Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы. 13
1.1. Фаза I биотрансформации 13
1.1.1. Структура и свойства CYP1A1 16
1.1.1.1. Механизм активации транскрипции гена CYP1A1 20
1.1.1.2. Транскрипционная и пост-трансляционная регуляция CYP1A1 нетипичными индукторами 21
1.1.1.3. Восстановительный метаболизм аристолоховой кислоты 22
1.1.1.4. Полиморфизм гена CYP1A1 24
1.1.1.4.1. Гидроксилирование эйкозапентаеновой кислоты 26
1.1.1.4.2. Гидроксилирование метаболитов эстрогена 28
1.1.1.4.3. Метаболизм бензопирена 31
1.1.2. Структура и свойства CYP2C9 33
1.1.2.1. Первая кристаллическая структура фермента CYP2C9 33
1.1.2.1.1. Сравнительный анализ кристаллических структур CYP2C9 10G5ulR90 35
1.1.2.1.2. Роль аминокислотного остатка Arg97 в структуре фермента CYP2C9 39
1.1.2.1.3. Роль аминокислотного остатка Asp293 в структуре фермента CYP2C9 40
1.1.2.2. Локализация гена CYP2C9 и способность к индукции 41
1.1.2.3. РВ-распознающие элементы 41
1.1.2.4. Ядерный рецептор CAR 43
1.1.2.4.1. Транслокация CAR в ядро 43
1.1.2.4.2. Стероидные гормоны как модуляторы активности CAR 44
1.1.2.5. Распознающие элементы гена CYP2C9 45
1.1.2.6. PXR-опосредованная индукция CYP2C9 рифампицином, гиперфорином и фенобарбиталом 46
1.1.2.7. Пост-трансляционная регуляция CYP2C9 48
1.1.2.8. Полиморфизм гена CYP2C9 50
1.1.2.8.1. Влияние полиморфизма в CYP2C9 на N-гидроксилирование сульфаметоксазола 57
1.1.2.8.2. Активация полиморфных вариантов CYP2C9 эффектором дапсоном 52
1.1.2.8.3. CYP2C9 генотип-зависимое влияние бензбромарона на метаболизм флурбипрофена 54
1.1.2.8.4. Предрасположенность к мультифакториальным заболеваниям 57
1.1.3. Другие представители семейства CYP2 58
1.1.3.1. Структура и свойства CYP2C19 58
1.1.3.1.1. Локализация гена CYP2C19 и способность к индукции 60
1.1.3.1.2. Полиморфизм гена CYP2C19 62
1.1.3.2. Структура и свойства CYP2D6 63
1.1.3.2.1. Кристаллическая структура фермента CYP2D6 63
1.1.3.2.1.1. Гем-связывающий домен CYP2D6 66
1.1.3.2.1.2. Активный центр фермента CYP2D6 66
1.1.3.2.1.3. Роль аминокислотных остатков Asp301 и Glu216 в структуре фермента CYP2D6
4 1.1.3.2.1.4. Роль аминокислотного остатка Phel20 в структуре фермента CYP2D6 69
1.1.3.2.2. Локализация гена CYP2D6 и способность к индукции 70
1.1.3.2.3. Полиморфизм гена CYP2D6 70
1.2. Фаза II биотрансформации 73
1.2.1. Суперсемейство GST's 74
1.2.1.1. Локализация GSTT1 и генетический полиморфизм 75
1.2.1.2. Локализация GSTM1 и генетический полиморфизм 76
1.2.2. Ариламин-Ы-ацетилтрансферазы (NAT's) 77
1.2.2.1. Локализация NAT2 и генетический полиморфизм 79
1.2.3. Хинонредуктаза NQ01 81
1.3. Гены системы фолатного метаболизма 83
1.3.1. Метилентетрагидрофолатредуктаза (MTHFR) 83
1.3.1.1. Полиморфизм гена MTHFR 85
1.3.2. Метионинсинтаза (MS) и метионинсинтазаредуктаза (MTRR) 89
1.4. Генетический полиморфизм и онкологические заболевания 92
1.5. Микрочипы в диагностике и лечении лимфопролиферативных заболеваний... 95
ГЛАВА 2. Материалы и методы 101
2.1. Пациенты ЮГ
2.2. Исследуемые образцы 103
2.3. Синтез олигонуклеотидов и изготовление микрочипов 105
2.4. Мультиплексная полимеразная цепная реакция (ПЦР) 106
2.5. Визуализация ПЦР продуктов в агарозном геле ПО
2.6. Гибридизация, регистрация изображения и обработка полученных результатов ПО
2.7. Секвенирование 112
2.8. Статистическая обработка результатов 113
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 115
3.1. Разработка нового варианта биочипа для анализа полиморфизма в генах системы биотрансформации 115
3.2. Полиморфизм генов системы биотрансформации и риск развития лейкозов и лимфом во взрослом возрасте . 117
3.2.1. Распределение CYP1A1 и GSTM1 генотипов 117
3.2.1.1. Сочетание CYP1A1 и GSTM1 генотипов 119
3.2.2. Межполовые различия в частотах полиморфных вариантов генов системы биотрансформации 121
3.2.2.1. Распределение CYP1A1 генотипов у мужчин 121
3.2.2.2. Распределение GSTT1 и GSTM1 генотипов у женщин 123
3.2.2.3. Распределение аллелей гена CYP2C9 у мужчин 125
3.3. Полиморфизм генов системы биотрансформации и риск развития острого лейкоза у детей 128
3.3.1. Распределение GST's и NAT2 генотипов 128
3.3.1.1. Распределение GST's генотипов 128
3.3.1.2. Распределение NAT2 генотипов 130
3.3.1.3. Сочетание GST's и NAT2 генотипов 132
3.3.2. Анализ распределения генотипов CYP1A1, GST's, NAT2 и MTRR при разделении пациентов, больных острыми лейкозами, и здоровых доноров на группы по половому признаку 133
3.3.2.1. Распределение GST's генотипов 133
3.3.2.2. Распределение NAT2 генотипов 136
3.3.2.3. Сочетание GST's и NAT2 генотипов 136
3.3.2.4. Распределение MTRR генотипов у девочек 138
3.3.2.4.1. Сочетание GST's и MTRR генотипов у девочек 139
3.4. Полиморфизм генов системы биотрансформации и риск развития рецидива острого лейкоза у детей 141
3.4.1. Распределение CYP1A1 и GST's генотипов 141
3.4.1.1. Сочетание CYP1A1 и GST's генотипов 145
3.4.2. Распределение NAT2 генотипов 147
3.4.2.1. Сочетание GST's и NAT2 генотипов 149
3.4.3. Анализ распределения генотипов CYP1A1, GST's и NAT2 при разделении пациентов, больных ОЛЛ или ОМЛ, по половому признаку 152
3.4.3.1. Распределение CYP1A1 и GST's генотипов у мальчиков, больных острыми лейкозами. Сочетание генотипа CYP1A1 *1/*2А и GST's генотипов 152
3.4.3.2. Распределение CYP1A1 и GST's генотипов у девочек, больных острыми лейкозами. Сочетание генотипа CYP1A1 *1/*2А и GST's генотипов 153
3.4.3.3. Распределение NAT2 генотипов 155
3.4.3.4. Сочетание GST's и NAT2 генотипов 156
Заключение 159
Выводы. 162
Список литературы...
- Транскрипционная и пост-трансляционная регуляция CYP1A1 нетипичными индукторами
- PXR-опосредованная индукция CYP2C9 рифампицином, гиперфорином и фенобарбиталом
- Синтез олигонуклеотидов и изготовление микрочипов
- Полиморфизм генов системы биотрансформации и риск развития лейкозов и лимфом во взрослом возрасте
Введение к работе
Актуальность проблемы.
За последнее время накоплено большое число данных о том, что генетический полиморфизм определяет наследственную предрасположенность к онкологических заболеваниям, а также лежит в основе индивидуальной чувствительности к лекарственным препаратам Именно поэтому анализ генетического полиморфизма является чрезвычайно актуальной задачей Выявление ассоциаций полиморфных аллелей генов с конкретным заболеванием и ответом на лекарственную терапию позволяет не только выявлять механизмы заболевания и исследовать его природу, но и разрабатывать подходы к «персонализированной» медицине, те лечению, учитывающему биохимическую индивидуальность каждого пациента Отдельно следует отметить, что ввиду вариабельности частот аллелей в различных популяциях, выявление взаимосвязи полиморфизма генов с риском развития лимфопролиферативных заболеваний, а также с эффективностью лечения данных заболеваний остается актуальным для каждой популяционной группы
Для проведения исследования были выбраны гены CYP1A1, CYP2D6, GSTT1, GSTM1, MTHFR, MTRR, NQOl, CYP2C9, CYP2C19 и NAT2 (так называемые гены системы биотрансформации), белковые продукты которых играют важную роль в метаболизме как противоопухолевых препаратов, так и широкого круга ксенобиотиков Имеются данные, что наличие полиморфизма в генах системы биотрансформации вносит вклад в формирование первичных онкогематологических заболеваний (таких как лимфомы и лейкозы), а также влияет на частоту и особенности развития рецидивов (Майорова и др, 2002, Чупова и др, 2005) Тем не менее, частота лишь немногих аллелей указанных генов исследовалась в российской популяции (Блохина, 2004)
Отдельно следует отметить, что для одновременного определения многих аллельных вариантов ДНК наиболее целесообразным является подход, сочетающий мультиплексную полимеразную цепную реакцию и гибридизацию с олигонуклеотидными микрочипами В 2004 году в ИМБ РАН был разработан алгоритм создания биочип-тест-систем для анализа генетического полиморфизма человека на примере детекции полиморфных вариантов генов системы биотрансформации CYPIA1, CYP2D6, GSTT1, GSTM1, MTHFR, NAT2, CYP2C9 и CYP2C19 — ПФ-биочип (Глотов и др, 2005) Однако оставалось актуальным создание биочипа, включающего более широкий спектр аллельных вариантов генов системы биотрансформации, для последующего анализа факторов предрасположенности, прогноза и эффективности лечения больных злокачественными заболеваниями крови Поскольку детальный анализ литературных данных показал, что наличие генотипов MTHFR 1298А/А,'MTRR 66Ah, NQOl T/- и NAT2 341С/-ассоциировано с развитием лейкозов и лимфом (Skibola et al, 1999, Krajinovic et al, 2000, Krajinovic et al, 2002, Gemmati et al, 2004), мы сочли целесообразным включение в анализ
указанных полиморфных вариантов генов системы биотрансформации MTHFR, MTRR, NQOl и NAT2 Таким образом, расширенный вариант биочипа позволяет более полно характеризовать функциональное состояние ферментов системы биотрансформации Предполагается, что изучение генетического полиморфизма ферментов системы биотрансформации с помощью этого биочипа в группах пациентов, больных злокачественными заболеваниями крови, и в группе здоровых доноров, жителей России, позволит получить более точную информацию о молекулярно-генетической природе заболевания, что, в свою очередь, позволит проводить предиктивную диагностику данных опухолевых заболеваний, а в случае болезни осуществлять индивидуальный подбор лекарственной терапии
Цели и задачи исследования.
Целью диссертационной работы является определение критериев предрасположенности, прогноза и эффективности лечения больных лимфомами и лейкозами в российской популяции на основании изучения генетического полиморфизма в соответствии с функциональным состоянием ключевых ферментов метаболизма ксенобиотиков и лекарственных препаратов
Достижение этой цели предусматривало решение следующих задач
Разработать биочип, позволяющий анализировать полиморфные варианты генов MTHFR (1298А>С), MTRR (66A>G), NQOl (609ОТ) и NAT2 (341Т>С), наличие которых в других популяциях, по данным литературы, ассоциировано с развитием злокачественных лимфом и лейкозов, и оптимизировать работу биочипа для 1 б однонуклеотидных замен и 2 делеций в 10 генах CYP1A1 (48870А, 4889A>G, 6235Т>С), CYP2D6 (1934G>A, 2637delA), GSTT1 (делеция), GSTM1 (деления), MTHFR (6770Т, 1298А>С), MTRR (66A>G), NQOl (609ОТ), CYP2C9 (430ОТ, 1075ОТ), CYP2C19 (681G>A) и NAT2 (341T>C, 4810Т, 590G>A, 857G>A)
Проанализировать ассоциацию указанных полиморфных вариантов генов CYP1A1, CYP2D6, GSTTI, GSTM1, MTHFR, MTRR, NQOl, CYP2C9, CYP2C19 и NAT2 с риском развития Т-клеточных Неходжкинских лимфом (НХЛ) и В-клеточного хронического лимфоцитарного лейкоза (В-ХЛЛ) у взрослых, жителей Европейской части России
Проанализировать ассоциацию указанных полиморфных вариантов генов CYP1A1, CYP2D6, GSTTI, GSTM1, MTHFR, MTRR, NQOl, CYP2C9, CYP2C19 и NAT2 с риском развития острого лейкоза у детей, жителей Европейской части России
Определить прогностическую значимость указанных полиморфных вариантов генов CYP1A1, CYP2D6, GSTTI, GSTM1, MTHFR, MTRR, NQOl, CYP2C9, CYP2C19 и NAT2 в развитии рецидива острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ) и острого миелобластяого лейкоза (ОМЛ) у детей, жителей Европейской части России
Научная новизна.
В данной работе предложен биочип, который позволяет выявлять генетическую предрасположенность к таким социально-значимым онкогематологическим заболеваниям как лимфомы и лейкозы, а также прогнозировать развитие рецидива острого лейкоза
Впервые определены частоты полиморфных вариантов генов CYP1A1 (48870А, 4889A>G, 6235Т>С), CYP2D6 (1934G>A, 2637deIA), GSTT1 (деления), GSTM1 (делеция), MTHFR (6770Т, 1298А>С), MTRR (66A>G), NQOl (609ОТ), CYP2C9 (430ОТ, 1075ОТ), CYP2C19 (68Ш>А) и NAT2 (3411>C, 4810T, 590G>A, 857G>A) у взрослых, больных НХЛ или В-ХЛЛ, жителей Европейской части России, и проведено сравнение с группой здоровых лиц Показано, что полиморфные варианты гена CYP1A1 (48870А, 4889A>G, 62351>С) и «нулевой» GSTM1 генотип чаще встречаются у больных НХЛ и В-ХЛЛ, чем у здоровых индивидов Впервые выявлено увеличение частоты аллелей *2 и *3 гена CYP2C9 у мужчин, больных В-ХЛЛ, по сравнению с группой здоровых доноров мужского пола
Проведен сравнительный анализ частот генотипов и аллелей генов CYP1A1, CYP2D6, GSTT1, GSTM1, MTHFR, MTRR, NQOl, CYP2C9, CYP2C19 и NAT2 у детей, больных острыми лейкозами, и здоровых индивидов Впервые обнаружено, что у пациентов с острым лейкозом генотип NAT2 341T/T,481C/C,590G/G, а также сочетание данного генотипа «быстрого» ацетилирования NAT2 с «нулевым» GSTT1 генотипом, «нулевым» GSTM1 генотипом и двойным «нулевым» GSTT1IGSTM1 генотипом встречается чаще, чем у здоровых доноров Кроме того, впервые выявлено уменьшение частоты генотипа MTRR 66G/G у девочек, больных острыми лейкозами, по сравнению с группой здоровых доноров женского пола
Определены частоты полиморфных вариантов генов CYP1A1, CYP2D6, GSTT1, GSTM1, MTHFR, MTRR, NQOl, CYP2C9, CYP2C19 и NAT2 у детей с первично диагностированным острым лейкозом и в рецидиве заболевания Показана ассоциация генотипа CYP1A1 *1/*2А и «ненулевого» GSTT1 генотипа с развитием рецидива ОЛЛ При анализе частот аллелей гена NAT2 впервые обнаружено, что у пациентов с рецидивом ОЛЛ чаще встречается генотип NAT2 341С/-, 481T/-,590G/G,857G/G, тогда как у пациентов с рецидивом ОМЛ - генотип 341Т/Г,481С/С,590А/-(по сравнению с пациентами с первично диагностированным ОЛЛ и ОМЛ, соответственно)
Практическая значимость.
Ввиду того, что полиморфные варианты генов CYP1A1 (48870А, 4889A>G, 6235Т>С), GSTT1 (делеция), GSTM1 (делеция), MTRR (66A>G), CYP2C9 (430ОТ, 1075ОТ) и/или NAT2 (341Т>С, 481 ОТ, 590G>A) могут модулировать риск развития НХЛ, В-ХЛЛ и острых лейкозов, следует рекомендовать анализ полиморфизма данных генов в качестве прогностического теста для оценки риска развития злокачественных лимфом и лейкозов
Кроме того, поскольку изученные полиморфные варианты генов CYP1A1 (4887С>А, 4889A>G, 6235Т>С), GSTT1 (делеция), GSTM1 (делеция) и NAT2 (341Т>С, 4810Т, 590ОА) являются прогностическими факторами риска развития рецидива острого лейкоза у детей, данные аллельные варианты следует учитывать при индивидуализированном подходе к стандартной терапии заболевания Так, например, в Дании лечение больных ОМЛ, носителей «нулевого» GSTM1 генотипа, проводят низкими дозами антрациклинов, поскольку именно такая скорректированная терапия обуславливает более благоприятный прогноз (Autrup et al, 2002)
Аппобаиия работы.
Основные результаты работы были представлены на 6-ой Международной конференции по молекулярной генетике соматических клеток (Звенигород, 2005), 7-ой Международной конференции молодых онкологов «Современные проблемы экспериментальной и клинической онкологии» (Киев, Украина, 2006), Европейских конгрессах по генетике человека в 2006 г (Амстердам, Нидерланды) и 2007 г (Ницца, Франция), Международной конференции по геному человека (Хельсинки, Финляндия, 2006), Международной конференции «Генетика в России и мире», посвященной 40-летию ИОГен РАН (Москва, 2006), 3-ей Международной конференции «Геномика, протеомика, биоинформатика и нанотехнологии в медицине» (Новосибирск, 2006), 11-ом Конгрессе педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии» (Москва, 2007), 5-ом Российском симпозиуме с международным участием «Биологические основы терапии онкогематологических заболеваний» (Москва, 2007) Отдельные фрагменты диссертационной работы докладывались на научных семинарах Лаборатории биологических микрочипов ИМБ РАН
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 6 статей и 9 тезисов
Структура и объем диссертации.
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего У^Уисточников Работа изложена на «^«страницах машинописного текста и содержит -^рисунков и */таблиц
Транскрипционная и пост-трансляционная регуляция CYP1A1 нетипичными индукторами
Молекулярный механизм транскрипционной активации с помощью гетеродимера Ап-рецептор-ARNT впервые был получен для гена CYP1A1 и его индукции ТХДД. Гены CYP1A1 человека, крыс и мышей обладают сходной структурой в регуляторной области и содержат множественные копии XRE элемента в энхансерной области между -800 и -1300 парами оснований (п.о.) относительно точки инициации транскрипции [49]. В работе Whitlock и соавт. [390] было показано, что обе энхансерная и промоторная области гена CYP1A1 находятся в нуклеосомной конфигурации, и недоступны для факторов транскрипции в отсутствие агониста Ah-рецептора. Активация Ah-рецептора приводит к распаду хроматина в энхансерной и промоторной областях гена CYP1A1, не затрагивая при этом остальные участки хроматина (рис. 5). Взаимодействие гетеродимера Ah-рецептор-ARNT с последовательностью XRE приводит к потере нуклеосомной структуры в энхансерной области, при этом в данном процессе не участвуют трансактивационные домены (TAD) Ah-рецептора или ARNT [237,238]. С другой стороны, связывание белка с промоторной областью, которая расположена непосредственно перед точкой инициации транскрипции, зависит от наличия функционального TAD Ah-рецептора. Следовательно, TAD является медиатором взаимодействия энхансера с промотором [237,289].
Механизм, по которому димер Ап-рецептор-ARNT активирует транскрипцию CYP1A1, до конца не ясен. Тем не менее, по аналогии с ядерными рецепторами гормонов, можно предположить, что TAD Ah-рецептора связывает коактиваторы и другие факторы, которые последовательно формируют основной транскрипционный аппарат, в том числе комплекс полимеразы II, в промоторной области. В подтверждение этого в работах [55, 239, 251] было показано, что гетеродимер Ап-рецептор-ARNT взаимодействует с представителями семейств р160 и СВР/рЗОО. Кроме того, в работах [325, 366] было также выявлено, что комплекс Ah-рецептора способен напрямую взаимодействовать с базальными факторами транскрипции, такими как TFIIB и TFIIF.
Транскрипционная и пост-трансляционная регуляция CYP1A1 нетипичными индукторами. Из данных литературы известно, что, помимо типичных индукторов, некоторые бензимидазольные производные также способны активировать транскрипцию гена CYP1A1 (рис. 6) [48-50]. Среди них выделяют ингибиторы секреции желудочного сока омепразол (ОМЕ) и ланзопразол (LAN), которые вызывают повышение экспрессии CYP1A1 в гепатоцитах [109] и пищеварительном тракте человека [274], хотя данные соединения не обладают структурными свойствами лигандов Ah-рецептора [154]. NH, бензимидазол примахин
Структурные формулы бензимидазола, омепразола и примахина. Помимо транскрипционной активации, CYP1A1 может также подвергаться посттрансляционной регуляции. Так, например, в работе Werlinder и соавт. [387] было показано, что примахин (противомалярийное вещество, которое, как и бензимидазолы, не является классическим лигандом Ah-рецептора) не только активирует комплекс Ah-рецептора и вызывает индукцию транскрипции гена CYP1A1, но также препятствует деградации фермента CYP1A1, связываясь в его активном центре. Известно, что примахин нейтрализует рН в лизосомах, и тем самым ингибирует лизосомный протеолиз [311]. Чтобы исключить возможность того, что ингибирование деградации CYP1A1 обусловлено дисфункцией лизосом, в работе [387] были также протестированы другие лизосомотрофные соединения. Было вьивлено, что только примахин, в отличие от хлорохина и хлорида аммония, в значительной степени ингибирует деградацию CYP1A1. С другой стороны, хлорохин и хлорид аммония эффективно ингибируют деградацию долгоживущих белков клетки [221,387].
В работе [387] также было показано, что примахин характеризуется спектром связывания II типа с ферментом CYP1A1 и является лигандом высокого сродства. Как известно, лиганды II типа конкурируют с кислородом за связывание с атомом железа гема, и, таким образом, предотвращают активацию кислорода ферментами Р450. Активация кислорода приводит к окислительной модификации белков, что, в свою очередь, усиливает вероятность протеолитической атаки [224]. Следовательно, протективное действие примахина, вероятно, обусловлено ингибированием передачи электрона от NADPH-цитохром Р450 редуктазы к ферменту CYP1A1 (как было вьивлено в случае CYP2E1) [387,415].
Восстановительный метаболизм аристолоховой кислоты.
Помимо основных монооксигеназных реакций, таких как гидроксилирование алифатического или ароматического атома углерода, эпоксидирование двойной связи, окисление атома (N, S) и окислительное дезаминирование, фермент CYP1A1 может также катализировать восстановление нитрогруппы в ароматических соединениях. Рассмотрим в качестве примера восстановительный метаболизм аристолоховой кислоты (рис. 7).
PXR-опосредованная индукция CYP2C9 рифампицином, гиперфорином и фенобарбиталом
Как известно, рифампицин является значимым лигандом hPXR [281]. Ранее было показано, что ядерный рецептор hPXR является медиатором при индукции CYP2C9 рифампицином, и действие hPXR опосредовано через два предполагаемых сайта связывания CAR (проксимальный и дистальный) [85, 149]. В работе Ferguson и соавт. [127] было показано, что проксимальный сайт CYP2C9 в первую очередь необходим для индукции рифампицином, тогда как дистальный сайт, по-видимому, обеспечивает максимальную индукцию. Помимо этого бьшо выявлено, что оба сайта CAR-RE связывают hPXR, однако проксимальный элемент образует значительно более устойчивый комплекс, чем дистальный.
Гиперфорин, активный компонент зверобоя, является лигандом PXR высокого сродства и способен активировать промотеры CYP3A4 и CYP2B6 посредством активации PXR и специфичных PXR цис-элементов данных генов [280, 381]. В работе Ferguson и соавт. [127] была также выявлена PXR-опосредованная активация CYP2C9 гиперфорином в концентрации 0.2 нМ, что свидетельствует о высоком сродстве данного соединения к PXR.
Известно, что при индукции CYP2C9 фенобарбитал действует как CAR-активатор. Помимо этого, РВ участвует в регуляции CYP3A4 через PXR, и, вероятно, является медленным агонистом PXR [271, 281]. В работе Ferguson и соавт. [127] было выявлено, что, помимо CAR-зависимого механизма активации CYP2C9, индукция РВ также может быть опосредованной через hPXR.
Таким образом, при PXR-зависимой индукции CYP2C9 рифампицином, гиперфорином и фенобарбиталом основным распознающим PXR элементом, по-видимому, является проксимальный сайт CAR-RE, локализованный на расстоянии -1839 п.о. от точки инициации транскрипции. Второй дистальный CAR/PXR-распознающий элемент на расстоянии -2899 п.о. участвует в индукции CYP2C9 в значительно меньшей степени.
Помимо транскрипционной регуляции CYP2C9 может также подвергаться посттрансляционной регуляции. Известно, что фермент CYP2C9 зачастую не подчиняется кинетике Михаэлис-Ментен. Так, например, авторами Korzekwa и др. [240] было показано, что дапсон - лекарственное вещество, которое применяется для лечения лепры и герпетиформного дерматита, - активирует СУР2С9-опосредованное 4 -гидроксилирование флурбипрофена в микросомах печени человека. В работе Hutzler и соавт. [204] с помощью кинетических методов была изучена активация дапсоном 4 -гидроксилирования флурбипрофена и деметилирования напроксена и было выявлено, что в присутствии дапсона увеличивается значение VmaX и понижается значение Кт для обоих субстратов (рис. 24). Результаты данного кинетического исследования позволяют предположить, что молекула дапсона не замещает данные субстраты из активного центра фермента CYP2C9. Помимо этого, дапсон является субстратом CYP2C9 в терапевтических концентрациях и метаболизируется с образованием производных гидроксиламина [152,398], что свидетельствует о его расположении во время активации в активном центре фермента и подтверждает гипотезу о существовании эффекторного центра в активном центре.
Авторами Hummel и др. [202] было сделано предположение, что в присутствии дапсона флурбипрофен располагается ближе к простетической группе гема в активном центре фермента CYP2C9. С помощью метода ЯМР в данной работе были определены расстояния от различных протонов флурбипрофена до атома железа гема, которые
Следует отметить, что наибольшие различия в удаленности от гема были выявлены для протона в 4 -положении флурбипрофена: в отсутствие дапсона данное расстояние составляет 4.41 А, тогда как в присутствии эффектора - 3.50 А. Кроме того, также было получено, что расстояние от протонов дапсона до гема в отсутствии флурбипрофена составляет 4.40 А, а в присутствии данного субстрата - 4.00-4.01 А, что подтверждает предполагаемую ориентацию флурбипрофена и дапсона в активном центре фермента CYP2C9. Таким образом, присутствие дапсона обуславливает активацию гидроксилирования посредством сближения 4 -протона флурбипрофена с атомом железа гема CYP2C9.
Помимо этого, авторами Hutzler и др. [205] были определены значимые для активации фермента CYP2C9 функциональные группы эффектора дапсона. Структурные формулы аналогов дапсона приведены на рис. 26.
Синтез олигонуклеотидов и изготовление микрочипов
Помимо этого, для дифференциальной диагностики Т-клеточных лимфом и реактивных заболеваний с лимфопролиферативным компонентом разработан биочип, который позволяет выявлять перестройки у-цепи Т-клеточного рецептора [26,166]. Данный биочип содержит олигонуклеотидные зонды на все Vy и Jy гены, которые участвуют в перестройках у-цепи Т-клеточного рецептора, то есть 9 зондов на Vy гены (Vy2, Vy3, Vy4, Vy5, Vyl, Vy8, Vy9, VylO, Vyll) и 4 зонда на Учтены (Jyl/Jyl, Jyp, Jypl, JypI). При анализе поликлональной популяции Т-лимфоцитов на биочипе определяются сигналы практически от всех Ууи Jy генов (рис. 48А), тогда как в случае преобладания в образце «клональных» клеток, несущих в результате реарранжировки определенную комбинацию V-J генов, с первых циклов ПЦР начинают нарабатываться однотипные ампликоны, что и выявляется в результате гибридизации (рис. 48Б) [26, 166]. Таким образом можно определять наличие моноклональных Т-клеток в клиническом образце.
Определение Т-клеточной клональности с помощью биочипа. (А) -поликлональный образец здорового донора: вверху - гибридизационная картина, внизу -диаграмма распределения интенсивности флуоресцентного сигнала. Горизонтальная сплошная линия соответствует пороговому значению ПЗ, ни один из сигналов не превышает ПЗ. (Б) - образец больного с Т-клеточной лимфомой. Сигналы от групп Vy2, VylO, Jyl/2 превышают ПЗ, что соответствует наличию биаллельной клональной реаранжировки Vy2/ Jyl/2\ VylO/Jyl/2.
Также разрабатываются биочипы для выявления генетической предрасположенности к некоторым онкологическим заболеваниям и для определения индивидуальной чувствительности к ряду лекарственных препаратов [11, 26, 35, 288]. Так, создан ШМТ-биочип для идентификации наиболее распространенных мутаций в гене ТПМТ, наличие которых приводит к снижению активности фермента. С помощью данного биочипа проводилась оценка переносимости терапии 6-меркаптопуринами в зависимости от ТПМТ-генотипа и было показано, что у 10% детей, больных ОЛЛ, жителей России, имеется повышенный риск тиопуриновой токсичности вследствие наследственного дефицита ТПМТ [26, 35,288].
Дальнейшим развитием этого направления явилось создание биочипа для анализа полиморфизма в других генах системы биотрансформации, включающего наиболее функционально значимые аллельные варианты генов CYP1A1 (48870А, 4889A G,
Пример гибридизационной картины, полученной на ПФ-биочипе. Стрелками указаны полиморфные варианты, наличие которых приводит к изменению каталитической активности ферментов. «Фармакогенетический» биочип является базовой молекулярно-диагностической платформой для анализа генетической предрасположенности к ряду онкологических заболеваний. При этом следует отметить, что в зависимости от конкретной исследовательской или диагностической задачи (например, в зависимости от формы изучаемого заболевания) биочип может быть легко модифицирован.
Из данных литературы известно, что наличие генотипов MTHFR 1298А/А, MTRR 66GI-, NQ01 77- и NAT2 341С/- ассоциировано с развитием таких социально-значимых онгогематологических заболеваний как лимфомы и лейкозы [146, 245, 247, 347]. В связи с этим создание расширенного варианта ПФ-биочипа, включающего указанные полиморфные варианты генов системы биотрансформации MTHFR, MTRR, NQ01 и NAT2, 100 оставалось актульной задачей. Необходимость разработки данного биочипа была обусловлена отсутствием подходящей системы для одновременного изучения полиморфизма всех выбранных генов системы биотрансформации с целью дальнейшего анализа факторов предрасположенности, прогноза и эффективности лечения больных злокачественными лимфомами и лейкозами.
Кроме того, поскольку частоты аллелей в различных популяциях варьируют, данные по предрасположенности или ответу на противоопухолевую терапию, полученные на одной популяции, могут отличаться от таковых для другой популяции, даже если эти популяции являются близкими. В настоящее время существует всего несколько работ, в которых авторы анализировали полиморфизм некоторых генов системы биотрансформации у больных злокачественными заболеваниями крови, жителей России [5, 19]. Тем не менее данных по частотам аллелей и генотипов основной части генов системы биотрансформации больных лимфомами и лейкозами, жителей Европейской части России, на сегодняшний день нет.
Таким образом, предполагается, что получение и анализ генотипических данных больных злокачественными заболеваниями крови и здоровых индивидов, жителей Европейской части России, по генам CYP1A1 (48870А, 4889A G, 6235Т С), CYP2D6 (1934G A, 2637delA), GSTT1 (делеция), GSTM1 (делеция), MTHFR (6770Т, 1298А С), MTRR (66A G), NQ01 (609ОТ), CYP2C9 (430ОТ, 1075ОТ), CYP2C19 (681G A) и JV/ІП (341Т С, 4810Т, 590G A, 857G A) с помощью расширенного варианта биочипа даст более полную информацию о молекулярно-генетической природе заболевания, а именно позволит выявить гены, вовлеченные в патогенез онкогематологических заболеваний, а также сделает возможным прогнозирование течения болезни и клинического исхода.
Полиморфизм генов системы биотрансформации и риск развития лейкозов и лимфом во взрослом возрасте
Ранее упоминалось (см. п. 1.5), что в лаборатории биологических микрочипов ИМБ им. В.А. Энгельгардта РАН был создан биочип для анализа полиморфизма в генах системы биотрансформации, который позволял анализировать 12 однонуклеотидных замен и 2 делеции в восьми различных генах (рис. 49) [11]. В диссертационной работе к разработанному ранее биочипу были добавлены маркеры MTHFR (1298А С), MTRR (66A G), NQOl (609ОТ) и NAT2 (3411 С), наличие которых в других популяциях, по данным литературы, ассоциировано с развитием таких онкологических заболеваний, как лимфомы и лейкозы [89,146,245,253,258].
Новый вариант биочипа позволяет анализировать 16 однонуклеотидных замен и 2 делеции в десяти различных генах: CYP1A1 (48870А, 4889A G, 6235Т С), CYP2D6 (1934G A, 2637delA), GSTT1 (деления), GSTM1 (делеция), MTHFR (6770Т, 1298А С), MTRR (66A G), NQOl (609ОТ), CYP2C9 (430ОТ, 1075ОТ), CYP2C19 (681G A) и NAT2 (341Т С, 481 ОТ, 590G A, 857G A). На рис. 55 приведен пример гибридизационной картины, полученной на данном биочипе, для образца со следующим генотипом: CYP1A1 ( !/ !), CYP2D6 ( 4/ 1), GSTT1 (-/-), GSTM1 (+/+), MTHFR (Т/Т; А/А), MTRR (A/G), NQOl ( 2/ 1), CYP2C9 ( 2/ 1), CYP2C19 ( 2/ 1), NAT2 (S2/S3). Следует отметить, что на данном рисунке генотипы всех изученных генов приведены в соответствии с общепринятой классификацией [11,22,139,246].
Новый вариант биочипа для анализа полиморфизма в генах системы биотрансформации был протестирован на 25 контрольных и более 1100 диагностических образцах. В контрольных образцах мутации были определены ранее с помощью двух других методов: ПДРФ-анализа и секвенирования. Сравнение данных рестрикционного анализа, секвенирования и гибридизации на микрочипе показало полное совпадение результатов.
С помощью нового варианта биочипа в диссертационной работе были определены частоты полиморфных вариантов генов CYPIA1, CYP2D6, GSTT1, GSTM1, MTHFR, MTRR, NQOl, CYP2C9, CYP2C19 и NAT2 у взрослых пациентов, больных НХЛ или В-ХЛЛ, и у детей с острыми лейкозами, а также проведено сравнение с частотами полиморфных вариантов данных генов в соответствующих группах здоровых доноров. Помимо этого в работе проведено сравнение частот полиморфных вариантов данных генов у детей с первично диагностированным острым лейкозом и у детей в рецидиве заболевания.
В диссертационной работе были определены частоты CYP1A1 генотипов у взрослых пациентов с диагнозами НХЛ или В-ХЛЛ, и у здоровых доноров. При анализе частот у больных НХЛ и больных В-ХЛЛ было выявлено увеличение частоты гетерозигот и гомозигот по мутации (гетерозиготных и гомозиготных вариантов) 6235С/-, 4889G/- и 4887А/- гена CYP1A1, а также комбинации данных полиморфных вариантов по сравнению с группой здоровых доноров (таблица 3, рис. 56А).
Такое увеличение частоты гетерозиготных и гомозиготных вариантов 6235С/-, 4889G/- и 4887А/- гена CYP1A1 может быть объяснено следующим образом. Ранее упоминалось (см. п. 1.1.1), что ген CYP1A1 кодирует гидроксилазу ароматических углеводородов, которая участвует в окислительном метаболизме ряда ксенобиотиков (включая ПАУ, такие как бензопирен) [147]. В результате таких реакций образуются реактивные метаболиты (рис. 14), которые способны ковалентно связываться с белками и нуклеиновыми кислотами, что определяет их цитотоксическое, мутагенное и канцерогенное действие. Наличие полиморфизма в гене CYP1A1 обуславливает повышение ферментативной активности, и, как следствие, усиливает токсичность субстратов фермента CYP1A1 [337]. Так, например, из данных литературы известно, что вариант CYP1A1 2А может увеличивать риск развития лейкоза, особенно в тех случаях, когда индивиды подвергаются действию пестицидов или канцерогенов табачного дыма [141,217,244,246].
