Содержание к диссертации
Введение
Актуальность темы 4
Цель и задачи исследования 7
Научная новизна работы 9
Практическая значимость , 10
Основные положения, выносимые на защиту 11
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 14
1.1 Заболевание, вызываемое вирусом РРСС 15
1.2 Таксономическая характеристика вируса РРСС 19
1.3 Ультраструктура и морфогенез вируса РРСС
1.3.1 Репликация вируса in vivo и in vitro 20
1.3.2 Структура вириона вируса РРСС 1.4 Геномная организация вируса РРСС 24
1.5 Неструктурные белки вируса РРСС (белки репликативного комплекса)
1.5.1 Неструктурные белки, кодируемые ORFla 29
1.5.2 Неструктурные белки, кодируемые ORFlb 33
1.6 Основные структурные белки вируса РРСС 34
1.6.1 Нуклеокапсидный (N) белок 36
1.6.2 Основные оболочечные белки 1.6.2.1 М белок 38
1.6.2.2 Главный поверхностный гликопротеин (GP5) 39
1.6.3 Минорные структурные белки вируса РРСС 43
1.6.3.1 Гликопротеин GP2 43
1.6.3.2 Гликопротеин GP4 43
1.6.3.3 Гликопротеин GP3 45
1.7 Геномная изменчивость вируса РРСС 46
1.7.1 Геномная изменчивость неструктурных белков 49
1.7.2 Геномная изменчивость главных негликозилированных структурных белков 50
1.7.3 Геномная изменчивость главного оболочечного гликопротеина 52
1.7.4 Геномная изменчивость минорных вирусных гликопротеинов
1.8 Методы диагностики РРСС 54
1.9 Методы специфической профилактики РРСС 59
1.10 Применение методов обратной генетики для создания вирусов с новыми свойствами 64
1.11 Изучение микроэлементных профилей металлов для характеристики физиологического состояния биологической системы 69
1.12 Заключение по обзору литературы 79
2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 83
2.1. Материалы и методы исследований 83
2.2 Результаты... 108
2.2.1 Разработка методов диагностики РРСС 108
2.2.1.1 Исследование образцов, полученных из хозяйств России и Белоруссии, на наличие антител к вирусу РРСС с использованием коммерческого набора ИФА 109
2.2.1.2 Разработка тест-системы на основе ПЦР для определения РНК вируса РРСС 117
2.2.1.3 Исследование образцов, полученных из хозяйств России и Белоруссии, на наличие вируса РРСС методом ПЦР 125
2.2.1.4 Разработка тест-системы на основе ПЦР в реальном времени ("Realime PCR") для определения РНК вируса РРСС 133
2.2.1.5 Исследование генетической вариабельности белка нуклеокапсида с использованием филогенетического анализа,,. 136
2.2.1.6 Разработка тест-системы ИФА для определения антител к вирусу РРСС... 138
2.2.1.6.1 Получение рекомбинантного белка нуклеокапсида в прокариотической системе экспрессии 141
2.2.1.6.2 Получение рекомбинантного белка нуклеокапсида в бакуловирусной системе экспрессии 147
2.2.1.6.3 Сравнительный иммунохимический анализ рекомбинантных продуктов 150
2.2.2 Выявление и анализ геномных детерминант вирулентности вируса РРСС 166
2.2.2.1 Исследование вирулентности трех различных вариантов
штамма NADC8 вируса РРСС 167
2.2.2.2 Определение и сравнительный анализ первичной структуры геномов трех различных вариантов штамма NADC-8 вируса РРСС. Выявление потенциальных детерминант вирулентности. 168
2.2.3 Создание библиотеки полноразмерных инфекционных копий генома аттенуированного штамма вируса РРСС 177
2.2.3.1 Получение плазмидного вектора, содержащего сайты множественного клонирования для получения полноразмерного вирусного генома 178
2 Разработка стратегии сборки полноразмерной копии генома аттенуированного штамма вируса РРСС в E.coli под контролем промотора фага Т7 180
Получение инфекционного вируса РРСС на основе его рекомбинантного генома 186
1 Оптимизация процесса введения рекомбинантной геномной РНК вируса РРСС, полученной in vitro в клетки перевиваемых клеточных линий ВНК-21 HMARC-145 188
2 Характеристика библиотеки плазмид, содержащих полноразмерный геном к ДНК аттенуированного штамма вируса РРСС, вирусологическими методами 193
Проведение микроэлементного анализа клеточной культуры MARC-145 до и после инфицирования штаммами вируса РРСС различной вирулентности 199
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 205
ВЫВОДЫ И ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 241
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 244
ПРИЛОЖЕНИЯ 286
Введение к работе
Актуальность темы
Работа посвящена комплексному молекулярно-генетическому исследованию вируса, вызывающего репродуктивный и респираторный синдром свиней (РРСС).
РРСС - инфекционное заболевание, которое обнаружено 1987 г. в Северной Каролине, США (Keffaber 1989) и Канаде (Dea S. et al. 1990). РРСС называли также загадочной болезнью свиней (mystery swine disease). В настоящее время РРСС является эндемичным заболеванием во многих, если не во всех странах с промышленным свиноводством (Goyal S. М. 1993),. Практически все страны мира, включая Россию, США и страны Западной Европы, несут огромные экономические потери от этого респираторного и репродуктивного синдрома свиней.
Заболевание выражается множеством клинических проявлений, но двумя наиболее характерными являются патология органов дыхания и репродукции. Течение РРСС может сильно отличаться по проявлению признаков: от полного отсутствия клинической картины до выраженных признаков репродуктивных и респираторных нарушений. Респираторные расстройства, как правило, наиболее сильно выражены у поросят всех возрастов и проявляются в виде неспецифических лимфомононуклеарных пневмоний (Halbur P. G. et al. 1996b и др.). Нарушения репродуктивной функции наблюдаются, в основном, у ремонтных свинок и свиноматок, инфицированных во время супоросности (Christiansen W. Т. et al. 1993; Mengeling W. L. et al. 1994). При этом наблюдаются аборты, рождение мертвых или ослабленных поросят (Christianson W. Т. et al. 1992; Terpstra С. et al. 1991), иногда гибель свиноматок (Zimmerman J. J. et al. 1997a). Считают, что в неблагополучных хозяйствах РРСС способствует усилению других инфекционных заболеваний респираторного комплекса (Galina L. et al. 1994; Carvalho L. et al. 1995; Solano G. et al. 1995; Van Alstine W. G. et al. 1996).
Вирус PPCC относится к роду Arterivirus, семейству Arterividae, порядка Nidovirales (Cavanagh D. 1997). Предполагается, что вирус распространился из Канады в США. Происхождение вируса неизвестно. Различают два типа вируса РРСС: американский и европейский. Предполагают, что европейский и американский типы вируса имеют различные эволюционные истории, т.к. их геномы сильно различаются (Nelson Е. A. et al. 1993; Wensvoort G. et al. 1992).
Вирус PPCC проникает в клетки иммунной системы, главным образом, в макрофаги (Wensvoort G. et al. 1991; Voicu I. L. et al. 1994; Rossow K. D. et al. 1995; Rossow R. D. et al. 1996, Molitor T. W. et al. 1996). Быстрому распространению вируса способствует его длительная персистенция в организме зараженных животных (Benfield D. A. et al. 1997), его присутствие в сперме (Christopher-Hennings J. et al. 1995, Swenson S. L. et al. 1994), высокая контагиозность (Mengeling W. L. et al. 1998).
Из-за сходства клинических признаков PPCC с признаками заболеваний, вызываемых другими вирусными или бактериальными патогенами, для точной диагностики РРСС требуются специфические лабораторные методы. Серологические тесты включают иммуноферментный анализ, реакцию нейтрализации и непрямую реакцию иммунофлюоресценции (Yoon I. J. et al. 1992, Dea S. et al 2000, Witte S. B. et al. 2000). Вирус выявляют с использованием иммуногистохимического анализа, окрашивания при помощи флюоресцирующих антител, методом полимеразной цепной реакции и выделения вируса в культуре клеток (Paton D. L. et al. 1992, Suares P. et al. 1994, Christofer-Hennings J. et al 1995, Mengeling W. L. et al. 1995). Секвенирование генома вируса PPCC позволяет, с определенной степенью точности, определить родство между разными штаммами. Для установления в хозяйствах стабильной ситуации относительно репродуктивного и респираторного синдрома свиней используют как частичную депопуляцию стада, так и его полную замену (в странах Европы и Америки), а также вакцинацию. Для специфической профилактики РРСС используются, в основном, живые и инактивированные вакцины (Б. Г. Орлянкин и др. 2000). В настоящее время разрабатываются субъединичные и ДНК-вакцины, проводятся активные исследования иммунного ответа животных. Тем не менее, эффективность применения вакцин на практике в условиях широкого распространения и длительной персистенции полевых штаммов вируса РРСС достоверно не подтверждена. В настоящее время не существует вакцины, которая эффективно защищала бы животных от заболевания. Более того, использование живых вакцин часто приводит к заболеванию животных из-за реверсии вакцинного штамма вируса к дикому типу (Smedegaar G. et al. 1997).
Таким образом, несмотря на значительный прогресс в изучении вируса, РРСС остается загадочной болезнью и в настоящее время. Роль иммунного ответа в патогенезе РРСС недостаточно изучена. Известно, что при контакте с вирусом у свиней вырабатываются вирус-специфические антитела (Gorcyca D. Е. et al. 1995; Gorcyca D. E. et al. 1996; Hesse R. A. et al. 1996, Mengeling et al. 1996). Предполагается также, что в определенных условиях выработка антител может усиливать фагоцитоз (antibody dependent enhancement, ADE) и увеличивать репликацию вируса (Christianson W, Т et al. 1993; Yoon K.-J. et al. 1996). Эти данные косвенно свидетельствуют о значительных антигенных вариациях среди циркулирующих вирусов РРСС. Вирус-нейтрализующие антитела появляются поздно, через 3-4 недели после инфицирования (Yoon K-J et al. 1995, Loemba H. D. et al. 1996, Ostrowski M. et.al. 2002). Известно, что гуморальный иммунный ответ организма на присутствие вируса РРСС не обеспечивает эффективной защиты.
Очевидно, что для создания эффективных средств профилактики данного заболевания необходимы фундаментальные исследования. В частности, необходимо подробное молекулярно-генетическое исследование этого патогена, выявление генетических детерминант вирулентности вируса РРСС. Для разработки стратегии профилактики РРСС требуется комплексное изучение инфекционного процесса, включая выяснение особенностей патогенеза и также подробное молекулярное исследование вирусных изолятов, циркулирующих на территории России и пограничных с ней государств.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
Работа посвящена комплексному молекулярно-генетическому анализу вируса РРСС, в частности, выявлению функционально значимых генетических мутаций.
Целью работы было подробное молекулярно-генетическое исследование вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней и выявление детерминант вирулентности.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Провести исследование распространения вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней на территории России и Белоруссии.
2. Разработать комплекс средств лабораторной диагностики РРСС, основанных на выявлении вируса и антител к нему:
- Разработать тест-системы для выявления вируса РРСС с использованием ОТ-ПЦР и ГЩР в реальном времени на основе отечественных реагентов;
- Разработать набор реагентов для определения антител к вирусу РРСС на основе непрямого ИФА с использованием рекомбинантных антигенов, полученных из отечественных изолятов вируса РРСС.
3. Провести широкие производственные испытания разработанных отечественных тест-систем для выявления вируса РРСС и специфических антител.
4. Провести подробные молекулярные исследования полевых изолятов, циркулирующих на территории России и Белоруссии, методом прямого секвенирования и филогенетического анализа гена, кодирующего белок нуклеокапсида вируса РРСС.
5. Провести сравнение in vivo свойств трех различных вариантов североамериканского штамма вируса РРСС NADC8: вирулентного штамма NADC8-2, аттенуированного варианта, полученного после 251 пассажа в культуре клеток - NADC8-251, а также промежуточного варианта, выделенного от свиньи после частичной реверсии аттенуированного вируса NADC8-252P.
6. Определить полную первичную структуру геномов у трех штаммов вируса РРСС: вирулентного штамма NADC8-2, его аттенуированного мутанта, полученного пассированием в культуре клеток (NADC8-251), а также частично ревертировавшего вируса (NADC8-252P).
7. Провести сравнительный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей вирулентного штамма NADC8-2, аттенуированного штамма NADC8-251 и частично ревертировавшего NADC8-252P и на основе проведенного анализа определить функционально значимые участки генома, потенциально ответственные за аттенуацию вируса, а также молекулярные детерминанты, связанные со свойствами вирулентности.
8. Разработать стратегию и осуществить конструирование системы обратной генетики для внесения целенаправленных генетических изменений в РНК-геном вирусов РРСС, основанной на библиотеке полноразмерных инфекционных копий генома аттенуированного штамма NADC8-251.
9. Получить рекомбинантные вирусы путем трансфекции перевиваемой культуры клеток in vitro, охарактеризовать их вирусологическими методами. Подтвердить генно-инженерное происхождение вируса определением первичной структуры его генома. Научная новизна работы
До начала комплексных исследований (1997-1998 г.г.) не было сведений о распространении вируса РРСС на территории Российской Федерации и пограничных с ней государств. В рамках данной работы было проведено обследование свиноводческих хозяйств России и Белоруссии на наличие антител против вируса РРСС. Впервые было установлено широкое распространение вируса на территории этих государств. Проведен подробный молекулярный анализ первичной структуры геномов полевых изолятов вируса РРСС, выделенных на территории Российской Федерации и Белоруссии. Это позволило нам оценить степень вариабельности геномов вирусов, циркулирующих на данной территории, и разработать средства лабораторной диагностики РРСС. Были созданы и утверждены отечественные тест-системы для проведения комплексной лабораторной диагностики РРСС, основанные на выявлении компонентов вируса и антител к нему. Отечественных тест-систем до этого разработано не было.
Впервые были подробно исследованы молекулярные основы вирулентности и аттенуации вируса РРСС. На основании исследования полной первичной структуры геномов трех вариантов вируса РРСС: вирулентного штамма NADC8-2, аттенуированного варианта NADC8-251 и его ревертанта, образовавшегося в результате одного пассажа в организме свиньи NADC8-252P, обнаружены участки генома, которые могут играть роль в приобретении вирулентности вирусом РРСС. Впервые найдены генетические детерминанты вирулентности вируса РРСС.
Впервые создана библиотека полноразмерных инфекционных копий генома вируса РРСС, состоящая из 32 плазмид, для изучения фундаментальных генетических характеристик представителей рода Arterivirus методами обратной генетики. Полноразмерные копии генома аттенуированного штамма NADC8-251 вируса РРСС собраны и клонированы в E.coli. На основе полученных генноинженерных конструкций синтезированы РНК-геномы и получены рекомбинантные инфекционные вирусы с минимальными различиями в первичной структуре генома по сравнению с родительским штаммом NADC8-25L Создание библиотеки, а не единичной инфекционной копии вируса РРСС, позволило успешно преодолеть трудности, связанные с нестабильностью генома вируса РРСС. Таким образом, создана система обратной генетики, позволяющая проводить генетические манипуляции с вирусным РНК-геномом, что ранее было невозможно.
Впервые проведены исследования микроэлементного состава клеток MARC-145, инфицированных и не инфицированных вирусом РРСС, для определения воздействия вируса на биологическую систему. Определены специфические изменения микроэлементного профиля биологической системы.
Практическая значимость
Итогом проведенных исследований была разработка полного комплекса методов лабораторной диагностики РРСС на основе отечественных реагентов. Разработаны тест-системы для определения РНК вируса РРСС методами ПЦР и ПЦР в реальном времени. Разработан также набор реагентов для определения антител к вирусу РРСС методом ИФА. Тест-системы успешно прошли лабораторные испытания. Тест-система для определения РНК вируса РРСС методом ПЦР и набор реагентов для определения антител к вирусу РРСС методом ИФА получили все необходимые сертификационные документы и прошли широкомасштабные производственные испытания. Результаты испытаний позволяют рекомендовать разработанные тест-системы для использования в хозяйствах Российской Федерации и пограничных с ней государств. Тест-система для определения вируса РРСС методом ПЦР в реальном времени в настоящее время проходит комиссионные испытания. Полученные результаты позволяют надеяться на то, что данная тест-система будет использоваться для широкого мониторинга хозяйств на наличие вируса РРСС.
Наличие инфекционных копий вируса РРСС, полученных на основе библиотеки полноразмерных геномов, позволит вносить генетические изменения в вирусный РНК-геном и получать вирусы с новыми свойствами.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Подтверждение распространения вируса РРСС на территории России и Белоруссии, определением антител к вирусу на основе серологического анализа сывороток крови свиней.
2. Создание и характеристика комплекса новых средств лабораторной диагностики РРСС на основе отечественных реагентов: тест-систем для выявления вируса РРСС с использованием ОТ-ПЦР и ГГЦР в реальном времени и набора реагентов для определения антител к вирусу РРСС на основе непрямого ИФА с использованием рекомбинантных антигенов.
3. Доказательство эффективности разработанных тест-систем для выявления вируса РРСС и антител к нему, полученных на основе отечественных реагентов в ходе масштабных производственных испытаний.
4. Оценка генетического разнообразия и генотипирование полевых изолятов вируса, циркулирующих на территории России и Белоруссии, и их филогенетический анализ.
5. Экспериментальное подтверждение степени вирулентности или аттенуации трех вариантов полевого изолята NADC8: высоковирулентного NADC8-2, аттенуированного вируса NADC8-251, а также вируса-ревертанта - NADC8-252P.
6. Сравнительный анализ трех полноразмерных геномов, включающий анализ генов вирусных белков и регуляторных последовательностей вирусов NADC8-2, NADC8-251 и NADC8-252P. Выявление потенциальных молекулярных детерминант, связанных со свойствами вирулентности вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней.
7. Создание библиотеки полноразмерных инфекционных копий генома аттенуированного штамма NADC8-251 для исследования функциональных участков вирусного генома методами обратной генетики.
8. Характеристика библиотеки инфекционных копий генома вируса РРСС и отбор рекомбинантного вируса РРСС со свойствами, приближенными к родительскому штамму NADCS-251.
Апробация результатов исследования
Материалы исследования доложены на заседаниях Ученого Совета ГУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского, Научно-технического совета НПО НАРВАК, на Международной научно-практической конференции РУДН, Москва, 2004 г., на 7-м международном симпозиуме по исследованию положительно-цепочечных РНК-содержащих вирусов, Сан-Франциско, США, 2004 г., на Всероссийском совещании-семинаре директоров ветеринарных лабораторий субъектов РФ, Брянск, 2004, на 82-й и 84-й конференциях по болезням животных (CRWAD), Сент-Луис и Чикаго, США, 2001 г. и 2003 г., на конференции ВНИИЖЗ, Владимир, 2003 г., на Международной научно-практической конференции по болезням животных, Покров, 2003 г., на 17-м международном конгрессе ветеринарных вирусологов, Эймс, Айова, США, 2002 г., на 20-й конференции Американского общества вирусологии, Мэдисон, Висконсин, США, 2001 г., на XVI Менделеевском съезде по общей и прикладной химии в Москве, 1998 г., на Симпозиуме МЭБ (OIE), Бирмингем, Великобритания, 1998 г., на международной конференции АТВ 92, Милан, Италия, 1992 г. Благодарности
Автор приносит глубокую благодарность научному консультанту д.б.н. Е. А. Непоклонову, д.б.н. Т. И. Алиперу, д.б.н. А. Д. Забережному, проф. Б. Г. Орлянкину, заслуженному деятелю науки РСФСР, проф. В. С. Сергееву, д.б.н. Сыроешкину, проф. В. Менгелингу и д-ру К. Лагеру (NADC, Ames, USA) за разностороннюю научно-методическую помощь в работе. Автор приносит глубокую благодарность к.б.н. М. И. Мусиенко, к.б.н. В. В. Цибезову, В. С. Богдановой, В. В. Грабовецкому, О. В. Елисеевой, Н. И. Потаповой, А. В. Байбак, к.б.н. А. Н. Власовой и к.б.н. К. П. Алексееву, совместно с которыми были выполнены отдельные фрагменты представленной работы.
![Молекулярно-генетический анализ и функционально значимые генетические мутации вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней [Электронный ресурс]](/i/i/4361/178845.png "Молекулярно-генетический анализ и функционально значимые генетические мутации вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней [Электронный ресурс] Воробьева Ирина Валерьевна")
