Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Биосинтез стероидных гормонов 10
1.1.1. Синтез стероидных гормонов в коре надпочечников человека -общие стадии 10
1.1.2. Синтез минералокортикоидов 13
1.1.3. Синтез глюкокортикоидов 14
1.1.4. Синтез половых гормонов 14
1.2. Наследственные нарушения биосинтеза стероидов 15
1.2.1. Адреногенитальный синдром 15
1.2.2. Формы недостаточности 21-гидроксилазы 16
1.2.3. Частота недостаточности 21-гидроксилазы 17
1.3. Особенности структуры и расположения гена CYP21A2 18
1.3.1 Область генов комплекса гистосовместимости III класса 18
1.3.2. Структура RCCX-модуля 20
1.3.3 Структура гена CYP21A2 и псевдогена CYP21AIP 21
1.4. Молекулярно-генетические механизмы возникновения и методы выявления мутаций в гене CYP21A2 25
1.4.1. Крупные делеции гена по механизму неравного кроссинговера 28
1.4.2. Небольшие генные конверсии 29
1.4.3 Мутации, не связанные с псевдогеном 30
1.4.4. Возникновение мутаций de novo ЗО
1.4.5. Методы выявления мутаций в гене CYP21A2 31
1.4.6. Молекулярно-генетический анализ гена CYP21A2 в российской популяции 34
1.4.7. Корреляция между генотипом и клинической формой заболевания при дефиците 21-гидроксилазы 35
1.5. Системы гетерологичной экспрессии генов, используемые для получения рекомбинантной стероид 21-гидроксилазы человека 39
1.6. Стероид 21-гидроксилаза как представитель надсемейства цитохромов Р450 43
1.6.1. Состав и функциональное значение надсемейства цитохромов Р450 43
1.6.2. Механизм монооксигеназной реакции 44
1.6.3. Пространственная организация молекул надсемейства цитохромов Р450 47
2. Экспериментальная часть 64
2.1 Пациенты и молекулярно-генетический анализ мутаций 64
2.2. Используемые клеточные линии и бактериальные штаммы 67
2.3. Создание генно-инженерных конструкций и сайт-специфичный мутагенез 68
2.4. Культивирование и трансфекция клеток COS-7 70
2.5. Анализ каталитической активности в клетках COS-7 70
2.6. Получение рекомбинантных бакуловирусных векторов 70
2.7. Получение рекомбинантных бакмид 71
2.8. Трансфекция клеток насекомых и получение рекомбинантных бакуловирусов 73
2.9. Определение вирусного титра 74
2.10. Экспрессия в клетках насекомых SJ9 и Ш5 75
2.11. Получение микросомных фракций 75
2.12. Анализ каталитической активности в микросомной фракции Ш5 76
2.13. Измерение концентрации белка 76
2.14. ДСН-ПААГ электрофорез 76
2.15. Вестерн-блот-анализ 77
2.16. Иммунофлуоресценция 77
2.17. Получение компетентных клеток E.coli и трансформация 78
2.18. Анализ клонов методом ПЦР 79
2.19. Выделение плазмидной ДНК 79
2.20. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции 79
2.21. Фракционирование и очистка фрагментов ДНК в агарозном геле. 80
2.22. Лигирование 80
2.23. Моделирование трехмерной структуры 80
3. Результаты и обсуждение 82
3.1. Введение мутаций в заданные положения нуклеотидной последовательности кДНК гена CYP21А2 82
3.2. Экспрессия и функциональный анализ CYP21А2 дикого типа и мутантных вариантов в клетках COS-7 85
3.3. Влияние мутаций на локализацию CYP21A2 в клетках COS-7 87
3.4. Экспрессия кДНК CYP21A2 и мутантного варианта C169R в клетках насекомых с использованием бакуловирусной системы 88
3.5. Ферментативная активность CYP21A2 и CYP21A2-C169R в препаратах микросом из клеток Ш5 92
3.6. Анализ модели трехмерной структуры 96
Заключение 110
Выводы 112
- Наследственные нарушения биосинтеза стероидов
- Системы гетерологичной экспрессии генов, используемые для получения рекомбинантной стероид 21-гидроксилазы человека
- Используемые клеточные линии и бактериальные штаммы
- Экспрессия кДНК CYP21A2 и мутантного варианта C169R в клетках насекомых с использованием бакуловирусной системы
Введение к работе
Адреногенитальный синдром (АТС; врожденная дисфункция коры надпочечников, ВДКН) - группа наследственных заболеваний человека с аутосомно-рецессивным характером наследования, обусловленных нарушением биосинтеза стероидных гормонов в коре надпочечников. Врожденным дефицитом стероид 21-гидроксилазы вызвано 90-95% всех случаев адреногенитального синдрома.
Фермент стероид 21 -гидроксилаза (21 -гидроксилаза, CYP21А2) катализирует монооксигеназные реакции превращения 17-гидроксипрогестерона (17-ОН прогестерона, 17 0НП) в дезоксикортизол и прогестерона в дезоксикортикостерон, участвуя в биосинтезе глюкокортикоидов и минералокортикоидов, соответственно, и относится к семейству цитохромов Р450. Белки этого семейства обнаружены у всех изученных эукариот и некоторых прокариот и широко участвуют в окислительном метаболизме эндогенных соединений (стероидогенезе, поддержании гомеостаза витамина Д), а также разнообразных ксенобиотиков (лекарств, химических канцерогенов, растительных метаболитов и пр.). Учитывая широкое распространение цитохромов Р450 и разнообразие катализируемых ими реакций, исследование белков этого семейства имеет большое значение для фармакологии (разработки новых лекарственных средств, определения индивидуальной переносимости лекарственных препаратов и т.д.), анализа экологических загрязнений, а также молекулярной генетики человека.
Недостаточность стероид 21-гидроксилазы является одним из наиболее распространенных генетических дефектов человека. Частота классических форм заболевания оценивается в среднем как 1:15000 новорожденных, тогда как неклассические случаи составляют 1% в общей популяции. Причина высокой частоты встречаемости дефицита 21-гидроксилазы объясняется особенностями организации области генома, в которой находится ген
CYP21A2. Он расположен в коротком плече шестой хромосомы (6р21.3) в локусе генов главного комплекса гистосовместимости третьего класса (называемого также областью HLA - Human Leukocyte Antigen- III класса). Длина гена CYP21A2 составляет 3,4 т.п.н, он содержит 10 экзонов и 9 интронов. На расстоянии 30 т.п.н. от активного гена CYP21A2 между генами 4-го компонента комплемента С4А и С4В расположен псевдоген CYP21A1P, Степень гомологии гена и псевдогена составляет 98% в экзонах и 96% в интронах (Higashi, et al, 1986; White, et al, 1986; Rodrigues, et al, 1987). Рекомбинация между высокогомологичными CYP21A2 и CYP21A1P по механизму неравного кроссинговера или генной конверсии является основной причиной дефицита 21-гидроксилазы. Наряду с этим, по мере проведения молекулярно-генетического скрининга мутаций в разных популяциях мира, накапливаются сведения о спонтанно возникающих мутациях, происхождение которых не связано с псевдогеном. Эти редкие или уникальные мутации характерны для отдельных семей или небольших по численности популяций. К настоящему моменту описано 60 таких мутаций.
Молекулярно-генетический анализ пациентов с адреногенитальным синдромом, проводимый в разных популяциях, выявляет хорошее соответствие между генотипом и клиническими проявлениями, которые в случае сочетанной гетерозиготности связаны с наименее поврежденным аллелем CYP21A2. Отмеченная корреляция генотипа и фенотипа позволяет классифицировать мутации в зависимости от степени инактивации 21-гидроксилазы, что крайне важно для прогнозирования тяжести заболевания в ходе пренатальной диагностики и своевременной пренатальной или ранней постнатальной терапии. Вовремя начатая пренатальная терапия помогает предупредить осложнения, связанные с нарушением стероидогенеза in utero, такие как повреждения репродуктивной функции, низкорослость, трансформация пола, а также водно-электролитный дисбаланс в случае наиболее тяжелой соль-теряющей формы заболевания.
При классификации редких и уникальных мутаций, когда статистический анализ клинических проявлений невозможен, наиболее надежным подходом является функциональная характеристика мутаций in vitro с последующим анализом модели пространственной структуры CYP2IА2 и установление соответствия между эффектами, обнаруженными ш vitro, и фенотипом пациента.
Для проведения функционального анализа мутаций CYP21A2 in vitro наиболее часто используемой системой экспрессии является система на основе клеток млекопитающих линии COS-1 и COS-7. Имеются также данные по экспрессии гена CYP21A2 в дрожжах, а также в клетках млекопитающих с использованием вируса осповакцины. Однако одним из наиболее перспективных подходов к получению высокого уровня экспрессии (в среднем 3-10% от общего количества белка клетки) функционально-активных белков эукариот, в большинстве случаев прошедших все стадии посттрансляционной модификации и созревания, для проведения функционального анализа и кристаллографии является бакуловирусная система экспрессии в клетках насекомых. Несколько цитохромов Р450 были успешно синтезированы в клетках насекомых, однако данных по экспрессии гена 21-гидроксилазы до настоящего времени не было.
Цель и задачи исследования.
Целью работы является функциональная характеристика уникальных миссенс-мутаций C169R, G178R, W302R, R426C, выявленных при проведении молекулярно-генетического тестирования российских пациентов в рамках совместного проекта Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН и Эндокринологического научного центра РАМН. Для этого было необходимо решить следующие задачи:
1 -введение миссенс-мутаций в кДНК гена 21-гидроксилазы человека для изучения свойств мутантных вариантов фермента in vitro;
2-получение рекомбинантных векторов для экспрессии кДНК стероид 21-гидроксилазы дикого типа и анализируемых мутантных вариантов в клетках млекопитающих линии COS-7 и клетках насекомых линий SJ9 и Ш5;
- определение влияния мутаций на биосинтез и ферментативную активность 21-гидроксилазы и ее свойства в клетках COS-7;
-получение функционально-активной стероид 21-гидроксилазы в клетках насекомых и изучение влияния одной из мутаций - C169R - на функциональную активность фермента в микросомных фракциях клеток насекомых;
- анализ модели пространственной структуры 21 -гидроксилазы, определение структурно-функциональных последствий аминокислотных замен, определяемых изучаемыми мутациями.
Наследственные нарушения биосинтеза стероидов
Адреногенитальный синдром (АГС, врожденная дисфункция коры надпочечников (ВДКН), врожденная вирилизирующая гиперплазия надпочечников) представляет собой группу наследственных заболеваний человека, обусловленных неполноценностью ферментных систем, участвующих в синтезе глюкокортикоидных и минералокортикоидных гормонов в коре надпочечников. При недостатке глюкокортикоидов, по механизму обратной связи, увеличивается секреция гипофизом адрено-кортикотропного гормона (АКТГ), что приводит к двусторонней гиперплазии коры надпочечников, увеличению концентрации прегненолона и, как следствие, активизации синтеза андрогенов. Избыточная продукция андрогенов является причиной вирилизации женского организма, проявления которой зависят от степени секреции андрогенов и времени начала патологии. Поэтому диагностика АГС очень важна уже на ранних стадиях развития плода. Известно несколько врожденных нарушений ферментных систем, приводящих к развитию АГС. Они могут быть обусловлены дефектами в генах, кодирующих белок StAR (липоидная гиперплазия надпочечников, синдром Прадера), 20,22-десмолазу, Зр-гидроксистероид дегидрогеназу, 17а-гидроксилазу (синдром Беглиери), 21 -гидроксилазу, 11 р-гидроксилазу, альдостерон синтазу, а также Р450-НАДФН-оксидоредуктазу. Однако преимущественное значение в клинике АГС имеют дефекты ферментов 21-гидроксилазы и 1 ip-гидроксилазы. Нарушения активности других ферментов стероидогенеза встречаются редко и приводят к высокой смертности больных в раннем детстве. 1.2.2. Формы недостаточности 21-гидроксилазы. Дефицит стероид 21-гидроксилазы составляет 90-95% случаев АГС. Клинические проявления заболевания обусловлены степенью нарушения активности 21-гидроксилазы. Условно выделяют классические (соль-теряющую и простую вирильную) и неклассические, мягкие (латентную и позднюю) формы дефицита 21-гидроксилазы. Соль-теряющая форма обусловлена полной потерей 21-гидроксилазной активности, приводящей к блоку биосинтеза глюкокортикоидов и минералокортикоидов на этапе превращения 17 - гидроксипрогестерона в 11 - дезоксикортизол и прогестерона в дезоксикортикостерон, соответственно, что сопровождается тяжелым соль-теряющим кризом в первые недели жизни новорожденного и часто приводит к смертельному исходу. Признаки надпочечниковой недостаточности (собственно синдром потери соли) проявляются в виде гипонатриемии, гиперкалиемии, дегидратации, артериальной гипотензии и гипогликемии. Без лечения больные погибают от сосудистого коллапса.
В более лёгких случаях, в первые месяцы жизни наблюдается отставание в росте и развитии, обнаруживается характерная для надпочечниковой недостаточности гиперпигментация кожи. С возрастом появляются такие же вирильные изменения, как при «классической» вирильной форме. Простая вирильная форма характеризуется псевдогермафродитизмом у девочек, являющимся следствием нарушенного синтеза глюкокортикоидов и повышенного синтеза андрогенов. В зависимости от периода онтогенеза, в котором нарушается гормональная функция надпочечников, симптомы вирилизации различны. Чем раньше плод женского пола подвергается действию андрогенов, тем грубее пороки развития наружных половых органов. Анаболический эффект андрогенов как у девочек, так и у мальчиков проявляется быстрым ростом и развитием мышц. Костный возраст при этом опережает паспортный—обычно в возрасте 10 лет эпифизарные щели закрываются, вследствие прекращения роста длинных трубчатых костей, отмечается умеренно выраженная диспластика—относительно короткие руки и ноги, длинное туловище. Хорошо развивается мышечная ткань, что еще больше подчеркивает атлетическое телосложение. Взрослые больные обычно низкого роста (150-155 см), физически хорошо развиты, имеют вирильные черты телосложения (узкий таз, широкие плечи). Неклассические, «мягкие» формы АГС характеризуются менее выраженными признаками вирилизма, а также ускоренным половым развитием, которое может проявляться с 5-6 летнего возраста. У женщин в половозрелом возрасте неклассические формы АГС проявляются в виде гирсутизма (оволосения по мужскому типу), нарушения менструального цикла и фертильности. 1.2.3. Частота недостаточности 21-гидроксилазы. Адреногенитальный синдром, обусловленный недостаточностью 21-гидроксилазы - одно из наиболее распространенных аутосомно-рецессивных генетических заболеваний человека. Частота классических форм недостаточности 21-гидроксилазы в большинстве стран варьирует в пределах 1:10000 до 1:18000, составляя в среднем для мировой популяции 1:15000 живых рождений. Частота этого заболевания в двух географически изолированных популяциях - жители острова Реньюн в Индийском океане и эскимосы Юпик Северной Аляски - достигает значений 1: 2100 и 1:280, соответственно (Pang, et al, 1982, Pang, et al, 1988). Ген CYP21A2 расположен в коротком плече шестой хромосомы человека (6р21.3) в локусе генов главного комплекса гистосовместимости (ГКГС; МНС- Major Histocompatibility Complex) третьего класса (называемого также областью HLA - Human Leukocyte Antigen- III класса). 1.3.1 Область генов комплекса гистосовместимости III класса. Областью генов гистосовместимости III класса условно называется отрезок ДНК длиной 700 т.п.о., расположенный между генами гистосовместимости I и II классов. Гены, входящие в его состав ни структурно, ни функционально не связаны с HLA-генами, и лишь некоторые из них связаны с иммунным ответом (Klein & Sato, 1998; Dawkins, et al., 1999).
Область генов гистосовместимости III класса содержит, по меньшей мере, 62 гена. Фрагмент генома, включающий ген CYP21A2, находится на расстоянии примерно 200 тысяч пар оснований от центромерной границы области генов HLA III класса и имеет наиболее сложную структуру среди МНС, а возможно, и всего генома человека. Здесь расположены четыре ключевых конститутивных гена (в порядке от теломерного конца) (рис. 3): 1. RPI (известный также как Gil или STK19), кодирующий ядерную серин/треонин протеинкиназу, длиной 11,4 т.п.о., экспрессирующийся повсеместно, 2. С4, кодирующий четвертый компонент комплемента, длиной 20,5 или 14,2 т.п.о., экспрессирующийся главным образом в печени, 3. CYP21A2 (известный также как CYP21, CYP21B, 210НВ), кодирующий стероид-21-гидроксилазу, длиной 3,4 т.п.о., экспрессирующийся в основном в коре надпочечников, 4. TNXB (TNX или ХВ), кодирующий белок внеклеточного матрикса тенасцин-Х, длиной 68,2 т.п.о. и экспрессирующийся в в коже, сухожилиях, кровеносных сосудах и некоторых других тканях. Четыре перечисленных гена образуют так называемый RCCX-модуль (RP1-C4-CYP21NXB), встречающийся обычно в виде тандемных повторов. Модульный характер расположения имеет существенное значение для структуры и экспрессии по крайней мере трех из этих генов. Центромерный конец RCCX-модуля находится в интроне 32 TNXB, теломерный конец - в экзоне 5 RPL Установлены два варианта размера RCCX-модуля: «короткий» - 26 483 п.о. и «длинный» - 32 856 п.о. (Rowen, et al, 1999). Это различие определяется наличием или отсутствием вставки 6373 п.о. в девятом интроне гена С4, которая представляет собой эндогенный ретровирус HERV-K(C4) (Patience, et al, 1997). HERV-K(C4) имеет ориентацию, противоположную ориентации гена С4. При транскрипции гена С4 с ретровирусной последовательностью HERV-K(C4) происходит образование антисмысловой РНК, которая, как показано в экспериментах на культуре клеток мыши L929, защищает клетки от инфекции экзогенными ретровирусами (Schneider, et al., 2001). Вследствие дупликации RCCX-модуля, большинство хромосом несет несколько генов комплемента С4 (С4Л и С4В), а также ген CYP21A2 и псевдоген CYP21A1P. Гены TNXB и RP1 дуплицируются не полностью, образуя свои усеченные копии TNXA и RP2. При этом RP2 представляет собой точную копию фрагмента RP1 длиной 1 т.п.о., тогда как TNXA - псевдоген длиной 5,1 т.п.о., имеющий делецию 120 п.о. по сравнению с TNXB, что в определенных случаях может приводить к развитию генетических дефектов. От двух третьих до трех четвертых всех копий шестой хромосомы в человеческой популяции имеют два RCCX-модуля, и в подавляющем большинстве из них элементы расположены следующим образом (от центромеры к теломере): TNXB-CYP21A2-C4B-RP2NXA-CYP21A1P-C4A-RP1 (рис. 3).
Системы гетерологичной экспрессии генов, используемые для получения рекомбинантной стероид 21-гидроксилазы человека
Экспрессия гена CYP21A2 дикого типа и с введенными мутациями в культивируемых клетках с последующим определением активности фермента in vitro является надежным способом классификации редких и уникальных мутаций, а также важна для установления взаимосвязи структуры и функции фермента. Функционально активная стероид 21-гидроксилаза для анализа мутаций in vitro получена в клетках млекопитающих, транзиентно трансфицированных рекомбинантным плазмидным вектором (Chiou, et al, 1990; Lajic, et al, 1997, Higashi, et al, 1988; Higashi & Fujii-Kuriyama, 1991; Nikoshkov, et al, 1997; Nikoshkov, et al, 1998) или инфицированных рекомбинантным вирусом осповакцины (Tusie-Luna, et al, 1990; Tusie-Luna, et al, 1991; Helmberg, et al, 1992), а также в дрожжевой системе (Wu & Chung, 1991; Hsu, et al, 1996; Hu, et al, 1996; Wu, et al, 1991). Рекомбинантная 21-гидроксилаза человека, синтезируемая в клетках E.coli с высоким выходом, используется для получения поликлональных антител (Ни & Chung, 1990). Учитывая особенности функционирования и локализации в клетках 21-гидроксилазы, как и других цитохромов Р450, для получения активного фермента клетки должны обладать развитой системой внутриклеточных мембран, ферментативной системой для синтеза гема, представленного у цитохромов Р450 протопорфирином IX, а также необходимой для катализа ФАД/ФМН-содержащей НАДФН-Р450-редуктазой (п. 1.6.). В настоящий момент для получения рекомбинантной 21-гидроксилазы широко используют линии клеток почки африканской зеленой мартышки, трансформированных вирусом SV40 - COS-1 и COS-7, поддерживающих экспрессию рекомбинантных генов, клонированных в векторе с сайтом начала репликации SV40. Система на основе клеток COS-1 и COS-7 нашла широкое распространение для продукции CYP21A2 и других цитохромов Р450, т.к. позволяет быстро (1-3 дня после трансфекции рекомбинантным плазмидным вектором) получить активный фермент для функционального анализа в интактных клетках. Однако эта система экспрессии характеризуется низким уровнем выхода рекомбинантного цитохрома Р450, недостаточным для определения кинетики ферментативной реакции в микросомной фракции и не позволяет определить содержание холо-фермента в клетках методами дифференциальной (разностной) спектроскопии.
Для повышения выхода рекомбинантной 21-гидроксилазы клетки COS-1 и COS-7 инфицируют рекомбинантными вирусами осповакцины. При этом содержание синтезируемой CYP21A2 достигает 2% от общего количества радиактивно меченного белка клетки (Tusie-Luna, et al, 1990). Значения Km рекомбинантного фермента дикого типа при измерении в клеточных лизатах инфицированных клеток (1.2 мкМ для 17-ОН-прогестерона и 2.8 мкМ для прогестерона) сходны с результатами, полученными для очищенной 21-гидроксилазы быка (0.3 - 7.9 мкМ для 17-ОН-прогестерона (Kominami, et al, 1980; Bryan, et al, 1974)) и свиньи (5 мкМ для 17-ОН-прогестерона и прогестерона (Yuan, et al, 1983)). Максимальная скорость реакции (Vmax) рекомбинантной 21-гидроксилазы человека составила 53 пмоль/(мин х мг белка) для 17-ОН прогестерона и 28 пмоль/(мин х мг белка) для прогестерона. Vmax очищенного препарата 21-гидроксилазы быка, измеренная в реакции с 17-ОН прогестероном - 110 пмоль/мин/мг CYP21A2. Необходимо отметить, что количество функционально активного рекомбинантного фермента в культуре клеток может ограничиваться недостатком гема или ФАД/ФМН-содержащей НАДФН-Р450-редуктазы, содержание которой снижается во времени при литической инфекции вирусом осповакцины (Tusie-Luna, et al, 1990). Несмотря на получение достаточно высокого уровня продукции функционально активной рекомбинантной 21-гидроксилазы человека в клетках млекопитающих при инфекции вирусом осповакцины, применение этой системы ограничено в связи с высокими требованиями биологической безопасности таких работ и трудоемкостью получения рекомбинантных вирусов. Дрожжевая система экспрессии позволяет получить рекомбинантную 21-гидроксилазу с выходом приблизительно 1% от общего клеточного белка. Km фермента дикого типа в реакции с 17-ОН-прогестероном в микросомных препаратах из S.cerevisiae составляет 0.15 мкМ (Hsu, et al, 1996) - 0.27 мкМ (Wu& Chung, 1991). Альтернативной эукариотической системой экспрессии, позволяющей получить высокий выход рекомбинантного белка (20-30% общего белка клетки) является бакуловирусная система на основе клеток насекомых (Baculovirus Expression Vector System Manual, «Pharmingen»). Разработка и упрощение технологий получения рекомбинантных бакуловирусов за счет сайт-специфической рекомбинации в клетках E.coli (Baco-Bac Baculovirus Expression System, Life technologies, «Invitrogen») или in vitro (Baculodirect Baculovirus Expression System, Life technologies, «Invitrogen») сделало бакуловирусную систему экспрессии крайне эффективным и удобным способом получения гетерологичных белков эукариот.
В подавляющем большинстве случаев продуцируемый белок проходит все стадии пост трансляционных модификаций (гликозилирование, протеолитическое расщепление, отщепление сигнальных последовательностей, фосфорилирование, ацетилирование, ацилирование, гамма- карбоксилирование, сульфатирование, миристилирование, пальмитоилирование, изопренилирование аминокислот), имеет правильную укладку полипептидной цепи, стабилизируемую дисульфидными связями; олигомерные белки имеют правильную четвертичную структуру. Высокий уровень продукции белка обеспечивается использованием сильного промотора гена полиэдрина, матриксного белка окклюзионных телец (полиэдров) вируса, продукция которого в клетках насекомого, инфицированного нативным вирусом составляет на поздних стадиях инфекции 25-30% от общего белка клетки (Белжеларская, 2000). Одновременное использование других поздних промоторов - белка pi 0 и р39 - обеспечивает возможность получения в клетке сразу нескольких рекомбинантных белков или нескольких субъединиц олигомерного белка. Кроме этого, протяженность генома бакуловируса AcNPV (130 т.п.о.) позволяет вводить в него вставки большого размера, в том числе, несплайсированные гены. В бакуловирусной системе экспрессии успешно получен ряд функционально активных цитохромов Р450 (Biagini & Ceiler, 1996; Chen, et al, 1997; Paine, et al, 1996; Wang, et al, 2005; Thompson, et al, 1998; Lee & Buhler, 2002; Lee, et al, 1995; Sigle, et al, 1994; Asseffa, et al, 1989; Ohta, et al, 1991; He, et al, 2004; Shimada, et al, 2001; Miyazawa, et al, 2003) с уровнем синтеза от 0.5 до 8-10% от общего количества белка. Более того, на основе микросомных преператов, полученных из клеток насекомых после ко-экспрессии генов микросомных цитохромов Р450 печени крысы, участвующих в метаболизме ксенобиотиков (CYP1A1, CYP1A2, CYP2A2, CYP2B1, CYP2C6, CYP2D1, CYP3A1, CYP3A2 и др ), и НАДФН-Р450-оксидоредуктазы, налажено производство тест-систем для фармакологических исследований (Supersomes, GenTest Corporation, США). Данных об экспрессии гена 21-гидроксилазы в бакуловирусных системах к настоящему моменту в литературе нет.
Используемые клеточные линии и бактериальные штаммы
В работе использовали кДНК CYP21A2, полученную из мРНК аденомы надпочечников, клонированную в векторе pBluescript II KS (+) («Stratagene», США). Для введения мутаций в заданные положения нуклеотидной последовательности кДНК CYP21A2 использовали мутагенные праймеры с одиночными заменами нуклеотидов и универсальные праймеры M13/pUC, представленные в таблице 4. Введение каждой мутации осуществлялось в два этапа. На первом этапе проводили две ПЦР-реакции, используя пары праймеров: прямой универсальный МІЗ/pUC - обратный мутагенный и прямой мутагенный -обратный универсальный МІЗ/pUC соответственно. В результате получали два ПЦР-продукта, соответствующих 3 - и 5 - концевым фрагментам кДНК CYP21A2 с заданными мутациями, перекрывающихся между собой на длину мутагенных праймеров. На втором этапе проводили рекомбинацию между 3 -и 5 - концевым фрагментам кДНК CYP21A2 с помощью ПЦР, используя прямой и обратный праймеры МІЗ/pUC. Реакции проводили в 50 мкл реакционной среды, содержащей Іхбуфер для Pfu-полимеразы («Fermentas», Литва), с добавлением 50нг ДНК-матрицы, 2 мМ MgS04, 0.2 мМ каждого из дезоксинуклеотидтрифосфатов, 25 пМ праймеров, 1.25 ед Pfu-полимеразы («Fermentas», Литва) и при следующем режиме 95С 3 мин; 95С 30 сек, 55-60С (в зависимости от температуры плавления олигонуклеотидов) 30 сек, 72С 0,5-1,5 мин (в зависимости от длины ожидаемого продукта) - 15-20 циклов. Для экспрессии в клетках COS-7 кДНК CYP21A2 дикого типа и с введенными мутациями клонировали в экспрессионном векторе pcDNA3.1(+) («Invitrogen», Germany) по сайтам рестрикции BamHI-XhoI. Введение мутаций и целостность вставок проверяли секвенированием конструктов. Клетки COS-7 культивировали в модифицированной среде Дульбекко (DMEM) («Biochrom AG», Германия) с добавлением 10% эмбриональной сыворотки теленка («Biochrom AG», Германия), 2мМ L-глутамина, 100мкг/мл стрептомицина и 100 ед/мл пенициллина («Sigma») при 37С во влажной атмосфере с 5% СОг. Трансфекцию клеток проводили в присутствии реагента Lipofectamin («Invitrogen», Германия).
Для этого 0.5 106 клеток, засеянных в лунку шестилуночного планшета, инкубировали 5 часов в среде DMEM, содержащей ДНК-липидные комплексы, образовавшиеся предварительно с использованием: 6 мкл реагента Lipofectamin, 1 мкг конструкта на основе вектора pcDNA3.1(+) («Invitrogen», Германия) и 1 мкг плазмиды pRL («Promega», Germany), несущей последовательность репортерного гена люциферазы Renilla для контроля эффективности трансфекции. 2.5. Анализ каталитической активности в клетках COS-7. Акивность CYP21A2 в клетках COS-7 проводили через 24 часа после трансфекции. Клетки инкубировали 90 мин при 37С в 500 мкл среды DMEM, содержащей 0.2 мкКи Н3-170НП или прогестерона, 2 мкмоль/л немеченого 170НП или прогестерона, 8 ммоль/л НАДФН. После инкубации стероиды экстрагировали метиленхлоридом и разделяли методом тонкослойной хроматографии в смеси хлороформ : ацетон (70:30), Радиоактивность измеряли с использованием сканнера Rita Star («Ray test», Germany). Активность люциферазы Renilla определяли в лизатах клеток согласно протоколу фирмы изготовителя («Promega», Германия). 2.6. Получение рекомбинантных бакул о вирусных векторов. При получении рекомбинантных бакуловирусов для экспрессии в клетках насекомых использовали плазмиду-донор pFastBacHTa и штамм E.coli DHlOBac для сайт-специфической транспозиции в геном бакуловируса AcNPV (Baco-Bac Baculovirus Expression Systems, Life Technologies,1993). Плазмидную ДНК pFastBacHTa предварительно модифицировали путем делеции участка 84 п.н., включающего ATG-6HisEV, по уникальным сайтам рестриктаз RsrII и Ncol (рис 16 А). Выступающий 5 -концевой фрагмент, образовавшийся в результате гидролиза ДНК рестриктазой Ncol достроили до тупого фрагментом Кленова ДНК полимеразы I Escherichia coli. Модифицированную описанным образом векторную ДНК pFastBacHTaA использовали для клонирования кДНК гена CYP21A2 дикого типа и мутантного варианта CYP21A2-C169R по сайтам BamHI и Xhol (рис 16 В, С). В результате получили рекомбинантные плазмиды pFastBacHTaA-CYP21A2 и pFastBacHTaA-C169R. Конструкции на основе вектора pFastBacHTaA использовали для получения рекомбинантных бакмид, содержащих последовательности кДНК CYP21A2 дикого типа и мутантного варианта C169R путем сайт-специфической транспозиции в геном бакуловируса AcNP Vв клетках Е.coli DH1 ОВас. 2.7. Получение рекомбинантных бакмид. Трансформацию клеток E.coli DHlOBac рекомбинантными плазмидными ДНК pFastBacHTaA - CYP21A2 и pFastBacHTaA -C169R проводили в соответствии с руководством (Baco-Bac Baculovirus Expression Systems, «Life Technologies», 2004).
Селекцию трансформантов проводили по бело-голубому окрашиванию колоний после инкубации на LB-arape, содержащем 50 мкг/мл канамицина, 7 мкг/мл гентамицина, 10 мкг/мл тетрациклина, 100 мкг/мл X-gal и 40 мкг/мл IPTG при 37С в течение 48 часов. Белые колонии переносили на свежий LB-arap, содержащий те же селективные компоненты, инкубировали в течение ночи и засевали в Выделение ДНК бакмид ( 136 т.п.о.) проводили согласно рекомендациям руководства (Baco-Bac Baculovirus Expression Systems, 1993). Рекомбинантные бакмидные ДНК анализировали методом ПЦР. Реакционная смесь обьемом 10 мкл содержала 1 буфер для Taq-полимеразы («Promega», США), с добавлением 2 мМ MgCb, 0.2 мМ каждого из дезоксинуклеотидтрифосфатов, 4 пМ праймеров, 0.5-1 мкг бакмидной ДНК, 2 ед Taq-полимеразы и при следующем режиме: 94 С 3 мин; 93 С 45 сек, 56С 45 сек, 72С 4 мин - 25 циклов. 2.8. Трансфскция клеток насекомых и получение рекомбинантных бакуловирусов. Клетки S/9 растили в среде SF900-II («Gibco», США), содержащей 10% фетальной сыворотки теленка («Sigma», Германия) при температуре 27С. Рекомбинантную бакмидную ДНК вводили в клетки насекомых Spodoptera frugiperda (SJ9) в присутствии реагента CellFECTIN («Invitrogen», Германия). Для этого 1-2х106 клеток SJ9 засевали в лунки шестилуночного планшета. После прикрепления клеток ко дну планшета, их инкубировали в 1 мл среды SF900-II, содержащей 6 мкл реагента CellFECTIN и 5 мкг ДНК бакмиды в течение 5 часов при 27С. После этого трансфекционную смесь отбирали и инкубировали клетки в течение 96-120 часов в среде SF900-II с добавлением 10% фетальной сыворотки теленка, 50 мкг/мл стрептомицина и 50 ед/мл пенициллина. Среду, содержащую вирусный сток первого поколения (Р1), отбирали и центрифугировали 10 минут при 700 g для осаждения клеток и клеточных обломков. Супернатант (вирусный сток Р1) отбирали, хранили +4С, защищенным от света и использовали для амплификации вируса. При амплификации рекомбинантных бакуловирусов bv-CYP21A2 и bv-CYP21A2-C169R 1x10 клеток S/9 инфицировали 2 мл вирусного стока PL Вирусный сток Р2 отбирали через 96 часов инкубации при 27С.
Экспрессия кДНК CYP21A2 и мутантного варианта C169R в клетках насекомых с использованием бакуловирусной системы
Для получения функционально-активной стероид 21-гидроксилазы, локализованной в мембране эндоплазматического ретикулума клеток насекомых, использовали бакуловирусный челночный вектор pFastBacHTaA, модифицированный путем делеции последовательности, кодирующей 6 остатков гистидина, надстраивающихся к N-концу рекомбинантного белка. На основе вектора pFastBacHTaA получены бакуловирусы bv-CYP21 А2 и bv-CYP21А2-С169R. Белки, выявленные с помощью вестерн-блотинга в лизатах и препаратах микросом инфицированных клеток насекомых, мигрировали при электрофорезе в 12%-ном денатурирующем ПААГ в виде полосы с молекулярной массой 55 кДа, что соответствует молекулярной массе CYP21A2 (рис. 20, 21, 22). Присутствие CYP21A2 дикого типа и CYP21A2-С169R во фракции микросом свидетельствует о встраивании рекомбинантных белков в мембраны эндоплазматической сети клеток насекомых. Уровень синтеза CYP21A2 зависит от длительности инфекции (24 - 96 часа) и множественности заражения клеток вирусом (0.1 - 8 БОЕ/кл). Оптимальные условия продукции CYP21A2 подбирали с учетом результатов иммуноблотинга. Количество синтезирующейся в клетках насекомых стероид-21-гидроксилазы значительно увеличивается на третий день после заражения клеток вирусом, что связано с использованием промотора позднего бакуловирусного гена полиэдрина (рис.20). В этот период клетки содержат максимальное количество спектрально- и функционально-активных форм практически всех полученных в бакуловирусной системе экспрессии цитохромов Р450 (Asseffa, et al, 1989; Lee, et al, 1995; Paine, et al, 1996; Chen, etal, 1997). Таким образом, для получения микросомных фракций и измерения функциональной активности 21-гидроксилазы синтез белков CYP21A2 и CYP21A2-C169R проводили в инфицированных клетках насекомых линии Ш5 при множественности инфекции 2 БОЕ/кл. в течение 72 часов в среде Sf900-II, содержащей 20% сыворотки теленка и 3 мкг/мл хлорида гемина. Добавление гемина в среду культивирования клеток насекомых важно для получения гемопротеинов, в том числе цитохромов Р450, ввиду недостаточной эффективности эндогенной гем-синтезирующей системы клеток насекомых (Asseffa, et al, 1989; Lee, et al, 1995).
Увеличение содержания сыворотки в среде позволяет избежать токсичного действия гемина на клетки. По нашим данным добавление гемина в концентрации 3 мкг/мл не снижало жизнеспособность клеток Sf9 и Ш5 (она составляла 97-98%). Уровень синтеза CYP21A2 в клетках Ш5 составил примерно 28% от суммарного микросомного белка (5 нмоль/мг микросомного белка). Для сравнения можно привести опубликованные данные об уровне продукции спектрально-активного CYP21A2 в клетках дрожжей - 0.076 нмоль/мг микросомного белка (Wu & Chung, 1991). Учитывая, что в клетках насекомых в форме спектрально- и функционально-активного гемопротеина находится от 50 до 90% синтезированного рекомбинантного Р450 (Asseffa, et al, 1989; Buters, et al, 1994), выход спектрально-активного CYP21A2 в полученной нами бакуловирусной системе экспрессии превышает уровень продукции сходных белков в клетках дрожжей по меньшей мере в 33 раза. Как следует из результатов иммуноблотинга (рис.23), CYP21A2-C169R синтезировался столь же эффективно и также встраивался в мембрану эндоплазматической сети, как и СYP21А2 дикого типа. Активность CYP21A2 и CYP21A2-C169R в клетках насекомых определяли по отношению к двум субстратам - 170НП и прогестерону. Известно, что содержание NADPH-P450-oKCHflopeflyicra3bi (CYPOR) в клетках насекомых недостаточно для поддержания активности рекомбинантных цитохромов Р450. По нашим данным микросомы из клеток Ш5 с высоким уровнем экспрессии гена CYP21A2 дикого типа обладают эндогенной активностью CYPOR, способной частично поддерживать активность рекомбинантного фермента. Активность по отношению к 170НП составила 10.45 ± 0.8 пмоль/(мг микросомного белка х мин), тогда как активность по отношению к прогестерону была ниже в 7.3 раза и составила 1.43 ± 1.05 пмоль/(мг белка х мин). У мутантного варианта С169R активность по отношению к обоим субстратам полностью отсутствовала. Наблюдаемые нами расхождения в активности рекомбинантного CYP21A2 дикого типа на прогестероне и 170НП, по-видимому, связаны с особенностями биосинтеза минерало- и глюкокортикоидных гормонов in vivo. В норме уровень секреции в коре надпочечников альдостерона, предшественником которого является прогестерон, в 100 - 1000 раз меньше по сравнению с уровнем секреции кортизола, в пути биосинтеза которого задействован 170НП (White, et al, 1992). Это согласуется и с ранее опубликованными результатами анализа кинетики реакций 21-гидроксилирования прогестерона и 170НП в клетках млекопитающих, инфицированных рекомбинантным вирусом осповакцины (Tusie-Luna, et al, 1990).
В этой системе каталитическая эффективность (Vmax/Км) рекомбинантной 21-гидроксилазы в реакции с прогестероном была в 5 раз ниже, чем в реакции с 170НП. Для компенсации недостатка CYPOR используются три подхода: 1) добавление очищенной НАДФН-Р450-оксидоредуктазы в реакционную смесь при измерении каталитической активности, 2) коэкспрессия генов цитохрома Р450 и НАДФН-Р450-оксидоредуктазы с помощью одного рекомбинантного бакуловируса или 3) заражение клеток одновременно двумя рекомбинантными бакуловирусами, обеспечивающими продукцию цитохрома Р450 и НАДФН-Р450-оксидоредуктазы (Lee, et al, 1995; Chen, et al, 1997). В представленной работе недостаток НАДФН-Р450-оксидоредуктазы в микросомах клеток насекомых компенсировали добавлением очищенной CYPOR кролика в среду измерения. Добавление НАДФН-Р450-оксидоредуктазы кролика к микросомным частицам из клеток Ш5, синтезирующих 21-гидроксилазу, в молярном соотношении CYP21A2: CYPOR, равном 1:1, приводило к увеличению эффективности превращения 17-ОНпрогестерона в 11-дезоксикортизол в 1.7 раза (рис. 24 а), тогда как превращение прогестерона в дезоксикортикостерон в этих условиях увеличивается в 5.3 раза (рис. 24 б). Данные по измерению каталитической активности CYP21A2 и мутантного варианта C169R в системе с добавлением НАДФН-Р450-оксидоредуктазы кролика приведены в таблице 6. Результаты свидетельствуют о практически полной инактивации активности мутантного белка по отношению к двум субстратам CYP21А2 - прогестерону и 170НП. Таким образом, данные по функциональной характеристике миссенс-мутации C169R 21-гидроксилазы в микросомной фракции инфицированной клеточной линии насекомых НІ5 свидетельствуют о полной инактивации фермента и согласуются с данными, полученными на клетках COS-7. Полученные нами результаты позволяют считать экспрессию в бакуловирусной системе удобным способом синтеза CYP21A2 с большим выходом, что очень важно для функционального анализа мутаций.
![Молекулярно-генетический анализ и функционально значимые генетические мутации вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней [Электронный ресурс]](/i/i/4361/178845.png "Молекулярно-генетический анализ и функционально значимые генетические мутации вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней [Электронный ресурс] Воробьева Ирина Валерьевна")
