Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 12
Раздел 1. Полиморфизм тиопурин-8-метилтрансферазы (ТПМТ) 12
1.1. Метаболизм тиопуриновых препаратов в организме человека 12
1.2. Фермент ТПМТ, его основные свойства и функции в клетке 16
1.3. Генетический полиморфизм гена ТПМТ человека 17
1.3.1. Структура и функции гена ТПМТ. 17
1.3.2. Полиморфные аллели гена ТПМТ. 18
Раздел 2. Мутации в генах BRCA1/2 и СНЕК2 и наследственный РМЖ иг РЯ 23
2.1. Эпидемиология РМЖ и РЯ 23
2.1.1. Заболеваемость и смертность от РМЖ и РЯ в мире 23
2.1.2. Факторы риска развития РМЖ и РЯ 25
2.2. Наследственные синдромы предрасположенности к РМЖ и РЯ 27
2.3. Гены предрасположенности к РМЖ и РЯ 30
2.3.1. Высоко- и низкопенетрантные гены предрасположенности к РМЖиРЯ 30
2.3.2. Гены BRCA1 и BRCA2, их структура и функции их белковых продуктов 31
2.3.3. Ген СНЕК2, его структура и функции белкового продукта 41
2.4. BRCA1, BRCA2 и СНЕК2 мутации 43
2.4.1. Основные типы мутаций в генах BRCA1, BRCA2 и СНЕК2 ассоциированные с риском развития РМЖ и РЯ 43
2.4.2. Спектр и частота мутаций BRCA1, BRCA2 и СНЕК2 генов в различных популяциях мира 45
2.4.3. Риск развития РМЖ и РЯ для носителей мутаций в генах BRCA1, BRCA2 и CHEK2 50
2.4.4. Молекулярно-патологические особенности BRCA-ассоциированных опухолей МЖ и яичников 52
2.4.5. Основные подходы к профилактике онкозаболеваний для носителей BRCA1, BRCA2 и СНЕК2 мутаций 54
Раздел 3. Молекулярно-генетические методы диагностики мутаций в генах человека 56
3.1. Основные молекулярно-генетические методы, применяемые для диагностики мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2 56
3.2. ДНК-биочипы: история создания, типы, применение 57
3.2.1 История создания и основные типы ДНК-биочипов, применяемых в настоящее время 57
3.2.2. ДНК-биочипы на основе трехмерных ячеек геля и их основные приложения 62
Глава II. Материалы и методы 70
1. Клинический материал 70
2. Экстракция геномной ДНК из лейкоцитов периферической крови 72
3. Изготовление биочипов 73
3.1. Синтез олигонуклеотидных проб 73
3.2. Технология производства биочипов 76
4. Проведение ПЦР 77
4.1. Синтез олигонуклеотидов-праймеров 77
4.2. Амплификация фрагментов ДНК 78
4.3. Визуализация продуктов ПЦР в агарозном геле 82
5. Гибридизация меченого продукта ПЦР на биочипе 82
6. Регистрация и анализ полученных результатов гибридизации 83
7. Секвенирование ДНК 85
8. Статистическая обработка данных 85
Глава III. Результаты и их обсуждение 86
Раздел 1. Диагностика полиморфизма гена ТПМТ . 86
1.1. Подготовка образца ДНК для анализа 86
1.1.1. Выбор метода подготовки образца ДНК 86
1.1.2. Подбор системы праймеров для проведения двухэтапной ПНР... 87
1.1.3. Выбор оптимального температурно-временного режима ПЦР ... 89
1.1.4. Оптимизация химического состава реакционной смеси ПЦР 91
1.2. Разработка ТПМТ-биочипа 94
1.2.1. Выбор полиморфных вариантов в гене ТПМТ для анализа на биочипах 94
1.2.2. Подбор дискриминирующих олигонуклеотидов для идентификации олигонуклеотидных замен в гене ТПМТ человека и разработка схемы ТМПТ-биочипа 95
1.2.3. Подбор оптимальных физико-химических параметров гибридизации на биочипе 98
1.2.4. Оценка точности и чувствительности метода 104
1.3. Генотипирование пациентов 108
Раздел 2. Диагностика наследственных мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2 112
2.1. Подготовка образца ДНК для анализа 112
2.2. Разработка РМЖ-биочипа 113
2.2.1. Выбор генов и мутаций 113
2.2.2. Подбор олигонуклеотидов и разработка схемы РМЖ-биочипа. Подбор оптимальных физико-химических параметров гибридизации 114
2.2.3. Оценка точности и чувствительности метода 115
2.3. Диагностика наследственных форм РМЖ и РЯ у больных РМЖ, РЯ и ПМЗН 118
2.3.1. Анализ частоты мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2 у больных \ РМЖ,РЯиПМЗН 118
2.3.2. Взаимосвязь наличия мутаций в генах BRCA1, BRCA2 и СНЕК2 возраста начала заболевания 122
2.3.3. Взаимосвязь наличия мутаций в генах BRCA1I2 и СНЕК2
и семейной истории заболевания 124
Заключение 127
Выводы 129
Список использованной литературы
- Генетический полиморфизм гена ТПМТ человека
- Высоко- и низкопенетрантные гены предрасположенности к РМЖиРЯ
- Экстракция геномной ДНК из лейкоцитов периферической крови
- Выбор оптимального температурно-временного режима ПЦР
Введение к работе
В настоящее время молекулярно-генетический анализ находит все более широкое применение в клинической диагностике. Помимо выявления мутаций, приводящих к развитию врожденных наследственных заболеваний, актуальным становится анализ полиморфизма генома человека.
Полиморфные участки в геноме человека, представляющие собой точечные мутации (замена одного нуклеотида, небольшие делеции и вставки) определяют биохимическую индивидуальность человека, а также индивидуальную реакцию на воздействие факторов внешней среды, действие различных ксенобиотиков, в том числе и лекарственных препаратов. В частности, полиморфные аллели часто обеспечивают формирование функционально неполноценных белков, что приводит к снижению или отсутствию их активности. Если данные белки участвуют в метаболизме лекарственных препаратов, это в свою очередь может быть причиной появления симптомов передозировки или токсического действия назначаемых препаратов. Одним из ярких примеров тому — наследственная недостаточность фермента тиопурин-8-метилтрансферазы (ТПМТ), обусловленная инактивирующими точечными мутациями в гене ТПМТ. Недостаточность данного фермента приводит к непереносимости противоопухолевых и иммуносупрессорных лекарственных препаратов тиопуринового ряда.
Кроме этого, полиморфные варианты генов определяют предрасположенность к различным мультифакториальным заболеваниям, например, онкологическим. В этом смысле, одной из хорошо изученных моделей таких ассоциаций является, связь мутаций* в высокопенентрантных генах-супрессорах BRCA1 и BRCA2 с развитием наследственного рака молочной железы (РМЖ) и рака яичников (РЯ). Ранее проведенные исследования показали, что из всех случаев возникновения РМЖ и РЯ от 5 до 10% являются наследственными, 85% из которых обусловлены мутациями в генах BRCA1 и BRCA2. Низкопенентрантные гены, такие как PTEN, Р53, ATM,
9 CHEK2, FANC, NBS1 и др. в 1-15% случаев отвечают за развитие индивидуальной и семейной синдромальной патологии.
Идентификация полиморфных вариантов и мутаций в генах человека является на сегодняшний момент актуальной проблемой генодиагностики, и одним из эффективных подходов в данном направлении — создание точного и быстрого метода диагностики. В частности, определение полиморфизма гена ТПМТ позволит в дальнейшем прогнозировать риск развития осложнений при лечении тиопуринами у лиц с полиморфизмами гена ТПМТ, а также подбирать индивидуальную схему терапии данными препаратами не только в онкогематологии, но и при трансплантации органов, и при лечении различных аутоиммунных заболеваний. Выявление носителей мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2 поможет разработать наиболее эффективную стратегию лечения уже имеющегося онкозаболевания и профилактику других злокачественных новообразований.
Для анализа точечных полиморфизмов и мутаций в генах человека в ИМБ РАН им. В.А.Энгельгардта разработан метод, сочетающий мультиплексную полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и гибридизацию с олигонуклеотидными биочипами. Данный метод достаточно прост и хорошо воспроизводим, что позволяет проводить анализ не только в научных лабораториях, но и в медицинских учреждениях.
И та, и другая модель уже являются объектами генетического тестирования в странах Западной Европы и Америке. Поскольку, ранее полиморфизм гена ТПМТ в России не изучался, в настоящей работе с помощью разработанного ТПМТ-биочипа было проведено широкомасштабное исследование частоты аллелей данного гена в популяции Европейской части России. Что касается выявления наследственных форм РМЖ и РЯ, ассоциированных с мутациями в генах BRCA1, BRCA2 и СНЕК2 у российских пациентов, то ранее был проведен ряд исследований на небольших выборках (40-300 чел). В основном, это были пациенты с отягощенным семейным
10 анамнезом и другими признаками наследственного опухолевого фенотипа (ранний возраст манифестации заболевания, двухстороннее поражение парных органов и т.д.). Исследования, проведенные на выборках пациентов с диагнозом РМЖ смешанных по возрасту и семейной истории заболевания, были посвящены анализу частоты только двух мутаций - 5382insC в гене BRCA1 и llOOdelC в гене СНЕК2. Это вызывает необходимость проведения дополнительного исследования частоты различных мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2 у российских пациентов с диагнозом РМЖ и РЯ в смешанной по возрасту и семейной истории заболевания выборке для выявления доли наследственных форм в общей структуре заболеваемости.
Целью работы является разработка методов диагностики полиморфизма гена ТПМТ, связанного с недостаточностью фермента ТПМТ, и мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2, ассоциированных с наследственными формами РМЖ и РЯ, с использованием технологии олигонуклеотидных биочипов.
В соответствии с поставленной целью предполагалось решить следующие основные задачи:
1. Разработать метод аллель-специфичной гибридизации на биочипе для анализа шести наиболее распространенных в мировых популяциях точечных полиморфных вариантов в гене ТПМТ (G238C, G292T, G460A, G644A, T681G, A719G).
2. Определить частоты генотипов и аллелей гена ТПМТ у детей с гемобластозами и здоровых доноров, жителей Европейской части России, используя разработанный ТПМТ-биочип, и сравнить их с таковыми в популяциях других стран.
3. Разработать метод аллель-специфичной гибридизации на биочипе для анализа семи наиболее распространенных в популяциях Восточной Европы точечных мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2 (185delAG, 300T>G, 4153delA и 5382insC в гене BRCAl, 695insT и 6174delT в гене BRCA2, мутация llOOdelC в гене СНЕК2) и полиморфизма 4158A>G в гене BRCAL
4. Провести исследование частот этих мутаций и полиморфизма 4158A>G в смешанной по возрасту и семейной истории заболевания выборке пациентов, жителей Европейской части России, с диагнозом РМЖ, РЯ и ПМЗН и определить долю наследственных форм рака в общей структуре заболеваемости.
Провести сравнение частоты наиболее распространенных мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2 у жителей Европейской части России и стран Европы.
Проанализировать семейный анамнез пациентов-носителей мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2.
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 310 источников. Работа изложена на 168 страницах машинописного текста, содержит 33 рисунка и 12 таблиц.
Генетический полиморфизм гена ТПМТ человека
Генетический анализ особенностей метаболизма ксенобиотиков, в том числе лекарственных средств, позволил выявить высокую степень изменчивости генов, кодирующих соответствующие ферменты у человека. Существование фармакогенетического полиморфизма приводит к разным фенотипическим реакциям на одни и те же лекарственные препараты (Nebert D.W., 1997; Mancinelli L. et al, 2000; Середенин СБ., 2002; Daly A.K., 2003; Nagasubramanian R. et al, 2003; Brockmoller J. et al, 2007). Одним из таких ферментов, обуславливающих проявление фармакогенетического полиморфизма, является ТПМТ.
Ген ТПМТ (МІМ 187680) локализован в районе 6р22.3 и состоит из 9 интронов и 10 экзонов, имеет протяженность 34 т.п.о. (рис. 3). Открытая рамка считывания (ОРС) составляет 735 п.о. Псевдоген ТПМТ локализован в районе 18q21.1 и имеет ОРС приблизительно с 96% гомологией по отношению к гену ТПМТ, кодирующему активный фермент (Woodson L.C. et al, 1983; Krynetski E.Y. et al, 1996,1999; Weinshilboum R., 2001; McLeod H.L. et al, 2000; Seki T. et al, 2000).
Обнаружение полиморфизмов в гене ТПМТ у пациентов с низкой активностью ТПМТ позволило предположить, что именно они ассоциированы с потерей активности белка и, соответственно, лежат в основе нарушения метаболизма 6-МП в организме этих пациентов. Исследования, показавшие наследственную природу ТПМТ-недостаточности, получили дальнейшее развитие в результате идентификации ряда инактивирующих точечных замен в гене ТПМТ человека.
Ранее было показано, что существуют различные модели распределения активности ТПМТ, в т.ч. тримодальная (Weinshilboum R.M. et al, 1980), бимодальная (Kham S.K. et al, 2002) и унимодальная (Jang I.J. et al, 1996). В популяции белого населения наблюдается тримодальное распределение активности фермента, то есть в среднем у 1 из 300 человек имеется выраженная недостаточность ТПМТ, что приводит к миелотоксическому действию лекарственных препаратов, применяемых в стандартных дозах. Около 10% людей являются гетерозиготами, характеризующимися пониженной активностью ТПМТ, что также может привести к токсическому эффекту препаратов. Около 90% популяции имеют нормальную активность ТПМТ (Krynetski E.Y. et al, 1996; Schaeffeler E. et al, 2004).
ТПМТ-недостаточность передается по наследству как аутосомальный рецессивный признак (Weinshilboum R.M. et al., 1980).
В настоящее время описано более 20 различных аллелей гена ТПМТ, которые кодируют фермент с нормальным — ТПМТ 1 (предковый аллель или аллель дикого типа) и TITA4T 1S, и измененным уровнем активности белка (ТПМТ 1 А, ТЛМТ 2- 23) (Weinshilboum R.M. et al, 1980; Evans W.E. et al, 2004; Hamdan-Khalil R. et al, 2004; Schaeffeler E. et al, 2006) (табл. 1).
Подобно мутантным аллелям других полиморфных локусов, данные аллели содержат точечные олигонуклеотидные замены, приводящие к аминокислотным заменам (ТПМТ 2, ЗА, ЗВ, ЗС, 5- 14, 16- 23), к преждевременному формированию терминирующего кодона (ТПМТ 30), разрушению участка сплайсинга (ТПМТ 4) или делеции 25АК (ТПМТ 15). Предковый аллель или аллель дикого типа обозначен как ТПМТ !, а аллель, содержащий так называемую молчащую мутацию Т474С, которая не приводит к какому-либо изменению в ферментативной активности, обозначена как ТПМТ JS (Yates C.R. et al, 1997). Также, в организмах с высоким уровнем ТПМТ-активности был обнаружен аллель 1А, содержащий точечную мутацию С—»Т нуклеотида (-178) в экзоне 1 (Spire-Vayron de la Moureyre С. et al, 1998).
Полиморфный аллель ТПМТ 2 определяется точечной нуклеотидной заменой G238C в ОРС, обуславливающей аминокислотную замену в 80 кодоне (А1а Рго) белка ТПМТ (Krynetski E.Y. et al, 1995). Активность мутантной формы ТПМТ 2 в 100 раз ниже данного показателя белка дикого типа.
Полиморфный аллель ТПМТ ЗА содержит две точечные нуклеотидные замены в ОРС, приводящие к аминокислотной замене в 154 кодоне (Ala Thr) и кодоне 240 (Tyr Cys) (Szumlanski С. et al, 1996).
Высоко- и низкопенетрантные гены предрасположенности к РМЖиРЯ
В ранних работах Вильяме В. и Андерсон Д. (1984 г.) на материале 200 датских родословных с помощью сегрегационного, корреляционного и компонентного анализов установили, что наиболее приемлемой моделью наследования РМЖ в семьях является модель аутосомно-доминантного гена с возраст-зависимой пенетрантностью (Williams W. et al, 1984).
При этом НРМЖ имеет следующие характерные клинические особенности: = наличие в семье одной или более родственницы I-II степени родства, страдающих РМЖ; = ранний возраст манифестации заболевания (до 40-45 лет); = двухстороннее поражение молочных желез; первичная множественность новообразований у пробанда и/или его родственников (поражение других органов, помимо молочных желез); = случаи возникновения РМЖ по мужской линии.
В настоящее время описаны несколько синдромов наследственной предрасположенности к возникновению РЯ: семейный РЯ; риск развития заболевания зависит от числа ближайших родственников, заболевших ранее РЯ. В семьях, в которых зарегистрирован один случай РЯ у родственницы 1 степени родства (у матери, дочери или родной сестры), риск заболеть в 2-3 раза выше, чем в популяции, и составляет 4-5%. В семьях, где выявлен РЯ у одной родственницы 1 степени родства и одной родственницы 2 степени родства (у бабушки, внучки, двоюродной сестры, тети или племянницы), риск возрастает в 4-5 раз по сравнению с популяционным и равняется 7%. В семьях, где две родственницы 1 степени родства заболевают РЯ, рискует заболеть каждая вторая, т.е. риск равен 50% (Carlson K.J. et al., 1994); семейный РМЖ/РЯ. В таких семьях ближайшие родственники пробанда заболевают РМЖ и РЯ в молодом возрасте (до 50 лет). Степень риска заболеть раком этих локализаций также определяется числом заболевших родственниц различной степени родства; синдром Линча II; синдром Ли-Фраумени; атаксия-телеангиэктазия; синдром Пейтца-Егерса; синдром базально-клеточного невуса (синдром Горлина-Гольтца) ассоциирован с мутациями в гене PTCH (Ragge N.K. et al., 2005). Характеризуется развитием множественных базально-клеточных карцином, кист костей челюсти, и мелких оспин на коже ладоней и подошв стоп (Ljubenovic М. et al., 2007). У женщин с синдромом Горлина в 20% случаев развиваются доброкачественные фибромы яичников. Существует определенный, хотя и незначительный риск, что эти фибромы могут перерождаться в злокачественные фибросаркомы и Др.
Высоко-и низкопенетрантные гены предрасположенности к РМЖ и РЯ. До 90-95% всех случаев РМЖ и РЯ являются спорадическими, от 5 до 10% - это наследственный рак, вызванный наследуемыми мутациями в пенентрантных генах (Ford D. et at, 1998) (рис. 4). Спороди РМЖи РЯ 90-95Х Наследствен ный РМЖи РЯ гены, могут быть разделены на несколько категорий в зависимости от того, участвуют ли они в образовании спонтанных, либо же генетически обусловленных опухолей, а также в зависимости от выполняемых в клетке функций.
В первую очередь, это высокопенетрантные гены-супрессоры — BRCA1 и BRCA2, мутации в которых встречаются приблизительно в 5% всех случаев РМЖ и в 80% семейных случаях РМЖ (50% семейных случаев связаны с мутациями в гене BRCA1 и 30% - с мутациями в гене BRCA2) (Easton D.F., 1994; Wooster R. et al, 1994): За80-90% случаев ПМЗН (сочетание РМЖ и РЯ) отвечают мутации в гене BRCA1 и за 14% - в гене BRCA2 (Ford D. et al, 1998).
Низкопенентрантные гены, такие как СНЕК2, PTEN, Р53, ATM, FANC, NBSl и другие, отвечают за 1-5% случаев развития индивидуальной и семейной синдромальной патологии (Wooster R. et al, 2003).
Предполагается существование еще, по крайней мере, одного мажорного гена предрасположенности к РМЖ (Thompson D. et al, 2002). Однако попытки выделить гипотетический ген «BRCA3», обуславливающий высокий риск развития РМЖ, пока остаются безуспешными.
Также было доказано, что полиморфизм генов метаболизма стероидных гормонов (CYP17, CYP19, PR, ESR) и ксенобиотиков (CYP1A1, CYP2D6, GSTM1, GSTP1, MTHFR) оказывает мультипликативное влияние на риск РМЖ и может приводить к семейному накоплению заболевания (de Jong М.М. et al, 2002).
Экстракция геномной ДНК из лейкоцитов периферической крови
Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов периферической венозной крови с использованием стандартного- фенол-хлороформного метода (Sambrook et ah, 1989) с некоторыми модификациями: 1. К 2 мл крови добавляли 100 мкл ЭДТА («Sigma», США). 2. Смешивали кровь (обычно на пробу брали 500-1000 мкл) с равным1 объемом буфера (t=4C), состава: 0,32М сахароза, 5 мМ MgCI2, 1% Тритон X-100М, 0.1М TrisHCI рН 7.5. 3. Центрифугировали, 5000 об/мин, при 4С. Ядерный осадок и ресуспензировали в 400 мкл буфера, состава: 10 мМ TrisHCI рН 10.5, 0.15М NaCI, 1 мМ ЭДТА («Sigma», США). 4. Добавляли SDS («Sigma», США), до конечной концентрации 0.5% и инкубировали в присутствии протеиназы К (концентрации 20 мкг/мл) в течение 16 часов при 37С. 5. После инкубации добавляли 400 мкл забуференного фенола (Sambrook et ah, 1989), осторожно перемешивали 10 мин и центрифугировали 5 мин при 5000 об/мин. 6. Далее переносили верхнюю фазу в другую пробирку, добавляли 400 мкл смеси фенол-хлороформ (1:1). Перемешивали 5 мин, центрифугировали. Экстрагировали фенол из верхней обводненной фазы равным объемом хлороформа. 7. К раствору ДНК добавляли последовательно 50 мкл ЗМ ацетата натрия и 800 мкл охлажденного 96% этанола. Перемешивали и центрифугировали 15 мин при 14000 об/мин, промывали преципитат 1 мл 70% этанола. Центрифугировали повторно, осадок высушивали и растворяли ДНК в буфере ТЕ (10 мМ TrisHCI рН 7.4; 1 мМ ЭДТА рН 8.0).
Помимо этого в качестве альтернативного метода для выделения ДНК, из лейкоцитов- периферической крови использовали набор реагентов Wizard Genomic DNA Purification Kit («Promega», США) в соответствии с рекомендациями производителя.
Для; оценки качества» и количества выделенной ДНК проводили электрофоретический анализ в 1% агарозных гелях и детекцию ДНК в УФ-свете после окрашивания гелей бромистым этидием. Концентрацию ДНК оценивали при измерении оптической плотности при 260 и 280 нм. Считали, что выделенное ДНК высокого качества, если отношение А260/А280 было 1.8. ДНК хранили в ТЕ при t = 4С.
При подборе выборе олигонуклеотидных проб, ровно как и при выборе праймеров, использовали нуклеотидные последовательности генов ТПМТ, BRCA1/2 и СНЕК2, представленные в банке NCBI (http://www.ncbi.nlm.nihigov/). Олигонуклеотиды для биочипов синтезировали на 394 ДНК/РНК синтезаторе фирмы «Applied Biosystems» (США) в количестве приблизительно 0,2цМ. Нуклеотидные последовательности иммобилизованных олигонуклеотидов для ТПМТ-биочипа и РМЖ-биочипа приведены в табл. 4 и 5.
Последовательность олигонуклеотидов, используемых для иммобилизации в ячейках биочипа и отсутствие в них примесей посторонних олигонуклеотидов определяли после синтеза и очистки методом MALDL TOF MS (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry - времяпролетная масс-спектрометрия с лазерной десорбцией и ионизацией в присутствии матрицы). Анализ проводили на масс-спектрометре COMPACT MALDI IV фирмы «KRATOS Analytical» (Великобритания) в линейном режиме с регистрацией отрицательно заряженных ионов с использованием внешней калибровки.
Измерение масс (m/z) производили с точностью 0,2% измеряемой массы, что соответствует паспортному значению прибора. Измерение концентраций олигонуклеотидов проводили на приборе «Jasco 511» («Jasco», Япония). Микроматрицу, состоящую из ячеек гидрогеля полусферической формы, получали методом фотоиндуцируемой полимеризациии композиции, содержащей смесь олигонуклеотидов и мономеров для формирования геля. В качестве подложки для нанесения использовали Corning 2947 Micro Slides («Corning Glass Works», США). Стекла предварительно обрабатывали BindSilane («Merck», Германия) промывали этанолом и деионизованной водой и высушивали в беспылевых условиях. Смесь олигонуклеотидов и мономеров добавляли в микротитровальную плашку. Перенос компонентов на подложку проводили с использованием 150 мкм пина робота (Affymetrix GMS 417 Arrayer, «Affymetrix», США). Как правило, использовали состав смеси, содержащий 4% акриламид («Sigma», США), 0,25 % NjN -метилен бис-акриламид («Sigma», США), 65% глицерин и модифицированный олигонуклеотид (1000 — 8000 пмоль/мкл). По окончании-нанесения проводили фотополимеризацию в течение 40-50 минут (312 нм) при комнатной температуре и отмывали в воде при 65С в течение 30 минут. Диаметр капель составлял приблизительно 100 мкм, расстояние между ними было около 300» мкм. Объем каждой капли был равен примерно 0,2 нл.
Выбор оптимального температурно-временного режима ПЦР
Сейчас все более- широкое распространение в медицине приобретает индивидуальный подход к пациенту с учетом его фармакогенетического статуса. К молекулярно-генетическим методам, обеспечивающим реализацию программы персонализированной медицины, относится диагностика полиморфных вариантов и мутаций в генах, ассоциированных с непереносимостью различных ксенобиотиков, в т. ч., лекарственных средств, а также ассоциированных с предрасположенностью к тому или иному заболеванию. Такие тесты могут предоставить важную информацию о состоянии пациента, в том числе о восприимчивости к заболеванию, а также наиболее вероятных реакциях на лекарственные средства. По результатам таких тестов; в силу их прогностических возможностей; можно планировать наиболее эффективные профилактические вмешательства. Более того, так как многие тесты предназначены для выявления наследуемых генетических параметров, их результаты, могут иметь значение не только для, самого пациента, но и для его близких родственников. Поэтому разработка быстрого, точного, недорогого и простого в использовании метода генетического анализа олигонуклеотидных полиморфизмов и мутаций в генах человека - это одна из важных задач для ее развития.
Разработанные нами методы идентификации точечных полиморфных вариантов и мутаций в генах ТПМТ, BRCA1/2 и СНЕК2 с использованием технологии олигонуклеотидных биочипов отвечают этим требованиям. ТПМТ-и РМЖ-биочипы позволяют быстро и с высокой степенью достоверности диагностировать,точечные полиморфные варианты, и мутации в исследуемых генах. Следовательно, данные тест-системы можно с успехом применять в клинической практике и для проведения широкомасштабных исследований популяции с целью-выявления среди населения лиц-носителей тех или иных полиморфных аллелей и мутаций. В частности, это позволит в дальнейшем прогнозировать риск развития осложнений при лечении тиопуринами лиц с полиморфными вариантами гена ТПМТ, приводящими к дефициту фермента, а также подбирать индивидуальную схему терапии данными препаратами в онкогематологии, при трансплантации органов и при лечении различных аутоиммунных заболеваний. Выявление носителей мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2 поможет разработать наиболее эффективную стратегию лечения уже имеющегося онкозаболевания и профилактику других злокачественных новообразований. У здоровых носителей это позволит подобрать тактику проведения клинического мониторинга за состоянием здоровья и профилактику онкозаболеваний, которая может заключаться в проведении профилактических осмотров не реже двух раз в год, профилактических хирургических вмешательствах и химиопрофилактике. ТПМТ-биочип был включен в качестве составной части в тест-систему ПФ-биочип, предназначенную для выявления генетической предрасположенности к некоторым онкологическим заболеваниям и определения индивидуальной чувствительности к лекарственным препаратам (регистрационное удостоверение № ФС 01262006/5317-06 от 28 декабря 2006 г.).
1. Разработан метод диагностики шести точечных полиморфных вариантов в ТПМТ гене человека (G238C, G292T, G460A, G644A, T681G, A719G) на основании технологии олигонуклеотидных биочипов.
2. Определены частоты аллельных вариантов гена ТПМТ у жителей Европейской части России. Самым частым полиморфным аллелем, ассоциированным с ТПМТ-недостаточностью, является ТПМТ ЗЛ (85,7%), что согласуется с результатами, полученными для популяций Европы и белого населения Америки.
3. Разработан метод диагностики семи точечных мутаций в BRCA1/2 и СНЕК2 генах человека (185delAG, 300T G, 4153delA, и 5382insC в гене BRCA1, 695incT и 6174delT в гене BRCA2, 1 lOOdelC в гене СНЕК2) и полиморфизма 4158A G в гене ЯДС4Л
4. Определены частоты данных мутаций у пациентов, жителей Европейской части России, с диагнозом РМЖ, РЯ и ПМЗН с поражением МЖ и яичников. Показано, что наиболее распространенной является мутация 5382insC в гене BRCA1, что согласуется с ранее проведенными исследованиями.
5. Разработанные методы диагностики полиморфизма гена ТПМТ и наследственных мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2 могут быть предложены для проведения популяционных исследований и для использования в клинической практике.
