rpcll фермента [146] без участия каких-либо добавочных факторов. В опытах in vitro для системы транскрипции пекарских дрожжей S. cerevisiae было установлено, что в распознавании сайтов терминации участвуют субъединицы Rpc37 и Rpc53 РНК-полимеразы Ш [147]: форма РНК-полимеразы Ш, лишенная гетеродимера Rpc37-Rpc53, не способна узнавать сайт терминации и синтезирует более длинные транскрипты [147]. Также установлено, что в то время как фермент дикого типа совершает 23 цикла транскрипции за 10 мин, фермент, лишенный субъединиц Rpcll-Rpc37-Rpc53 за то же время совершает только 10 циклов транскрипции [147]. Таким образом, за эффективное узнавание сайтов терминации и реинициацию отвечает триада субъединиц Rpcl 1-Rpc37-Rpc53 РНК-полимеразы Ш. В опытах in vitro на линейной матрице было показано, что делеции или мутации в терминаторной области влияют как на инициацию, так и на реинициацию [68, 166, 167], свидетельствуя о сопряженности этих двух процессов. Возникает вопрос, вовлечены ли в процесс терминации какие-либо белки, не являющиеся белками РНК-полимеразы Ш («внешние» факторы терминации)? В экспериментах с экстрактами ядер клеток линии HeLa было показано, что для высвобождения РНК-транскрипта на терминаторе и реинициации транскрипции необходим аутоантиген La [168-170]. Другие авторы установили, что в случае РНК-полимеразы Ш человека терминацию и реинициацию транскрипции стимулируют коактиваторы РНК-полимеразы П - ДНК-топоизомераза I и РС4 [73, 166], а также NF1-полипептиды, обладающие ДНК-связывающей активностью и узнающие последовательности с консенсусом 5 - YTGGCANNNTGCCAR-3 . Мутации в последовательности ДНК, распознаваемые фактором NF1, приводят к тому, что РНК-полимераза Ш, не заканчивая синтез РНК в нужном месте, синтезирует более длинные транскрипты. Реинициация. Реинициация на промоторах генов, транскрибируемых РНК-полимеразой Ш, происходит гораздо быстрее (в 5-10 раз), чем инициация de novo [167]. Так, в процессе многочисленных раундов транскрипции для синтеза молекулы тРНК при 22С РНК-полимеразе Ш требуется 35 сек, в то время как на синтез первого транскрипта она затрачивает около 5 мин [167]. На стадии инициации РНК-полимераза Ш взаимодействует с прединициаторным комплексом (например, тДНК-ТИПС-ТТТПВ) с образованием закрытого комплекса, который легко изомеризуется в открытый при комнатной температуре [159]. В целом, рекрутирование РНК-полимеразы Ш и формирование открытого комплекса является медленным процессом. После завершения фазы элонгации, которая на коротких генах класса Ш является очень быстрой, происходит терминация. На этой стадии РНК-полимераза Ш может диссоциировать с матрицы, а может реиницировать синтез, не диссоциируя с ДНК, как это показано на рис. 6: факторы TFlllA, ТППВ и TFTOC обладают способностью изгибать ДНК и таким образом сближают два конца гена [171], облегчая тем самым рециркуляцию РНК-полимеразы Ш от промотора к точке начала транскрипции [167] одного и того же гена. Кроме того, в этом случае РНК-полимераза Ш минует медленную стадию связывания с ДНК. Поскольку гены класса Ш в основном очень короткие ( 100 п.о.), облегченная реинициация, возможно, достигается за счет того, что терминирующая РНК-полимераза Ш все еще находится в составе прединициаторного комплекса и поэтому имеет очень большие шансы вновь быть связанной с той же самой транскрипционной единицей. Вероятно, процесс реинициации сопряжен с терминацией, поскольку установлено, что на усеченных генах класса Ш не наблюдается эффективной реинициации [167]. Известно, что один TFIIIB, располагаясь перед точкой начала транскрипции, является достаточным для регулирования многих раундов транскрипции с генов тРНК и U6-PHK [79]. Процесс повторного (reiterative) синтеза транскриптов РНК-полимеразой Ш представлен на рис. 7.
РНК-полимераза III Sch. pombe: клонирование и структурнофункциональный анализ генов специфических субъединиц
К началу данных исследований из трех форм ядерных РНК-полимераз делящихся дрожжей Sch. pombe РНК-полимераза III оставалась наименее изученным ферментом как с молекулярно-генетической, так и с биохимической точки зрения. Помимо кДНК и генов, кодирующих семь общих субъединиц этого ферментного комплекса (Rpb5, Rpb6, Rpb8, RpblO, RpclO, Rpcl9 и Rpc40), клонированных в нашей группе [6, 7, 9, 140, 143, 190, 191], французскими коллегами из лаборатории П. Тюрьо (отдел биохимии и молекулярной генетики Центра атомной энергии в Сакле) была охарактеризована кДНК субъединицы Rpc37. Генетические детерминанты, кодирующие другие специфические субъединицы РНК-полимеразы III Sch. pombe, оставались охарактеризованными. Целью данной части работы явилось клонирование и характеристика кДНК, кодирующих специфические субъединицы РНК-полимеразы HI Sch. pombe, изучение способности этих субъединиц в опытах по межвидовой комплементации замещать in vivo гомологичные компоненты пекарских дрожжей S. cerevisiae, а также выделение и очистка активного препарата РНК-полимеразы III Sch. pombe. 2.2.1. Клонирование кДНК, кодирующих специфические субъединицы РНК-полимеразы HI Sch. pombe Компьютерный анализ базы данных Сэнгеровского центра по первичной структуре генома делящихся дрожжей с помощью программы BLAST [205], позволил выявить в составе космид, секвенированных этим центром, последовательности Sch. pombe, гомологичные генам субъединиц РНК-полимеразы III S. cerevisiae. На основании этой информации для каждой из специфических субъединиц РНК-полимеразы HI Sch. pombe были сконструированы специфические праймеры (табл. 4), которые использовались для амплификации соответствующих кДНК на матрице суммарной кДНК-клонотеки [195]. Исключение составляла субъединица Rpcll: клон pELll, содержащий вставку кДНК гена грсІҐ Sch. pombe в векторе pDB20, был получен при просеивании кДНК-клонотеки Sch. pombe с использованием специфических праймеров oGVS326 и OGVS327 по методу последовательных разведений [6]. В процессе секвенирования клонов, несущих вставку кДНК rpc25+ Sch. pombe, нами были обнаружены две плазмиды, - pGP25-2 и pGP25-13, содержащие мутантные формы rpc25 Sch. pombe. кДНК грс25 в плазмиде pGP25-2 содержала мутацию в первом положении семьдесят второго кодона (ТТС— АТС), приводящую к замене фенилаланина на изолейцин (F72I). Вставка грс25 в плазмиде pGP25-13 несла мутацию TGG- CGG, обуславливающую замену триптофана в двести первом положении на аргинин (W201R). Из рис. 32 видно, что указанные мутации затрагивают консервативные в эволюции остатки фенилаланина и триптофана (на рис. 32 обсуждаемые аминокислотные замены выделены жирным шрифтом). Именно поэтому представлялось интересным проанализировать полученные мутантные аллели rpc25 Sch. pombe в опытах по межвидовой комплементации.
Результаты функционального тестирования свидетельствуют о том, что мутантные формы белков Rpc25 Sch. pombe утрачивают способность замещать гомологичную субъединицу Rpc25 в составе РНК-полимеразы III S. cerevisiae (рис. 33). Таким образом, аминокислотные остатки Phe-72 и Тгр-201 являются незаменимыми для функции белка Rpc25 Sch. pombe in vivo. Субъединицы Rpcl7 и Rpc25 РНК-полимеразы III делящихся дрожжей могут замещать функцию соответствующего белка почкующихся дрожжей лишь частично, приводя к образованию условных (термочувствительных) мутантов, что имеет большое практическое значение. Недавно французскими коллегами было показано, что при выделении мозаичной РНК-полимеразы III S. cerevisiae из полученного нами штамма YGP25 субъединица Rpc25 Sch. pombe легко диссоциирует от фермента в процессе очистки [155]. В результате удается выделить РНК-полимеразу III, лишенную незаменимой для жизни дрожжевой клетки субъединицы Rpc25. Такой препарат фермента можно использовать для дальнейшего детального исследования функций Rpc25 биохимическими методами. Чтобы определить функционально эквивалентные домены белков RPC25 S. cerevisiae и hRPC25 Н. sapiens, а также районы, отвечающие за видоспецифичность этих белков, мы получили две гибридные конструкции, в одной из которых С-концевая часть (с 131 а.о. по 212 а.о.) субъединицы RPC25 S. cerevisiae была замещена на соответствующую последовательность hRPC25 Н. sapiens (в дальнейшем в тексте эта конструкция обозначается RPC25-hRPC25), вторая конструкция содержала N-концевую часть hRPC25 Н. sapiens (с 1 по 162 а.о.), соединенную с С-концевой частью RPC25 S. cerevisiae (hRPC25-RPC25) (рис. 35). Для получения гибридной конструкции RPC25-hRPC25 3 -концевую часть кДНК hRPC25 Н. sapiens, кодирующую аминокислотные остатки с 131 по 204, амплифицировали с использованием специфических праймеров OGVS394 и ORX222 на матрице pGEN-hRPC25, содержащей кДНК hRPC25. Полученный ПЦР-фрагмент длиной 327 п.о. выделяли из агарозного геля по методу прямой электроэлюции [206], обрабатывали эндонуклеазами рестрикции Ncol и Kpnl и лигировали с плазмидой pGEN-RPC25, содержащей ген RPC25 S. cerevisiae, из которого с помощью рестриктаз Ncol и Kpnl был удален фрагмент, кодирующий 315 п.о. 3 -концевой части кДНК RPC25 S. cerevisiae (сайт расщепления рестриктазы Ncol присутствует в кодирующей части кДНК RPC25 S. cerevisiae) (рис. 35). Для получения гибридного гена hRPC25-RPC25 3 -концевую часть кДНК RPC25 S. cerevisiae, кодирующую аминокислотные остатки с 162 по 350, амплифицировали с использованием праймеров oGVS396 и oRX222. Полученный ПЦР-фрагмент длиной 350 п.о. обрабатывали эндонуклеазами рестрикции Apal и Kpnl, очищали в агарозном геле с помощью метода прямой электроэлюции и лигировали с плазмидой pGEN-hRPC25, из которой с помощью рестриктаз Apal и Крп\ предварительно был удален фрагмент, кодирующий 40 п.о. 3 -концевой части кДНК hRPC25 Н. sapiens (сайт Apal присутствует в структуре кДНК hRPC25) (рис. 35). Полученные конструкции были подтверждены секвенированием с использованием праймеров ORX222 и oRX223. В процессе тестирования полученных гибридных кДНК RPC25-hRPC25 и hRPC25-RPC25 по методу перетасовки плазмид в гаплоидном штамме FYBL3-2b S. cerevisiae с разрушенным геном RPC25 было установлено, что видоспецифичность субъединицы Rpc25, по-видимому, определяется ее N-концевой частью (рис. 36). Отметим, что соответствующий домен субъединицы Rpb7, гомологичной Rpc25, участвует во взаимодействии с кбром РНК-полимеразы II [199]. Сходным образом N-конец субъединицы Rpc25 может определять взаимодействие с кбром РНК-полимеразы III. Однако, поскольку сравнение первичных структур Rpb7 и Rpc25 пока не позволило найти прямого объяснение селективности их взаимодействий с кбром РНК-полимераз II и III, Изучение межвидовой комплементации субъединиц Rpc34, Rpc31 и Rpc53 Sch. pombe При сравнении аминокислотных последовательностей субъединиц Rpc34 из S. cerevisiae, Sch. pombe и Н. sapiens можно обнаружить, что наиболее высокая степень консервативности присуща центральной части обсуждаемых молекул (рис. 37). В целом, Rpc34 Sch. pombe и RPC34 S. cerevisiae содержат 42% идентичных (62% сходных) аминокислотных остатков, сравнение Rpc34 Sch. pombe и hRPC34 Н. sapiens выявляет 30% идентичных (55% сходных) аминокислотных остатков. Клонированная кДНК rpc34 Sch. pombe была исследована на способность заменять in vivo функцию субъединицы Rpc34 S. cerevisiae. Гаплоидный штамм D57-9A S. cerevisiae, несущий нуль-аллель rpc34-A::HIS3, был трансформирован плазмидой pGP-34, содержащей кДНК гена rpc34 Sch. pombe. Полученные трансформанты высевали на минимальную селективную среду с 5-FOA и урацилом и наблюдали за ростом дрожжей в течение 3 суток при 30С. Оказалось, что субъединица Rpc34 Sch. pombe не способна функционировать в составе аппарата транскрипции S. cerevisiae (рис. 38).
Очистка РНК-полимеразы III Sch. pombe и анализ ее субъединичного состава с помощью TOF-MALDI масс-спектрометрии
Анализ ядерной РНК-полимеразы III Sch. pombe на уровне генома был дополнен биохимической характеристикой соответствующего белкового комплекса. Клеточный экстракт Sch. pombe выделяли из штамма yYH3282 [215], в котором специфическая субъединица РНК-полимеразы III Rpc53 содержит полигистидиновую последовательность в своей N-концевой части. Прежде чем приступать к стадиям очистки препарата РНК-полимеразы III, приготовленный клеточный экстракт был проверен на присутствие активных компонентов аппарата транскрипции РНК-полимеразы III. Для этого мы использовали технику специфической (промотор-зависимой) транскрипции in vitro. В качестве матрицы в этом опыте использовали ген 5S РНК Sch. pombe (рис. 41), который клонировали посредством ПЦР на матрице геномной ДНК Sch. pombe со специфическими праймерами OGVS419 и oGVS420. Праймеры были сконструированы на основе имеющихся литературных данных [216] и окаймляли ген 5S РНК с прилегающими к нему 170 п.о. выше точки начала транскрипции и 140 п.о. ниже участка терминации. Полученный фрагмент ДНК длиной 434 п.о. обработали эндонуклеазами рестрикции BamHl и ЕсоШ и клонировали в плазмидном векторе pUC19, расщепленном теми же рестриктазами. белковые полосы вырезали из геля, обрабатывали трипсином и исследовали массспектрометрически на приборе VISION 2000. Полученные значения соотношений масс к заряду анализировали с использованием программы Matrixscience, которая на основании значений M/Mz позволяет идентифицировать белок в имеющихся базах данных. При этом в процессе компьютерного поиска вводились ограничения по виду организма и массе белка. Компьютерный анализ показал, что выбранные для исследования белковые полосы соответствуют субъединицам Rpcl и Rpc34 Sch. pombe. Трипсинолиз и масс- спектрометрический анализ белковых полос были выполнены Р.Х. Зиганшиным (группа масс-спектрометрии ИБХ РАН). Активность очищенного препарата РНК-полимеразы III Sch. pombe была проверена in vitro в опыте по промотор-независимой транскрипции (рис. 44). Ядерные РНК-полимеразы I-III не способны инициировать синтез РНК без набора соответствующих транскрипционных факторов. Однако эту проблему можно обойти, используя в качестве матрицы дуплекс ДНК с 3 -выступающим одноцепочечным участком [219]. Наличие выступающего 3 -конца в составе молекулы ДНК позволяет РНК-полимеразе начать транскрипцию за несколько нуклеотидов перед дуплексом без участия факторов инициации. В этом опыте мы использовали матрицу, сконструированную из олигонуклеотидов oGVS421 и OGVS422, соответствующих началу гена тРНКЙ Sch. pombe (номер депонирования AL034564). Олигонуклеотид oGVS422 комплементарен OGVS421 за исключением 12-звенного 3 -конца poly(C) (рис. 44). При отжиге эквимолярного количества этих олигонуклеотидов была получена матрица с выступающим одноцепочечным 3 -концевым участком (рис. 44). Неспецифическую транскрипцию проводили по методике [220] с небольшими модификациями.
Поскольку на полученной матрице РНК-полимераза начинает синтез РНК не с фиксированного места, а с нескольких позиций до начала дуплекса ДНК, в итоге получается набор фрагментов РНК, отличающихся по 5 -концу (рис. 44). Нуклеотидная последовательность выбранной нами матрицы (начало гена тРНК Sch. pombe) позволяет вести реакцию транскрипции в отсутствие СТР (дорожка 3 на рис. 44) до нуклеотида в положении +9 (нумерация дана от начала дуплекса ДНК). Это дает возможность избежать гегерогенности РНК-продуктов по 3 -концу и тем самым облегчает интерпретацию полученных результатов. В качестве внутреннего контроля работы транскрипционной системы использовался препарат РНК-полимеразы Е. coli (USB) (дорожка 4 на рис. 44). Из рис. 44 по расположению мажорных полос видно, что РНК-полимераза III Sch. pombe предпочтительно инициирует синтез РНК за 3-4 нуклеотида до начала дуплекса ДНК (дорожка 3) в отличие от РНК-полимеразы Е. coli (дорожка 4), для которой разброс точек инициации больше. Использовали хлорид натрия, хлорид магния, хлорид калия, хлорид цинка, ацетат натрия, сульфат аммония, гидроксид натрия, нитрат серебра, тиосульфат натрия, карбонат натрия, метол, сульфит натрия, гидрохинон, бромид калия, гипосульфит натрия, метабисульфит натрия, соляную кислоту, уксусную кислоту, борную кислоту, этанол, изопропанол, бутанол, изоамиловый спирт, фенол, хлороформ, диметилдихлорсилан, формалин, глюкозу, сахарозу, глицерин, EDTA, бромфеноловый синий, вазелиновое масло, ампициллин отечественного производства марки "о.с.ч.". Использовали мочевину, SDS, хлорид кальция, TEMED, ДНК сельди (Serva, Германия); акриламид, N,N -метилен-бисакриламид, трис(гидроксиметил)аминометан, протеазные ингибиторы PMSF, апротинин, химостатин, леупептин, пепстатин A (Roche, Германия); ингибитор РНКаз RNasin (Promega, США); агар, дрожжевой экстракт, бакто-пептон, бакто-триптон, дрожжевой источник азота без аминокислот YNB-AA, гидролизат казеина (Difco, США); HEPES (Pierce, США); имидазол (Merck, Германия); PEG-6000, PEG-4000 (Ferak, Германия); агарозу (BRL, США); DTT, персульфат аммония, сорбит, ацетат лития, аминокислоты, 5-FOA, урацил, гемисульфат аденина (Sigma, США); фосфоцеллюлозу Р11, а-метакрилоксипропилтриметоксилан (Bind-Silane) (LKB, Швеция); Ni-NTA-агарозу (QIAGEN, Германия); бромистый этидий (Calbiochem, США); [у-32Р]АТР, [а-32Р]АТР, [cc-32P]dATP (ИБХ РАН); dNTPs, маркеры молекулярной массы GeneRuler 100 DNA Ladder Plus и lkb DNA Ladder (Fermentas, Литва), pBR322/M?/ I (NEB, США) и See Blue (Novex, США). Использовали эндонуклеазы рестрикции ВатШ, ЕсоШ, Smal, HindlU, Kpnl, Sacl, EcoKV, Nhel, Pstl, Sail, Apal, Ncdl, Ndel, Pvul, Xhol, Xbal Sphl; CIP, ДНК-полимеразу I E. coli (фрагмент Кленова), ДНК-лигазу и полинуклеотидкиназу фага Т4, буферы для эндонуклеаз рестрикции, сывороточный альбумин (Fermentas, Литва; New England Biolabs, США; СибЭнзим, Новосибирск); набор для секвенирования «Т7 Sequencing Kit» (Pharmacia LKB, Швеция); термостабильную ДНК-полимеразу из Thermus aquations (ИБХ РАН); РНКазу A (Sigma-Aldrich, США); лизоцим (Реахим, СССР). Использовали нитроцеллюлозные фильтры с диаметром пор 0.45 мкм (Schleicher & Schuell, Германия); Ватман ЗММ (Whatman, Великобритания); фильтры Star для стерилизации растворов с диаметром пор 0.45 и 0.22 мкм, пробирки с фильтрами SpinX (для очистки и стерилизации малых объемов буферов и растворов) (Costar, Нидерланды); рентгеновскую пленку RETINA (ХВМ, Германия); рентгеновскую пленку Kodak Biomax HR (Kodak, США), усиливающие экраны ЭУ-ВЗА (СССР), стеклянные шарики 100 mesh (BDH, Великобритания).
