Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 9
1. Открытие вируса иммунодефицита человека первого типа 9
2. Строение вириона ВИЧ-1 9
3. Организация генома ВИЧ-1 11
3.1. Структура и функции LTR провирусной ДНК ВИЧ-1 11
3.1.1. Структура и функции иЗ-региона 5'-LTR провирусной ДНК 12
3.1.2. Структура и функции R-региона 5'-LTR провирусной ДНК 15
3.1.3. Структура и функции Ш-региона 5'-LTR провирусной ДНК 17
3.2. Структура области вирусной РНК, предшествующей gag-стартовому кодону 17
3.2.1. Вторичная структура и функции шпильки DIS (SL1) РНК ВИЧ-1 20
3.2.2. Вторичная структура и функции шпильки SD (SL2) РНК ВИЧ-1 22
3.2.3. Вторичная структура и функции шпильки у (SL3) РНК ВИЧ-1 24
3.2.4. Шпилька SL4 25
3.2.5. Ш-АШ-дуплекс 25
3.2.6. Структура областей между шпильками 26
3.2.7. Пространственная структура и упаковка геномной РНК ВИЧ-1 26
3.3. Структурные гены ВИЧ-1 29
3.3.1. Ген gag 29
3.3.2. Ген рої 29
3.3.3. Tenenv ЗО
3.4. Гены и основные функции регуляторных и вспомогательных белков 31
3.4.1. Строение Vpr 34
3.4.2. Положение и синтез Vpr 35
3.4.3. Функции Vpr 36
3.4.3.1. Влияние на точность обратной транскрипции 37
3.4.3.2. Vpr и импорт в ядро преинтеграционного комплекса 38
3.4.3.3. Vpr и клеточный цикл 40
3.4.3.4. Разрушение двунитевой ДНК 41
3.4.3.5. VprnanonT03 42
3.4.3.6. Роль Vpr в усилении LTR-направленной транскрипции 44
4. Этапы ВИЧ-инфекции 45
4.1. Ранняя и текущая инфекция 46
4.1. Дифференциальная диагностика ранней и текущей инфекции 46
5. Анализ полиморфизма ВИЧ-1 как инструмент эпидемиологического мониторинга 47
5.1. Деление вируса на подтипы 47
5.3. Природа изменчивости ВИЧ-1 48
5.2. Полиморфизм вируса 49
6. Молекулярный мониторинг ВИЧ-инфекции в России 49
6.1. Эпидемия ВИЧ-инфекции в России 49
6.2. Подтипы ВИЧ-1, обнаруживаемые в России 51
7. Генная терапия ВИЧ-инфекции 51
7.1. Терапии, базирующиеся на применении нуклеиновых кислот 52
7.2. Терапия, базирующаяся на белках 54
Экспериментальная часть 57
1. Материалы и методы 57
1.1. Объект исследования 57
1.2. Сбор эпидемиологических данных 58
1.3. Методы дифференциального анализа ранней и текущей инфекции 58
1.3.1. Чувствительный/низкочувствительный иммуноферментный анализ (S/LS ELISA) 58
1.3.2. Иммуноферментный анализ с использованием хаотропного агента 58
1.3.3. ИФА с использованием иммунодоминантного эпитопа gp41 (ИДЭ-р41) 59
1.3.4. Изотип-специфический Western blot 59
1.4. Метод получения «грубых» лизатов мононуклеарных клеток периферической крови 60
1.5. Анализ электрофоретической подвижности молекул в агарозном геле 60
1.6. Применение метода гнездовой ПЦР для получения 61
ампликонов исследуемых областей ДНК 61
1.6.1. Амплификация нуклеотидных последовательностей области 5'-LTR 61
1.6.2. Амплификация нуклеотидных последовательностей области, 62
предшествующей gag - стартовому кодону 62
1.6.3. Амплификация области гена vpr 62
1.7. Метод очистки ДНК из геля методом Jetquick 62
1.8. Секвенирование и анализ нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК 62
2. Результаты 63
2.1. Сравнительный анализ лабораторных методов дифференциальной диагностики ранней ВИЧ-инфекции 63
2.1.1. Чувствительный/низкочувствительный ИФА 63
2.1.2. ИФА с использованием 8М мочевины 63
2.1.3. ИФА с использованием иммунодоминантного эпитопа gp41 65
2.1.4. Изотип-специфический Western blot 65
2.2. Анализ области 5'-LTR провирусной ДНК варианта IDU-A ВИЧ-1, доминирующего на территории России 65
2.2.1. Филогенетический анализ области 5'-LTR 65
2.2.2. Анализ области U3 68
2.2.3. Анализ области R 71
2.2.4. Анализ области U5 74
2.3. Анализ области вирусной РНК, предшествующей garg-стартовому кодону варианта IDU-A ВИЧ-1 75
2.4. Анализ области гена vpr варианта IDU-A ВИЧ-1 77
2.4.1. Филогенетический анализ области гена vpr 77
2.4.2. Анализ мутаций в структуре гена vpr 77
Обсуждение 81
Выводы 93
Список литературы
- Структура и функции иЗ-региона 5'-LTR провирусной ДНК
- Пространственная структура и упаковка геномной РНК ВИЧ-1
- Дифференциальная диагностика ранней и текущей инфекции
- Природа изменчивости ВИЧ-1
Введение к работе
Актуальность проблемы. С момента открытия в 1983 г. вируса иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ-1) он является предметом пристального изучения [Бобков и др., 2003]. В связи с ростом эпидемии ВИЧ-инфекции, в том числе и в России, вопрос о разработке эффективных средств борьбы с заболеванием становится все более острым. Главными препятствиями в этой борьбе служат выраженный токсический эффект существующих препаратов и явление лекарственной устойчивости вируса к ним. Для преодоления этих проблем постоянно проводится поиск новых лекарственных препаратов, воздействующих на различные этапы жизненного цикла вируса. В качестве объектов воздействия будущей антиретровирусной терапии рассматриваются, в частности, регуляторные и вспомогательные белки ВИЧ-1. Другим многообещающим подходом может стать генная терапия ВИЧ-инфекции, непосредственной мишенью которой являются нуклеотидные последовательности генома вируса, и среди них — нетранслируемые области генома, необходимые для осуществления его жизненного цикла.
Для разработки средств воздействия на белки и гены вируса необходимы детальные сведения об их структуре, которая у ВИЧ-1 отличается высокой степенью изменчивости. Анализ структуры генома полиморфных вариантов ВИЧ-1, циркулирующих в разных регионах мира, проводится постоянно, результатом чего стало создание обширных баз данных нуклеотидных последовательностей основных, в первую очередь структурных, генов вируса.
Среди областей генома ВИЧ-1, полиморфизм которых пока изучен недостаточно, можно выделить регион длинных концевых повторов (LTR, long terminal repeat) провируса. Этот регион содержит большое количество сайтов связывания для специализированных клеточных и вирусных факторов транскрипции [Pereira et al, 2000; Van Opijnen et al, 2004] и необходим для инициации вирусной транскрипции, а также вовлечен в процесс обратной транскрипции и интеграции [Ramirez de Arellano et al, 2006], являясь, таким образом, контрольным центром генетической экспрессии ВИЧ-1. Несмотря на высокую консервативность этой области, описано явление полиморфизма LTR среди различных вариантов и подтипов ВИЧ-1 [Estable et al, 1996].
Решающую роль в процессе специфической упаковки геномной РНК в нарождающиеся вирусные частицы играет регион, предшествующий gag-стартовому кодону РНК вируса, в составе которого выделяют три шпилечные структуры - DIS, SD и \j/, играющие важнейшую роль в процессе созревания вирионов и упаковки РНК в геноме вновь формирующихся вирусных частиц. В составе вирусной РНК эти регионы, имеющие
специфическую вторичную структуру, образуют домены, отвечающие за процесс инициации димеризации двух цепей РНК, образования квадруплексов, стабилизирующих димеры, и упаковки генома ВИЧ-1 непосредственно в вирионы. Показано, что полиморфизм этой области может оказывать влияние на скорость репродукции вируса и, в конечном счете, на прогрессию ВИЧ-инфекции.
Значительным влиянием на различные этапы жизненного цикла ВИЧ-1 обладает вспомогательный вирусный белок Vpr (viral protein R) [Le Rouzic et al, 2005]. Этот белок оказывает свое влияние на процессы обратной транскрипции, интеграции провируса, транскрипции вирусных генов, а также на жизненный цикл клетки и процесс апоптоза. В литературе имеется описание некоторых мутаций гена vpr, влияющих на многообразные активности белка Vpr.
Несмотря на существование полиморфизма области 5'-LTR, региона РНК, предшествующего #-стартовому ко дону, и гена vpr ВИЧ-1, данные литературы свидетельствуют о том, что они достаточно консервативны в условиях естественного развития инфекции, а значит, могут быть использованы для создания новых средств антиретровирусной терапии.
Цель и задачи исследования. Определение степени изменчивости региона 5'-LTR, области, предшествующей gag-стартовому кодону, а также гена vpr для варианта IDU-A подтипа А ВИЧ-1, доминирующего в России, и научное обоснование возможности использования этих областей генома в качестве мишеней для молекулярного мониторинга эпидемии ВИЧ-инфекции и для разработки новых методов лечения ВИЧ-инфекции.
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
Проанализировать нуклеотидные последовательности ДНК области 5'-LTR, нетранслируемой области перед gag-стартовым кодоном и области гена vpr в образцах варианта IDU-A подтипа А ВИЧ-1, выделенных в разных регионах России в период с 1996 по 2004 годы.
Провести филогенетический анализ и определить степень генетической изменчивости исследуемых областей варианта IDU-A подтипа А ВИЧ-1 в динамике эпидемии ВИЧ-инфекции в различных регионах России.
Оценить потенциальное влияние выявленных мутаций на эффективность репродукции вируса и прогрессию ВИЧ-инфекции.
Разработать алгоритм дифференциальной диагностики ранней и текущей ВИЧ-инфекции на основе серологических методов.
Провести сравнение исследуемых областей ВИЧ-1 в группах пациентов, находящихся на ранней и последующих стадиях ВИЧ-инфекции.
Научная новизна и практическая значимость работы. Продемонстрирован низкий уровень изменчивости области 5'-LTR, области шпилек DIS, SD и ц/ и гена vpr варианта IDU-A ВИЧ-1, доминирующего на территории России. Анализированные нуклеотидные последовательности ВИЧ-1 депонированы в GenBank под номерами: EU938080-EU938124 для области 5'-LTR (45 образцов), FJ437007 - FJ437028 и FJ503049-FJ503059 - для области шпилек DIS, SD и vj/ (33 образца), FJ490707 - FJ490751 - для гена vpr (45 образцов).
Показано, что в структуре 5'-LTR провирусной ДНК имеются участки, специфические для российского варианта ВИЧ-1 подтипа А. Данные результаты свидетельствуют о том, что область LTR варианта подтипа А ВИЧ-1, доминирующего в России, является характерной для данного подтипа, и анализ этого региона может быть использован для генотипирования наряду с анализом структурных генов gag и env. В частности, показано, что для всех образцов варианта IDU-A ВИЧ-1, выделенных от не употреблявших антиретровирусную терапию людей, характерно наличие вставки в области так называемых «наиболее часто встречающихся длинных полиморфизмов» (MFNLP) в положении -118 внутри региона NF-kB-сайтов LTR, достаточно часто встречающейся среди штаммов ВИЧ-1 подтипов А, С, D, F, Н и J по сравнению с подтипом В [Estable et al, 1996; Ramirez de Arellano et al, 2006]. В большинстве (43 из 45) исследованных образцов вставка размером в 12 нуклеотидов имела дополнительный сайт RBE III, связывающий фактор RBF-2, что потенциально способно оказывать отрицательный эффект на репликацию вируса в клетках [Estable et al, 2007; Ramirez de Arellano et al, 2006].
В составе концевой петли шпильки DIS абсолютного большинства всех российских образцов (91%) обнаружен палиндром AG[GUGCAC]A, характерный для подтипа А ВИЧ-1 [Zarudnaya et al, 2006]. Единичные замены в составе концевой петли, обнаруженные у трех образцов, по всей вероятности, не оказывают значительного влияния на процесс димеризации и упаковки вирусной РНК. Также у двух из 33-х образцов выявлены мутации в 5-м положении шпильки SD, что потенциально может быть связано с ускоренным прогрессированием инфекции [Fang et al, 2001]. Высокий уровень полиморфизма характерен для промежутка между шпильками SD и v|/, однако различия в этой области не способны оказать серьезного влияния на вторичную структуру шпилек.
Низкий уровень изменчивости области гена vpr вариантов ВИЧ-1 IDU-A делает его привлекательной целью для антиретровирусной терапии. В структуре гена vpr изученных образцов не было обнаружено мутаций, связь которых с изменением активностей белка Vpr доказана, при этом были отмечены некоторые характерные для российского варианта
ВИЧ-1 подтипа А особенности, которые могут служить дополнительным инструментом в изучении молекулярной эпидемиологии ВИЧ-инфекции на территории России и потенциально способны влиять на функции белка. Так, обнаружена значительная вариабельность в 89-м аминокислотном положении Vpr. Также была выявлена вариабельность в 73-м и 80-м положении, а в одном образце обнаружена замена 16IV. Мутации в последних трех положениях могут оказывать влияние на проапоптозную активность Vpr, ослабляя ее и тем самым, замедляя патогенез инфекции [Lum et al, 2003; Jian et al, 2003]. Кроме того, в ряде образцов имелись замены в положениях 25 и 63, критических для способности белка проникать в ядро клетки и накапливаться там [Feilzien et al, 1998; Morellet et al, 2003]; в трех образцах обнаружены делеции.
В целом, результаты работы могут служить научным обоснованием для использования областей 5'-LTR, 5'-UTR и гена vpr в качестве мишеней при разработке новых методов лечения ВИЧ-инфекции, включая генную терапию, и новых средств мониторинга ВИЧ-1 с дальнейшим внедрением их в клиническую и эпидемиологическую практику.
Положения, выносимые на защиту.
Анализ нуклеотидных последовательностей региона 5'-LTR, области, предшествующей gag-стартовому кодону, и гена vpr доминирующего в России варианта IDU-A ВИЧ-1 подтверждает его принадлежность к подтипу А вируса.
Строение и количество сайтов связывания NF-kB и Spl, а также структура ТАТАА-бокса в составе 5'-LTR IDU-A являются типичными для всех вариантов подтипа А ВИЧ-1.
Характерной особенностью варианта IDU-A ВИЧ-1 является наличие области MFNLP размером 12 нуклеотидов, содержащей дополнительный сайт связывания для фактора RBF-2, в составе U3 региона LTR.
Вторичная структура участков, наиболее важных для репликации вируса, в составе региона, предшествующего gag-стартовому кодону вирусной РНК, характерна для подтипа А.
Мутации, ассоциированные, по данным литературы, с изменениями активностей белка Vpr, в составе варианта IDU-A ВИЧ-1 отсутствуют.
Разработан иммуноферментный метод дифференциальной диагностики ранней и текущей ВИЧ-инфекции.
Отсутствие ассоциации между сроком инфекции и структурой исследованных областей генома ВИЧ-1 позволяет рекомендовать их для молекулярного мониторинга эпидемии ВИЧ-инфекции.
Структура и функции иЗ-региона 5'-LTR провирусной ДНК
Промоторная область содержит специфический ТАТАА-комплекс и три сайта связывания с фактором Spl. Эти области необходимы для инициации транскрипции. ТАТАА-бокс распознается главным транскрипционным фактором TFIID, который состоит из ТАТАА-связывающего белка (ТВР) и факторов ТВР [Jeeninga et al, 2000].
В составе ТАТАА-бокса были обнаружены подтип-специфические замены. Так, в частности, имеются данные о его преобразовании в нефункционирующую ТАААА-последовательность у изолятов подтипов Е [Ramirez de Arellano et al, 2006; Van Opijnen et al, 2004]. Каких-либо дополнительных замен в структуре LTR, полностью компенсирующих этот дефект, при этом обнаружено не было. В связи с этим ряд исследователей считают, что LTR подтипа Е ВИЧ-1 относится к классу промоторов со слабым влиянием ТАТАА [Jeeninga et al, 2000]. С другой стороны, есть мнение, что на самом деле функциональный ТАТАА-бокс в -28 положении LTR начинается двумя нуклеотидами ранее, в -30 положении, имея вид САТАТАА (или САТАААА для мутантов), и данная мутация находится, таким образом, не в третьем, а в пятом положении сайта, не оказывая значительного влияния на транскрипционную активность [Van Opijnen et al, 2004]. Теми же авторами подтвержден факт увеличения репликативной способности вируса подтипа В, содержащего замену в первом положении САТА-бокса (из САТАТАА в ТАТАТАА).
Три вышестоящих сайта связывания транскрипционного фактора Spl различаются по своей активности. Spl (I)- и (II)- сайты в положении -47 до -67 отвечают за LTR-промоторную активность in vitro, а третий Spl (Ш-)-сайт, локализованный в позиции -69 до -78, оказывает минимальное влияние на процесс вирусной транскрипции. Некоторые неВ-подтипы (А, С, D и G) проявляют высокую вариабельность в трех Spl-сайтах, причем Spl (III) является наиболее вариабельным [Ramirez de Arellano et al, 2006]. Умеренной вариабельностью обладает второй Spl (II) сайт у подтипов A, G и J (табл.2).
Описана корреляция между числом копий связывающих сайтов Spl, взаимодействующих с факторами транскрипции, и усилением функции LTR. Например, удвоение Spl-сайтов связывания у подтипа В увеличивает активность LTR, что приводит к повышению уровня вирусной репликации [Estable et al, 1996]. Более того, обнаружено, что вирусы, выделенные от длительных непрогрессоров (ВИЧ-инфицированных лиц, в течение длительного времени сохраняющих иммунную функцию и низкие уровни вирусной нагрузки), имеют делеции в Spl-сайтах. При обычной скорости прогрессии инфекции подобных мутаций обнаружено не было [Fang et al, 2001].
Имеются данные о связи генетической изменчивости Spl-сайтов и ТАТАА-бокса. Например, варианты ВИЧ-1 с повреждениями Spl способны восстанавливать репликативный потенциал за счет изменения САТАТАА-бокса в ТАТАТАА-бокс, как было описано выше, причем некоторые из них приобретают ту же мутацию, которую обнаруживают в вирусах подтипа Е (ТАААА) [Jeeninga et al, 2004; Ross et al, 1991].
В структуре энхансерной области находятся сайты связывания фактора NF-kB (5 -GGGPuNNPyPyCC-3 [Verhoef et al, 1999] (рис. 1 В), который принимает участие в контроле над множеством клеточных процессов, таких как иммунный ответ, воспалительные реакции, клеточный рост и развитие, апоптоз и др. [Ramirez de Arellano et al, 2006; Krebs et al, 2001]. Сам NF-kB является гетеродимерным белком, состоящим из р50 и RelA (р65) субъединиц, последняя из которых является трансактивационным доменом [Verhoef et al, 1999; Perkins et al, 1997]. Он присутствует в цитоплазме нестимул ированных клеток в виде неактивного комплекса с IkB. Позже происходит диссоциация этого комплекса и миграция его в ядро клетки, где осуществляется функция NF-kB.
Имеются различия между числом NF-kB сайтов среди различных подтипов ВИЧ-1. Так, большинство вирусов подтипа В имеют два сайта связывания, в то время как у вирусов подтипов С, Н и J имеется дополнительный, третий сайт, а у вирусов Е-подтипа — один сайт [Ramirez de Arellano et al, 2006; Jeeninga et al, 2000]. Были проведены исследования, изучающие воздействие, которое оказывает количество сайтов NF-kB на промоторную активность вируса. Анализ LTR штамма подтипа С ВИЧ-1, который имеет три NF-kB сайта, обнаружил повышение активации по сравнению с вирусами, имеющими один или два NF-kB сайта в LTR [Naghavi et al, 1999].
В другом исследовании было показано, что в Т-клетках происходит резкое снижение транскрипционной активности вируса, связанное с делецией двух NF-kB сайтов. Кроме того, в Т-клеточных линиях Jurkat NF-kB сайты способны независимо от Tat ускорять не только инициацию транскрипции, но и элонгацию вновь образовавшихся транскрипционных комплексов [Krebs et al, 2001; Varin et al, 2003].
Область модуляции содержит сайты связывания для множества клеточных факторов, таких как RBF-2, АР-1, TCF-la, NF-AT и др. [Ramirez de Arellano et al, 2006]. (рис. 1 В). Фактор NF-AT, необходимый для транскрипции гена интерлейкина-2 в процессе Т-клеточной активации, положительно влияет на репликацию ВИЧ-1 [Manninen et al, 2001]. С другой стороны, описано явление негативного влияния NF-AT1 (представителя семейства NF-AT) на активность LTR [Barbeau et al, 2001].
Количество АР-1 мотивов (TGACAC[A/-]) левее NF-kB сайтов для разных подтипов ВИЧ-1 различно: один АР-1 сайт был обнаружен у подтипов С, Е и G, два соседних АР-1 сайта - у подтипов А и F и ни одного - у подтипов В и D. В частности, в вирусах подтипа F этот сайт часто дуплицируется, благодаря специфической вставке выше NF-kBII. Отсутствие АР-1 сайта у вируса подтипа В в этой области компенсируется наличием этого сайта ниже (правее) U5 региона в положении +154 [Jeeninga et al, 2000].
RBE Ш-сайт (положение -124 до-131) (ACTGCTGA) служит участком связывания для транскрипционного фактора RBF-2, и, как считается, обладает высокой консервативностью среди всех подтипов ВИЧ-1 [Ramirez de Arellano et al, 2006; Krebs et al, 2001]. Обнаружено, что наличие дополнительного сайта подавляет LTR-направляемую транскрипцию в клетках, экспрессирующих RBF-2 [Ramirez de Arellano et al, 2006]. Более того, было доказано наличие в этом регионе негативного регуляторного элемента (NRE) в положении от -340 до -163, так как делеции внутри этого участка увеличивали скорость транскрипции ВИЧ-1 и вирусной репликации [Ramirez de Arellano et al, 2006]. Ядро NRE (положение -174 до -163), содержащее подтип-специфические последовательности, помимо этого, содержит характерный Е-Вох мотив (CAC[A/G]TG), являющийся мишенью для USF [Ramirez de Arellano et al, 2006; Naghavi et al, 2001]. Однако в исследованиях сайт подобной структуры обнаруживался только в образцах вируса подтипа В [Jeeninga et al, 2000], в то время как для образцов подтипа А наиболее характерна структура CACAGA. In vivo USF подавляет транскрипцию подтипов А, В, С, D, Е и G ВИЧ-1 в эпителиальных клетках, хотя он и активирует транскрипцию в Т-клеточных линиях [Ramirez de Arellano et al, 2006; Naghavi et al, 2001].
Пространственная структура и упаковка геномной РНК ВИЧ-1
Ген gag служит матрицей для образования белка-предшественника р55, транслирующегося с несплайсированной вирусной мРНК. После миристилирования N-концевого участка р55 он становится способным к связыванию с клеточной мембраной [Bryant et al, 1990]. Далее мембрано-ассоциированный р55 привлекает две копии геномной вирусной РНК вместе с другими вирусными и клеточными белками, что заканчивается отпочковыванием вирусной частицы от инфицированной клетки. После почкования, в процессе созревания вирусной частицы, р55 разрезается вирусной протеазой на четыре белка: матриксный белок (МА, р17), капсидный белок (СА, р24), нуклеокапсидный белок (NC, р9) и белок рб [Gottlinger et al, 1989].
Большинство молекул белка МА остаются прикрепленными к внутренней стороне липидной мембраны вириона, однако некоторые молекулы участвуют в формировании преинтеграционного комплекса (РІС), проникающего в ядро после инфекции клетки [Gallay et al, 1995]. Проникновение осуществляется за счет участков белка МА, содержащих сигналы ядерной локализации, которые опознаются клеточной системой ядерного транспорта. Эта особенность позволяет ВИЧ-1 инфицировать недедящиеся клетки, что отличает его от других вирусов семейства [Lewis et al, 1992].
Молекулы белка СА (р24) формируют сердцевину вирусных частиц [Gelderblom, 1991; Poon et al, 1998]. Кроме того, СА в составе белка-предшественника р55 взаимодействует с циклофилином А, обеспечивая его встраивание в вирусную частицу [Franke et al, 1994; Thali et al, 1994]. Нарушение подобного взаимодействия ингибирует вирусную репликацию [Franke et al, 1996].
Участок NC в составе белка-предшественника ответственен за распознавание сигнала упаковки вирусной РНК [Harrison et al, 1992; Poznansky et al, 1991; Helga-Maria et al, 1999; Darlix et al, 1990] и участвует в процессе обратной транскрипции [Lapadatapolsky et al, 1993; Cosa et al, 2004].
Участок рб белка-предшественника осуществляет взаимодействие с вирусным белком Vpr, обуславливая его встраивание в вирусную частицу [Paxton et al, 1993; Kondo et al, 1995]. Также рб содержит домены, необходимые для эффективного высвобождения почкующихся вирионов от инфицированной клетки.
В некоторых случаях вместо полипротеина Gag (р55) образуется предшественник Gag-Pol (р160). Его образование сопряжено со сдвигом рамки считывания в процессе трансляции на дистальном участке гена gag, что приводит к «проскакиванию» терминирующего кодона и образованию слитного белка Gag-Pol [Jacks et al, 1988; Parkin et al, 1992]. Частота подобной ошибки составляет 5%, что соответствует соотношению предшественников Gag и Gag-Pol, равному 20:1. Вирусные белки протеаза (PR), интеграза (IN) и обратная транскриптаза (RT) всегда транслируются с предшественника Gag-Pol.
В процессе созревания вируса протеаза (PR) (в составе полипротеина) вносит разрыв в Gag-Pol предшественник, отделяя белок Pol и, разрезая его далее, выщепляет протеазу (рЮ), обратную транскриптазу (р65) и интегразу (рЗІ). Протеаза ВИЧ-1 относится к семейству аспартановых протеаз и функционирует в форме димера [Ashorn et al, 1990]. Как указывалось выше, она расщепляет предшественник Gag-Pol в процессе созревания вируса.
Обратная транскриптаза (RT) вируса, кодируемая геном рої, является РНК-зависимой ДНК-полимеразой. В процессе обратной транскрипции RT синтезирует двуцепочечную провирусную ДНК, с матрицы геномной вирусной РНК. Обратная транскриптаза ВИЧ-1 функционирует в форме димера, состоящего из собственно RT (р50) и нерасщепленного полипротеина RT-РНКазаН (р65).
Важную роль в процессе обратной транскрипции играет также и сама вирусная РНК за счет шпильки TAR [Weeks et al, 1990]. Как было сказано выше, данная последовательность является высококонсервативной и образует стабильную структуру в виде шпильки, с которой взаимодействует вирусный белок Tat, необходимый для инициации обратной транскрипции [Harrich et al, 1996]. Поскольку у RT отсутствует 3 -экзонуклеазная корректирующая активность, все ошибки полимеразы сохраняются, и каждая новая копия генома содержит в среднем одну новую мутацию [Temin, 1993].
РНКазаН осуществляет функцию деградации цепи РНК после синтеза на ее матрице цепи кДНК.
Вирусная интеграза IN осуществляет встраивание ДНК провируса в геном инфицированной клетки. Это процесс становится возможным благодаря трем активностям фермента [Bushman et al, 1990; Asante-Appiah et al, 1997]. Экзонуклеазная активность необходима для отщепления двух нуклеотидов с обоих 3 -концов линейной двуцепочечной молекулы ДНК. Эндонуклеазная активность позволяет ферменту внести разрыв в хромосому зараженной клетки и, наконец, лигирующая активность создает ковалентные связи между ДНК провируса и ДНК хозяина.
Ген env Белок Env (gpl60) экспрессируется с однократно сплайсированной мРНК. В отличие от других вирусных белков, после синтеза Env на эндоплазматическом ретикулуме он подвергается посттрансляционной модификации в процессе транспорта белка из шероховатого в гладкий эндоплазматический ретикулум и через отделы мембран аппарата Гольджи к плазматической мембране клетки. Эта модификация состоит из гликозилирования, олигомеризации и нарезания gpl60 на gpl20 и gp41. Гликозилирование Env является необходимым условием для формирования инфекционности вируса [Capon et al, 1991]. Далее происходит экспонирование гликопротеина, состоящего из двух нековалентно связанных субъединиц gp41 и gpl20, ассоциированных в три идентичных димера, на клеточной мембране [Lu et al, 1995]. Олигомеры «заякорены» в наружной оболочке с помощью трансмембранного белка gp41. В дальнейшем при инфекции клетки гликопротеины отвечают за связывание вируса с поверхностью клетки и за последующее слияние оболочки вируса с клеточной мембраной. При этом за само связывание с клеточными рецепторами отвечает gpl20, a gp41, подвергаясь конформационным изменениям, подтягивает вирусную частицу к клеточной мембране. В составе gp41 выделяют три основных домена: наружный, взаимодействующий с gpl20, трансмембранный и цитоплазматический, располагающийся непосредственно с внутренней стороны мембраны. Также в состав трансмембранного домена gp41 входит участок, обеспечивающий слияние вирусной и клеточной оболочек [Lu et al, 1999].
Дифференциальная диагностика ранней и текущей инфекции
В настоящий момент среди многообразия вариантов ВИЧ-1 на основании анализа нуклеотидных последовательностей выделяют три филогенетические группы: М (major), О (outliers) и N (non-M/non-O) [Robertson et al (a), 2000; Казеннова и др., 2003]. Изоляты группы М составляют подавляющее большинство известных вариантов ВИЧ-1. Группу М, в свою очередь, подразделяют на подтипы А (А1 и А2), В, С, D, F (F1 и F2), Н, J и К [Gao et al, 2001; Robertson et al. (b), 2000; Triques et al, 2000]. Группа N является самой "молодой" группой, первый ее представитель был выделен в 1998 г. от пациента, жителя Камеруна [Simon et al. 1998]. К группе О принадлежит относительно небольшое количество изолятов, обнаруженных в основном в Западной Африке.
На первых этапах исследования нуклеотидных последовательностей геномов ВИЧ 1 предметом генотипического анализа были гавным образом области гена env, а также, в меньшей степени, gag. Однако крупномасштабное исследование полноразмерных геномов ВИЧ-1 позволило установить, что филогенетические закономерности, наблюдаемые для генов gag и env, характерны и для других генов вируса. В частности, явление полиморфизма присуще области LTR разных подтипов [Estable et al, 1996]. Кроме того, существуют и вирусы с так называемой "мозаичной" структурой генома, образованные в результате рекомбинации; их геномы состоят из участков, принадлежащих к разным, иногда даже не идентифицированным, подтипам.
Основой выделения вирусного подтипа служит генетическая изменчивость, не превышающая в пределах подтипа 15% [Hofinan et al, 1992]. В то же время, значения изменчивости в этой области между разными подтипами колеблются от 25 до 40%.
У ВИЧ-1 отсутствуют специальные механизмы коррекции генетических ошибок, поэтому он, как и другие лентивирусы, имеет выраженную наклонность к мутациям.
Ретровирусы отличаются от всех других форм жизни более высокой частотой генетических изменений в процессе репликации. Частота генетических ошибок при репликации для клеток эукариот и прокариот составляет 10"7 - 10" ошибок/ на геном/ на цикл репликации. У ретровирусов, в том числе у ВИЧ-1, эта частота на 3 или 4 порядка выше. Есть данные о том, что in vivo частота мутирования ВИЧ-1 оценивается в 3,4 нуклеотидные замены на 10 присоединенных нуклеотидов за один цикл репликации [Mansky, 1995]. Так как геном ВИЧ-1 содержит 104 пар нуклеотидов, в каждом геноме при каждой репликации есть хотя бы одна генетическая ошибка, и потомки уже в первом поколении существенно отличаются от родителей.. По этой причине считается, что вирус имеет квазивидовую природу [Wain-Hobson, 1993], то есть вирусная популяция в пределах организма хозяина существует в виде неоднородного «роя» отличающихся друг от друга генетических вариантов. В процессе развития инфекции присходит интенсивная рекомбинация геномов квазивида и селекция под давлением факторов эволюционного отбора того вируса, котрый наиболее продуктивно реплицируется в данном типе клеток. Таким образом, отличия в последовательности нуклеотидов между изолятами составляют в одних случаях 1-2%, в других - 25% [Saag et al, 1988; Хаитов и др., 1992].
В настоящее время достижения молекулярной биологии и генетики позволили накопить обширные базы данных нуклеотидных последовательностей ВИЧ, насчитывающих тысячи последовательностей, выделенных в различных регионах мира [Robertson et al, 2000 (a); Myers, 1994].
Предположительным местом возникновения подтипов ВИЧ-1 является территория Западной и Центральной Африки, а вероятным источником инфекции - шимпанзе подвида Pun troglodytes troglodytes [Казеннова и др., 2003; Beer et al, 2000]. Природным резервуаром ВИЧ-2 являются дымчатые мангобеи [Казеннова и др., 2003; Beer et al, 2000; Chenetal, 1997].
На сегодняшний день принята гипотеза, согласно которой произошло три независимых заноса ВИО от шимпанзе в человеческую популяцию, что привело к появлению групп «М», «N» и «О». В дальнейшем естественная дивергенция вируса приводила к возникновению новых генетических вариантов - подтипов ВИЧ-1. Миграция населения накладывала свой отпечаток на неревномерность распространения подтипов по земному шару. В результате в каждом регионе мира преобладает, как правило, небольшое количество характерных для данного региона вариантов ВИЧ-1. Так, по данным UNAIDS, в США, Канаде, Австралии, Японии наиболее распространен подтип В, также характерный для стран Западной Европы. В странах Латинской Америки подтип В сосуществует с F, С и Е. В Азии большинство ВИЧ-инфицированных поражено вирусами Е- и В-подтипов, в то время как в Таиланде и Восточной Азии распространение получила рекомбинантная форма CRF01_AE [Казеннова и др., 2003]. В странах Центральной Африки обнаружены представители всех подтипов ВИЧ-1, однако доминируют там вирусы подтипов А и С. Этот факт делает вирусы подтипа С самыми многочисленными на земном шаре [Казеннова и др., 2003; Morison, 2001; Rodenburg et al, 2001]. В России с начала эпидемии (1996 год) доминирует вирус подтипа А.
Подтипы ВИЧ-1 изучены не в одинаковой степени. Наиболее изученным сейчас остается подтип В, распространенный в США и Европе и используемый в качестве модельной системы для изучения процессов заражения, течения заболевания и генетической изменчивости вируса, а также в качестве основного ориентира при создании диагностических и лекарственных средств. Объем данных о наиболее широко представленном на территории Российской Федерации подтипе А, касающихся его биологических свойств, особенностей патогенеза и т.д., сравнительно невелик.
В России, как и в Восточной Европе, эпидемия ВИЧ-1 началась позже, чем в других европейских странах, а потому стало возможным изучение ее с первых случаев ВИЧ-инфекции в стране [Покровский и др., 1987; Бобков и др., 2003; Покровский и др., 1996 (а)].
Первый случай инфицирования вариантом ВИЧ-1 подтипа А, приведший к СПИДу, в России был зарегистрирован в 1987 г. у пациента, заразившегося в Танзании в результате гомосексуальных контактов [Покровский и др., 1987; Покровский и др., 1996 (Ь)]. Однако эпидемия в СССР и позднее в России развивалась медленнее, чем во многих других странах мира. По данным Федерального центра по профилактике и борьбе со СПИДом, в 1987 - 1995 гг. в России было зарегистрировано 1072 случая ВИЧ-инфекции, и основным путем передачи был половой, при этом спектр выявляемых подтипов оказывался достаточно широк [Бобков и др., 2000]. Среди описанных в то время случаев имела место также нозокоминальная вспышка инфекции, вызванная ВИЧ-1 подтипа G, в 1989 году на юге России среди 250 человек, заразившихся в результате парентеральных манипуляций с использованием нестерильного инструментария [Покровский и др., 1987; Bobkovetal, 1994].
Проникновение ВИЧ-1 в среду потребителей психоактивных веществ (ПИН) в 1995 году привело к массовому распространению инфекции по территории России [Покровский и др., 2004; Суханова и др., 2004 (Ь)]. В результате на 12 мая 1997 г. в стране насчитывалось 4165 инфицированных, из которых 1242 были наркоманами [Покровский и др., 1997]. К концу 1999 гг. в России число зарегистрированных случаев ВИЧ-инфекции составляло 20500, а к концу 2002 г. - 229049 [Покровский и др., 2004]. По данным молекулярно-эпидемиологического расследования, вирус, распространяемый таким путем, принадлежал к варианту подтипа А, занесенному с территории Украины [Bobkov et al, 1996; Bobkov et al, 1997; Nabatov et al, 2002]. Впоследствии этот вариант был назван IDU-A (от англ. «injecting drug users» - потребители инъекционных наркотиков) [Bobkov et al, 2004; Lukashov et al, 1999].
Природа изменчивости ВИЧ-1
В лабораторном варианте ИФА в качестве антигена для сенсибилизации планшетов (№ 9017, Costar) использовали синтетический пептид - аналог антигена gp41 вируса, соответствующий консенсусной последовательности для всех подтипов ВИЧ-1 (RVLAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAV) [Barin et al, 2005]. Сенсибилизацию пептидом в конечной концентрации мкг/мл проводили в течение 48 час при +4С. Лунки планшетов промывали 1х фосфатно-солевым буфером (PBSw) (0,01 М Na-фосфатный буфер (рН 7,4), 0,05 М NaCl, 0,05% Tween-20 и 20 мкл мертиолята Na). Затем планшеты обрабатывали фосфатно-солевым буфером «для забивки» (PBSw-M-KPC), содержащим 5% сухого молока (Powdered Milk, Epitope inc.) и 10% эмбриональной сыворотки КРС (Sigma). Инкубацию раствора сывороток в буфере «для забивки» в конечной концентрации 1:100 проводили при 37С в течение 1 часа, затем планшеты инкубировали с раствором конъюгата моноклональных иммуноглобулинов мыши к IgG человека с пероксидазой хрена (ООО «Импакт», Россия) в буфере «для забивки» (1:10000). В качестве хромогена использовали 0,2 мг/мл раствор ортофенилендиамина (ОФД) в составе субстратного раствора, содержащего 0,025 М лимонной кислоты, 0,05 М Na2HP04 12H20, и 0,05% Н2О2. После инкубации в темноте в течение 8,5 минут иммуноферментную реакцию останавливали добавлением 100 мкл 1М серной кислоты в каждую лунку. Оптическую плотность (ОП) содержимого лунок измеряли при длине волны 492 nm. Тест был валиден, если ОП крит 0,2, где ОПкрит= (ОПК-)сред 2. Использовали лабораторный вариант иммуноблота, полученный с применением вирусного материала из культуры клеток МТ-4, инфицированной ВИЧ-1. Нитроцеллюлозные стрипы, предварительно обработанные буфером «для забивки» (1х фосфатно-солевой буфер (PBSw), содержащий 7% сухого молока и 11% нормальной лошадиной сыворотки), инкубировали с растворами сывороток ВИЧ-инфицированных лиц в буфере «для забивки» (1:100) в течение 45 мин, затем еще 45 мин. с раствором конъюгата моноклональных иммуноглобулинов мыши к суммарным IgG человека с пероксидазой хрена (ООО «Импакт», Россия) на буфере «для забивки». Параллельно проводили опыт с тем же образцом сыворотки, используя моноклональный конъюгат иммуноглобулинов мыши к IgG3 человека с пероксидазой хрена (SouthernBiotech, США, 9210-05). Визуализацию результата проводили с использованием диаминобензидина, реакцию останавливали путем промывания водой.
Забор крови осуществлялся из локтевой вены с последующим добавлением ЭДТА. Количество забранной крови колебалось от 1 до 1,5 мл. Цельную кровь осаждали на центрифуге «Eppendorf» в течение 15 минут при скорости 2000 об/мин. К полученной фракции клеток добавляли 600 мкл буфера TST (1М Tris-HCl рН 7,5, 100 тМ MgCb, ЇМ сахароза и 10% тритон XI00), перемешивали и центрифугировали 20 сек при скорости 13000 об/мин, супернатант сливали, а к клеточному осадку опять добавляли TST буфер. Процедура повторялась до тех пор, пока цвет клеточного осадка не изменялся с красноватого на белый. Далее, к очищенным клеткам добавлялись 200 мкл «лизирующего буфера» (10 тМ Трис-HCl рН 8, 1шМ ЭДТА, 0,5% NP40, 0,5% Tween 20 и протеиназа К до конечной концентрации, 200 мкл/мл). Клетки перемешивали в растворе и инкубировали 2 часа при температуре 56 С и 10 мин при 96 С для инактивации протеиназы К. Полученные лизаты хранили при температуре - 20 С и использовали для полимеразной цепной реакции (ПЦР) по мере надобности [Маниатис и др., 1984].
Электрофорез препаратов ДНК проводили в 1х трис-ацетатном буфере (ТАЕ) следующего состава: 0,04 М трис-ацетат, 0,002М ЭДТА рН 8 [Маниатис и др., 1984]. Перед нанесением пробы на гель к ней добавляли раствор для нанесения образцов (0,07% бромфенолового синего, 7% додецилсульфата натрия, 50% раствор глицерина в воде) в отношении 1 часть раствора бромфенола синего к 5 частям раствора ДНК. Для визуализации ДНК в гель добавляли бромистый этидий до конечной концентрации 5 нг/мл. Электрофорез проводили в агарозном геле при постоянной силе тока в 130 тА. Детекцию фрагментов ДНК проводили в УФ-свете (Х,=254 nm) на трансиллюминаторе
GVM 20X (Syngene, Великобритания). Определение размера амплифицированного продукта ПЦР проводили при помощи фрагментов A,flHK/HindIII (Invitrogen, США). Документацию результата проводили с использованием гель-документирующей системы CN-08 (Vilber Lourmat, Франция).
Для сравнительного анализа была выбрана область провирусной ДНК ВИЧ-1, соответствующая участку 5 -LTR с -348 по +181 нуклеотид (координаты здесь и далее даны для варианта ВИЧ-1 НХВ2, регистрационный номер GenBank К03455). Создание праймеров, оптимальных для амплификации нужного фрагмента, осуществляли на основе работы Ramirez de Arellano с соавторами [Ramirez de Arellano et al, 2005]. Реакционная смесь для проведения 1-го раунда амплификации объемом 25 мкл содержала 2,5 мкл ДНК, однократный буфер для постановки ПЦР (500 mM КС1, 100 тМ Трис-НС1, 15 mM MgC12, рН 8,3; Amplisense), 0,2 тМ дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) в эквимолярных пропорциях (Promega), 10 пкмол каждого праймера и 0,75 ед. AmpliTaq-полимеразы (5ед/и1, Perkin Elmer). Далее пробирки с реакционной смесью помещали в термоциклер GeneAmp PCR System 2400 (Perkin Elmer) или GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems) и подвергали термической обработке: 1 цикл [94С - 3 мин.], 40 циклов [94С - 40 сек., 50С - 40 сек., 72С - 1 мин.], 1 цикл [72С - 10 мин.]. Реакционную смесь для проведения 2-ого раунда ПЦР готовили путем добавления 6 мкл продуктов 1-го раунда ПЦР к 94 мкл реакционной смеси с идентичными компонентами и прежними концентрациями, но содержащими в 2 раза меньшую концентрацию праймеров второго раунда. Второй раунд ПЦР проводился при следующих условиях: 1 цикл [94С - 3 мин.], 40 циклов [94С - 40 сек., 52С - 40 сек., 72С - 1 мин.], 1 цикл [72С - 10 мин.].
Контроль размера, количества и гомогенности амплифицированного участка ДНК проводили методом электрофореза в 1,2% агарозном геле в їх ТАЕ.
Амплификацию области с +203 до +368 положения проводили методом гнездовой ПЦР. Реакционная смесь для проведения 1-го раунда амплификации объемом 25 мкл была аналогична смеси, используемой для амплификации региона 5 -LTR, но содержала оригинальные праимеры, при этом концентрация праимеров в I и II раундах была одинаковой. Саму реакцию и проверку результатов ее проводили на оборудовании, описанном выше. Температурный режим I раунда: 1 цикл [94С - 2 мин.], 35 циклов [94С - 30 сек., 52С - 30 сек., 72С - 1,5 мин.], 1 цикл [72С - 7 мин.]. Температурный режим II раунда: 1 цикл [94С - 2 мин.], 35 циклов [94С - 30 сек., 56С - 30 сек., 72С - 1 мин.], 1 цикл [72С - 7 мин.]. Контроль результата реакции проводили аналогично предыдущим реакциям.
Температурный режим I раунда: 1 цикл [94С - 3 мин.], 40 циклов [94С - 40 сек., 52С - 40 сек., 72С - 1 мин.], 1 цикл [72С - 10 мин.]. Температурный режим II раунда: 1 цикл [94С - 3 мин.], 40 циклов [94С - 40 сек., 49С - 40 сек., 72С - 1 мин.], 1 цикл [72С -10 мин.]. Контроль результата реакции проводили аналогично предыдущим реакциям.
Для очистки ДНК использовали коммерческую систему Jetquick Gel Extraction Spin Kit/50 (Genomed, Германия). Очистку проводили в соответствии с инструкцией производителя. В основе ситемы лежит принцип очистки и концентрации ДНК с помощью колонок.
