Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Этиология и клинико-эпидемиологическая характеристика PC 10
1.1.1. Клинические признаки PC 10
1.1.2. Эпидемиология PC 10
1.1.3. Этиология PC И
1.2. Стратегии анализа генетической предрасположенности 12
1.3. Полный геномный поиск 15
1.4. Подход "ген-кандидат" 18
1.4.1. Принципы выбора "генов-кандидатов" при исследованиях PC и некоторые результаты этих исследований для отдельных генов 18
1.4.2. Ассоциации PC с несколькими полиморфными участками генома 26
1.4.3. Ассоциации полиморфных участков генома с клиническими вариантами PC 28
1.5. Сравнение результатов полного геномного поиска и подхода "ген-кандидат" и оценка перспектив исследования генетической предрасположенности к PC. 32
1.6. Обоснование выбора генов-кандидатов для PC 34
2. Материалы и методы 38
2.1. Использованные реактивы 3 8
2.2. Объект исследования 38
2.3. Организация данных 39
2.4. Выделение геномной ДНК из периферической крови 41
2.5. Геномное типирование 41
2.5.1. Геномное типирование полиморфного участка в гене CCR5 41
2.5.2. Геномное типирование полиморфного участка в положении +49 первого экзона гена CTLA4 41
2.5.3. Геномное типирование полиморфных участков в гене TGFPL 42
2.5.4. Геномное типирование других полиморфных участков 45
2.6. Статистический анализ 46
3. Результаты и обсуждение 49
3.1. Анализ полиморфизма CCRJA32 49
3.2. Анализ полиморфизма полиморфизма CTLA 4 +49 51
3.3. Анализ полиморфизма гена TGFfil 54
3.4. Поиск ассоциаций PC с сочетанием аллелей полиморфных участков с применением "стандартных" подходов на основе точного критерия Фишера 61
3.5. Поиск ассоциаций клинических вариантов PC с аллелями полиморфных участков с применением "стандартных" подходов
на основе точного критерия Фишера 64
3.6. Анализ базы данных с применением алгоритма APSampler 65
Заключение 70
Выводы 71
Список литературы
- Клинические признаки PC
- Полный геномный поиск
- Выделение геномной ДНК из периферической крови
- Анализ полиморфизма полиморфизма CTLA 4
Введение к работе
Рассеянный склероз (PC) представляет собой тяжелое воспалительное заболевание ЦНС, приводящее к инвалидизации довольно молодых людей в трудоспособном возрасте. Поражая преимущественно молодых работоспособных людей, PC представляет собой серьезную медицинскую и социальную проблему. Он является заболеванием со средним уровнем распространенности (до 200 человек на 100000 населения [115]). В России частота PC составляет от 30 до 70 человек на 100000 населения, что соответствует среднему и высокому (выше 50) риску PC [5]. PC характеризуется множеством клинических форм и проявлений [162]. Этиология PC до настоящего времени является неизвестной, но показано, что PC является типичным комплексным заболеванием, в развитие которого большой вклад вносит наследственная предрасположенность с неменделевским полигенным типом наследования, на основе которой действуют остальные факторы риска [51; 200]. Несмотря на многочисленные усилия исследователей, вопрос о факторах генетической предрасположенности к PC далек от своего разрешения. Одной из основных причин этого может являться клиническая и возможная генетическая гетерогенность. Другой причиной, затрудняющей получение однозначных выводов, является, судя по всему, отсутствие для PC главного(ых) гена(ов). Кроме того, исследование вклада в заболевание нескольких генов наталкивается на проблему необходимости большого количества статистических расчетов и недостаточной мощности существующего в настоящий момент в мире математического аппарата для таких расчетов.
Для идентификации генов, определяющих предрасположенность к PC, в настоящее время используют две основные стратегии: выяснение роли того или иного гена-кандидата, выбранного исходя из возможной роли его белкового продукта в этиологии и патогенезе заболевания, и полный геномный скрининг с использованием панели анонимных генетических маркеров, равномерно распределенных по геному, для
идентификации областей хромосом, вовлеченных в развитие заболевания. В целом, подход "ген-кандидат" в данный момент представляется более перспективным и более успешным, чем полный геномный поиск, и в настоящей работе тоже применяется этот подход.
Целью настоящей работы является проведение комплексного анализа вклада полиморфных участков генов иммунного ответа и их сочетаний в формирование генетической предрасположенности к PC и/или вариантам его клинического течения у русских. Исходя из сложившихся представлений о полигенной природе PC, было принято решение разработать математический алгоритм, позволяющий провести компьютерный анализ сочетаннои встречаемости аллелей и генотипов различных генов в группах больных PC и здоровых.
Для достижения поставленной цели были поставлены следующие конкретные задачи:
- Создать способ организации, пополнения, представления и хранения данных,
позволяющий эффективно анализировать вклад аллельных вариантов генов в развитие и
особенности течения полигенных заболеваний.
- Провести геномное типирование функционально значимых полиморфных
участков генов CCR5, CTLA4 и TGF01 для неродственных больных PC русской
этнической принадлежности и соответствующей контрольной группы.
С помощью полученной базы данных повести анализ ассоциации аллелей и генотипов исследованных генов с развитием и вариантами клинического течения PC методом "случай-контроль" с использованием "стандартного" статистического анализа на основе точного критерия Фишера.
На материале полученной базы данных доказать эффективность разработанного при нашем участии биоинформатического алгоритма APSampler по его способности выявлять уже найденные ранее ассоциации аллелей с PC у русских.
- С помощью полученной базы данных и алгоритма APSampler провести комплексный анализ ассоциации PC с сочетаниями аллелей/генотипов всех генотипированных полиморфных участков генов иммунного ответа.
Научная новизна. В настоящем исследовании впервые проводится исследование полиморфизма гена TGFB1 для PC у русских. Кроме того, в настоящем исследовании впервые проводится комплексный анализ совместного вклада в развитие PC полиморфных участков в генах CCR5, CTLA4 и TGFfil с применением как "стандартных" статистических методов, так и вновь разработанного биоинформатического алгоритма APSampler. Настоящая работа представляет собой целостное систематическое исследование вклада 15 функционально значимых полиморфных участков в 6 генах иммунного ответа или рядом с ними в развитие PC у русских.
В настоящей работе впервые выявлена ассоциация с PC сочетанного носительства аллелей CCR5А32 и DRB1*04. Впервые показана негативная ассоциация совместного носительства аллелей CCR5A32 и DRB1*04 с ранним дебютом заболевания (<18 лет). Впервые применен новый статистический алгоритм APSampler и с его помощью выявлены ранее не обнаруженные ассоциации PC с совместным носительством двух триаллельных сочетаний (>ЛЯ7*18(3), -509TGFB1*C и CTLA4*G) и (-2387WF*B1, -30877VF*A2 и CTLA4*G). До настоящей работы ни в одной этнической группе не было описано ассоциации PC с каким-либо триаллельным сочетанием. Важно отметить, что группы носителей этих сочетаний среди больных PC являлись непересекающимися, что впервые наглядно свидетельствует о генетической гетерогенности PC как полигенного заболевания.
Практическая значимость работы. Изучение PC на молекулярно-генетическом уровне может в будущем позволить индивидуально оценивать степень риска его развития у индивидов, разработать эффективные основы профилактики с учетом генетической конституции и особенностей образа жизни отдельного индивида. Кроме того,
практическое применение алгоритма APSampler показало его ценность для анализа ассоциации заболеваний с сочетаниями аллелей нескольких полиморфных участков.
Клинические признаки PC
Рассеянный склероз - хронический, как правило, волнообразный воспалительный патологический процесс в ЦНС, характеризующийся наличием симптомов, характерных для поражения проводниковых систем в ЦНС; наличием очагов демиелинизации (бляшек) в различных отделах ЦНС, которые могут возникать у одного и того же больного в различное время; накоплением симптомов поражения в течение времени. Для заболевания характерно множество клинических форм и вариантов течения (клинический полиморфизм) [162], основанных на различных частоте приступов заболевания, длительности приступов, количестве, размере и расположении очагов поражения, степени восстановления после приступа и т.п. [3; 6; 10]. Заболевание, как правило, поражает людей в возрасте 10-60 лет [156], со средним возрастом начала заболевания 31 год [141], женщин примерно в 2 раза чаще, чем мужчин [176].
Распространенность PC (количество случаев на 100000 населения) варьирует в зависимости от региона, этнического состава группы, процентного соотношения мужчин и женщин или от сочетания этих факторов и составляет до 200 человек на 100000 населения, причем его частота больше в странах с высоким уровнем развития экономики [115]. Кроме того, при сравнении показателей распространенности PC в разных странах необходимо учитывать своеобразие принятых там систем здравоохранения, что влияет на степень выявления случаев PC, сроки постановки диагноза, доступность информации о больных, получающих лечение частным образом. Могут иметь значение также различия в уровнях рождаемости и смертности, средней продолжительности жизни в разных странах.
В России частота PC составляет от 30 до 70 человек на 100000 населения, что соответствует среднему (от 10 до 50 случаев на 100000 населения) и высокому (выше 50) риску PC. Однако есть в России и регионы-исключения: например, Воронежская область (107,6 случаев на 100000 населения) и Чукотский автономный округ (3,6 случаев на 100000 населения) [5].
Зависимость частоты PC от этнического состава популяции отмечали еще на самых ранних этапах эпидемиологических исследований PC. Проведенные в США в 1922 году исследования выявили увеличение частоты PC в местах проживания выходцев из Скандинавских стран [7]. Зависимость частоты PC от этнического состава популяции подтвердилась в большом количестве более поздних исследований, например, наблюдали большую частоту PC у европеоидов по сравнению с негроидами в ЮАР [46] и в других работах.
Эпидемиологические исследования, выявившие различную частоту PC в разных популяциях, а также случаи семейного PC, естественным образом привели к исследованию генетической предрасположенности к PC, и в настоящее время она рассматривается как основной фактор риска PC. Действительно, проводившиеся популяционные исследования четко указывают на роль наследственных факторов в развитии PC. Семейные исследования показали, что уровень конкордантности у монозиготных близнецов составляет только около 35%, что может свидетельствовать о влиянии на развитие PC внешней среды. Однако наблюдения распространенности PC среди близнецов, сестер и братьев (сибсов), сестер и братьев по одному из родителей (полусибсов) и приемных детей, показывают преимущественную роль генетических факторов как факторов риска PC [55; 168; 169]. Величина относительного риска (ОР) заболевания, т.е. преобладание вероятности заболеть над вероятностью остаться здоровым, в 20 - 50 раз выше для родственников больных PC, чем в популяции в среднем[62]
В двух представительных семейных исследованиях, проведенных в Канаде и Великобритании, показано систематическое уменьшение ОР в зависимости от генетической дистанции по отношению к больному; при этом не наблюдалось разницы для родственников по материнской и отцовской линии [166; 169]. Исследования семейных случаев PC показали, что тип наследования при PC соответствует полигенному, а не доминантному или рецессивному [2]. Кроме того, для этого заболевания не удалось выявить главный ген [42; 51].
Таким образом, в настоящее время PC считают мультифакториальным (комплексным) заболеванием с большим клиническим разнообразием форм, в развитие которого большой вклад вносит наследственная предрасположенность с полигенным типом наследования, на основе которой действуют остальные факторы риска [51]. К последним относятся, например, возбудители инфекций, ультрафиолетовое излучение, диета, экологические факторы, ионы металлов, травмы головы и т.д. [4; 7; 176].
Поиск генов, вовлеченных в развитие полигенных заболеваний, в настоящее время проводят при помощи двух основных стратегий (рис. 1): полного геномного поиска (позиционное картирование, сканирование) [25] и подхода "ген-кандидат" (функциональное картирование) [116; 164], с применением сложных статистических расчетов; в обоих случаях применяют как семейный, так и популяционный анализ (см. далее).
Полный геномный поиск
Полный геномный поиск при PC с применением анализа сцепления проводили для различных этнических групп в разных странах, например, в США [89; 90], Канаде [53], Великобритании [175], Финляндии [114], во всей Скандинавии [17], Италии [31], отдельно в Сардинии [44], Австралии [24] и Турции [61] и других странах [15]. Кроме того, по известным из этих публикаций данным также проводили мета-анализ [76; 197], объединяющие результаты сначала первых четырех [197], а потом вообще всех приведенных выше исследований [76] и обобщающие их. В общей сложности было проанализировано 719 и 3599 микросателлитных маркеров, включая более 2616 индивидов (1524 больных) [76] Проводили и другие исследования основанные на мета-анализе [16].
Области положительного сцепления, характеризующиеся максимальным лод-баллом более 2 или NPL более 2,1 (что соответствует шансам в пользу сцепления 100:1), которые были выявлены при всех названных выше исследованиях, приведены в таблице 1 (по [51] с модификациями). Видно, что области сцепления обнаружены на большинстве хромосом, что демонстрирует полигенную природу PC. Следует отметить, что значения лод-балла и NPL в большинстве из включенных в таблицу случаев не превышали 3.0, что свидетельствует о небольшом вкладе каждой отдельной области в развитие PC. Таким образом, эти исследования не показали присутствия главной области, сцепленной с заболеванием, ни на одной из хромосом. Из данных таблицы видно также, что в большинстве случаев полный геномный поиск в различных этнических группах не дал совпадающих результатов, что может свидетельствовать о генетической гетерогенности PC в разных популяциях. Хотя области положительного сцепления выявлены в разных исследованиях на большинстве хромосом (кроме 21 и Y), только области 3q21-24 и 6р21 совпадали в большинстве работ. Применение мета-анализа [16; 76] подтвердило сцепление с PC области 6р21, но не 3q21-24, и выявило несколько дополнительных областей сцепления.
Хромосома Y Обозначения в верхнем регистре: С - Канада, U - Великобритания, N - Скандинавия, I -Италия, А - Австралия, Am - Америка, F - Финляндия, Т -Турция, S - Сардиния, МА1 - области, обнаруженные при мета-анализе [76], МА2 - области, обнаруженные при мета-анализе [16] При полном геномном поиске проводили также исследования ассоциаций областей ДНК с PC методом "случай-контроль" [15; 117; 135; 159 и ссылки в ней]. Во многих из этих исследований обнаружена связь PC с областью 6р21 и другими областями генома, для которых ранее было показано сцепление с заболеванием, а также выявлены некоторые новые ассоциированные с PC области. Снова, как и при анализе сцепления, результаты, полученные в разных этнических группах, не совпадали, и не удалось выявить главной области, ассоциированной с PC.
В целом можно заключить, что к настоящему времени полный геномный поиск не позволил выявить универсальные области сцепления/ассоциации с PC, однако, довольно убедительно показал полигенную природу заболевания. Показан небольшой вклад каждого из вовлеченных в развитие заболевания генов и зависимость развития PC от этнической принадлежности больных. Кроме того, наличие такого большого количества областей сцепления может свидетельствовать не только о полигенном характере заболевания, но также и о многообразии патологических путей, приводящих к общему симптомокомплексу, характерному для PC, т.е. о генетической гетерогенности заболевания. На основании приведенных данных можно предположить, что группы больных PC состоят из нескольких (зачастую небольших) подгрупп, в которых к патологии приводит свой отдельный и независимый набор генов, т.к. иначе пришлось бы предположить, что для PC необходима одновременная встречаемость генов из всех приведенных локусов у одного больного, что приводит к очень маловероятному событию, даже для такого нечастого заболевания как PC.
Выделение геномной ДНК из периферической крови
Аллели полиморфного участка гена CCR5, возникающего вследствие делении 32 п.н., вьивляли по длине продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для выявления фрагмента длиной 169 п.н. (в случае аллеля wt) или фрагмента длиной 137 п.н. (в случае аллеля А32) ДНК амплифицировали в с использованием праймеров: CCR5A (5 -AGGTCTTCATTACACCTGCAGC-3 ) и CCR5B (S -CTTCTCATTTCGACACCGAAGC ) [173]. Амплификацию проводили в 10 мкл амплификационной смеси, содержащей 70 мМ TrisHCl (рН 9,0); 20 мМ (NH4)2S04; 0,025% Тритон-ХЮО; dNTP с концентрацией 0,2 мМ каждого; 1,5 мМ MgCh; по 10 пмоль каждого праймера, 0,5 е.а. ДНК-полимеразы Taq и 100 нг геномной ДНК, на протяжении 35 циклов (45 сек. - 92С; 1 мин - 59С; 1 мин 15 сек - 72С) в амплификаторе МС16 (АО "ДНК-технология"). В каждый эксперимент включали отрицательный контроль, где ДНК-матрицу для ПЦР заменяли НгО. Результаты амплификации анализировали в 3% агарозном геле в присутствии бромистого этидия. В качестве маркера молекулярной массы использовали плазмиду pUC19, обработанную рестрикционной эндонуклеазой Mspl.
Геномное типирование проводили методом анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов продуктов полимеразной цепной реакции (ГЩР-ПДРФ). Для ПЦР использовали пару праймеров 5 -AAGGCTCAGCTGAACCTGGT и 5 -CTGCTGAAACAAATGAAACCC [130]. Амплификационная смесь в объеме 20 мкл содержала 0,05 М КС1, 0,01 М TrisHCl (рН 9,0), 5% формамида, 1,5 мМ MgCl2, по 0,2 мМ каждого dNTP, по 10 пкмоль каждого праймера, 1 е.а. ДНК-полимеразы Taq и 100-200 нг ДНК. Амплификацию проводили в амплификаторе Genius ("Techne") в следующих условиях: 1) предварительная инкубация в течение 5 мин при 94С; 2) 30 циклов (94С, 58С и 72С, по 1 мин); 3) инкубация при 72С в течение 7 мин. В каждый эксперимент включали отрицательный контроль, где ДНК-матрицу для ПЦР заменяли НгО. Продукты амплификации объемом 5 мкл инкубировали с 5 е.а. рестрикционной эндонуклеазы BstEll в реакционном буфере, поставляемом производителем фермента при 37С в течение 5 час. Продукты рестрикции разделяли методом электрофореза в 3%-ном агарозном геле, содержащем бромид этидия, и визуализировали в проходящем УФ-излучении. Наличие рестрицированного фрагмента длиной 130 п.н. свидетельствовало о присутствии аллеля А, наличие интактного фрагмента длиной 152 п.н. - аллеля G. В качестве маркера молекулярной массы использовали плазмиду pUC19, обработанную рестрикционной эндонуклеазой Mspl.
В гене TGFfll проводили генотипирование пяти участков SNP, приведенных выше (см. таблицу 1). Анализ проводили методом гибридизации иммобилизованных продуктов ПЦР с аллелеспецифическими зондами с использованием праймеров и зондов, приведенных в таблице (таблица 7 [35]).
Амплификацию проводили в 20 мкл амплификационной смеси, содержащей ЮмМ TrisHCl (рН 9,0); 50мМ КС1; 0,1% Тритона X; dNTP с концентрацией 0,2 мМ каждый; 2,5 мМ MgCh; по 5 пмоль каждого праймера, 1 е.а. ДНК-полимеразы Taq и 40 нг геномной ДНК в амплификаторе Genius ("Techne") или MCI6 (АО "ДНК-технология") (только для полиморфизма +1632). Параметры ПЦР составляли: для полиморфизма -509: 94С - 5 мин, (94С, 57С, 72С по 1 мин) х 30 циклов, 72С - 7 мин; для полиморфизма +72: (94С, 68С по 1,5 мин) х 35 циклов, 72С - 5 мин.; для полиморфизмов +869 и +915: 94С - 5 мин., (94С, 60С, 72С по 1 мин) х 30 циклов, 72С - 7 мин; для полиморфизма +1632: (92С; 62С; 72С по 1,5 мин) х 35 циклов, 72С - 5 мин. В каждый эксперимент включали отрицательный контроль, где ДНК-матрицу для ПЦР заменяли НгО. Качество амплификации проверяли с помощью гель-электрофореза в 2%-ном агарозном геле в присутствии бромистого этидия. В качестве маркера молекулярной массы использовали плазмиду pUC19, обработанную рестрикционной эндонуклеазой Mspl. Гель фотографировали в проходящем УФ-излучении.
Продукты амплификации подвергали щелочной денатурации в 0,4 М NaOH и 0,025М ЭДТА в течение 2 часов, а затем переносили на нейлоновую мембрану Hybond-N с помощью устройства для слот-блотинга Bio-DotRSF (BioRad). Фиксацию проб ДНК на мембране проводили с помощью УФ-излучения (254 нм) в течение 1 часа.
Гибридизацию полученных фильтров с аллелеспецифическими зондами проводили в присутствии хлорида тетраметиламмония, что позволяло проводить отмывку зондов одной длины при одинаковой температуре, независимо от их нуклеотидного состава [198]. Предгибридизацию проводили при 52С в течение 2 часов в смеси, содержащей 50 мМ TrisHCl рН 9,0; 2мМ ЭДТА, пятикратный раствор Денхардта (5% фиколл, 5% поливинилпирролидон, 5% бычий сывороточный альбумин), 0,1% SDS, 100 мг/мл денатурированной ДНК спермы лосося, в присутствии немеченных олигонуклеотидных зондов, специфичных для другого аллеля. Аллелеспецифические зонды подвергали мечению путем кинирования с помощью полинуклеотидкиназы фага Т4 (ПНК). Смесь для кинирования в объеме 20 мкл содержала 20 пкмоль олигонуклеотидного зонда, 70 мМ TrisHCl (рН 7,6); 10 мМ MgCl2; 5 мМ дитиотреитол, 10 е.а. ПНК, 15 мкКи [у-32Р]АТР. Кинирование проводили в течение 30 мин при 37С с последующей остановкой реакции путём добавления равного объема 0,5 М ЭДТА. Гибридизацию с 32Р-меченными аллелеспецифичными зондами проводили не менее 4 часов при 52С. Для удаления несвязавшейся метки фильтры отмывали в 2х SSC, в течение 30 мин при комнатной температуре, затем два раза по 15 мин в 2х SSC; 0,1% SDS при комнатной температуре. Отмывку неспецифически связавшихся зондов проводили 2 раза по 15 мин при 58С в растворе, содержащем 3,0 М ТМАС; 50 мМ TrisHCl (рН 8,0); 2 мМ ЭДТА; 0,1% SDS. Анализ результатов гибридизации проводили методом радиоавтографии. 2.5.4. Геномное типирование других полиморфных участков Типирование аллелей гена DRB1 и микросателлитных повторов TNFa и TNFb проводилось М.А. Судомойной, как описано в [11; 13], а полиморфных участков в генах TNF и LTa - А.Д. Алексеенковым, как описано в [1; 75; 94; 167], за исключением полиморфного участка SNP -376А — G, типирование которого проводилось, как описано ниже.
Анализ полиморфизма полиморфизма CTLA 4
Также с помощью собранной базы данных и "стандартных" подходов на основе точного критерия Фишера анализировали ассоциацию клинических вариантов PC с носительством аллелей анализируемых полиморфных участков, а также аллелей полиморфных участков в группах носителей аллелей гена DRB1. Этот анализ позволил выявить отрицательную ассоциацию совместного носительства сочетания CCR5A32,DRB1 04 с ранним дебютом заболевания (таблица 13). Подобная ассоциация для PC выявлена впервые.
Таблица 13. Количество (%) носителей сочетания CCR5A32,DRB1 04 в сравнении с неносителями этого сочетания у 213 больных PC в подргуппах, сформированных по признаку течения заболевания, пола и возраста начала заболевания.
Признак начала заболевания (CCR5A32,DRB1 04)-негативные, п=18 (CCR5A32,DRB1 04)-позитивные, п=195 ОР (95% ИД)
Выявленная ассоциация PC с совместным носительством DRB1 04 и CCR5А32, а также более поздний дебют заболевания у носителей этих аллелей, вероятно, можно объяснить тем, что экспрессия молекул HLA-DR4, которые формируют низкоаффинные комплексы с некоторыми аутоантигенными пептидами [194], в сочетании с неактивным рецептором CCR5 может ослаблять развитие воспаления и, как результат, откладывать время клинического проявления PC, в то же время способствуя более обширному протеканию нейродегенеративных процессов.
Мы провели аналогичный анализ для всех исследуемых в работе полиморфных участков. Ни в одном случае, кроме вышеописанного, достоверных различий при сравнении частот встречаемости аллелей рассматриваемых полиморфных участков в подгруппах больных PC и здоровых индивидов, сформированных по признаку течения заболевания, пола и возраста начала заболевания выявлено не было.
Анализ базы данных с применением алгоритма APSampIer Дальнейший поиск сочетанных ассоциаций с применением "стандартных" способов осложнился количеством необходимых расчетов. Количество вычислений при увеличении числа рассматриваемых полиморфных участков росло не менее чем экспоненциально. Кроме того, трудности возникли при написании алгоритмов и представлении данных. Для решения этой проблемы А. В. Фаворовым (ГосНИГенетика), G. Parmigiani (Johns Hopkins University, USA) и M. F. Ochs (Fox Chase Cancer Center USA) и был создан новый биоинформатический алгоритм APSampIer. Применяемый в основе алгоритма метод МСМС позволяет существенно упростить алгоритм поиска и сократить время, необходимое для получения значимых результатов.
Так как алгоритм APSampIer является вновь созданным статистическим алгоритмом на основе случайных событий по методу Монте-Карло, в нашу задачу в первую очередь входило провести такую проверку его способности выявлять уже найденные ассоциации. Собранная в данной работе база данных позволяла провести такую проверку, поскольку мы располагали данными, полученными для этой выборки с применением "стандартных" способов анализа. Во-первых, для нее была показана ассоциация PC с совместным носительством CCR5Д32 и DRB1 04 (см.таблицу 12), а во-вторых, мы подтвердили для этой выборки ассоциацию PC с группой аллелей 15(2) гена DRB1 и аллелем а9 микросателлитного маркера TNF, выявленную в нашей лаборатории ранее на независимых выборках [11; 13] (таблица 14). Применение алгоритма APSampler к собранной базе данных также позволило выявить все эти ассоциации (таблица 14), что свидетельствует о его пригодности для поставленной задачи. Применительно к связи PC с DRB 1 15(2) и TNFa9 у русских полученные результаты представляют собой независимую верификацию (валидацию) сделанных ранее заключений, что является важным условием признания достоверности установленных ассоциаций.
Выявленные ранее ассоциации аллелей полиморфных участков в исследуемой выборке ассоциации с PC. Аллель Р ОР (95% ИД) Источник DRB 1 15(2) 0,0001 3,1(2,1-4,6) [Н] TNFa9 0,01 7,9(1,8-35,0) [13] CCR5Д32 + DRB 1 04 0,001 4,7(1,8-12,1) данная работа
Кроме реидентификации уже выявленных ассоциаций, применение алгоритма APSampler к собранной базе данных позволило выявить ранее не описанные ассоциации PC с двумя сочетаниями аллелей трех полиморфных участков: (-509TGFB1 C, DRB1 \S(3), CTLA4 G) и (-2387W B1, -30872VF A2, CTLA4 G) (таблица 15). Таблица 15. Достоверность ассоциации PC с сочетаниями трех аллелей -5O9TGF0PC, DRB1 \S(3), CTLA4 G и -238Ш В1, -308Ш А2, CTLA4 G и входящими в их состав парами аллелей
Как видно из этой таблицы, ни одно из входящих в состав триаллельных сочетаний попарное сочетание аллелей и ни один аллель поодиночке не были ассоциированы с заболеванием (р 0,01). Таким образом, выявленные с помощью алгоритма APSampler триаллельные сочетания являются минимальными наборами, которые обеспечивают более сильную ассоциацию, чем любые из поднаборов. Это же, как было описано выше, справедливо и для биаллельного сочетания (CCR5 А32, DRB1 04).
Полиморфные участки -23877VF и -30877VF, аллели которых -23STNF B\ и -30877VF A2 входят в состав второго триаллельного сочетания, расположены достаточно близко друг от друга в промоторном участке гена, поэтому можно предположить, что эти аллели находятся в жестком сцеплении друг с другом. Однако анализ гашютипов TNF для исследуемых групп не выявил ни одного распространенного гаплотипа, в который бы входили рассматриваемые аллели (рис. 9). Рисунок 9. Частота гаплотипов из рассматриваемых полиморфных участков TNF/LTa у больных PC и в контрольной группе (приведены гаплотипы с частотой не менее 1% у больных или у здоровых)
