Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы 11
Раздел 1.1 Таргетная терапия 11
1.1.1 Ингибиторы рецептора эпидермального фактора роста в противоопухолевой терапии 11
1.1.2 Ингибиторы других участников EGFR-зависимого сигнального каскада... 13
Раздел 1.2 Структурно-функциональная характеристика участников EGFR зависимого сигнального каскада 14
1.2.1 Рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) 14
1.2.1.1 Структурно-функциональная характеристика гена EGFR 14
1.2.1.2 Структурно-функциональная характеристика белка EGFR 15
1.2.1.3 Клинически значимые мутации в reneEGFR 20
1.2.2 Малая сигнальная ГТФ-аза (KRAS) 23
1.2.2.1 Структурно-функциональная характеристика гепа, KRAS 23
1.2.2.2 Структурно-функциональная характеристика белка KRAS 24
1.2.2.3 Клинически значимые мутации в геие KRAS 27
1.2.3 Фосфоинозитид-3-киназа, каталитическая субъединица (PIK3CA) 29
1.2.3.1 Структурно-функциональная характеристика гена PIK3CA 29
1.2.3.2 Структурно-функциональная характеристика белка PIK3CA 30
1.2.3.3 Клинически значимые мутации в гене PIK3CA 32
1.2.4 Серин/треонин протеинкиназа (BRAF) 34
1.2 А А Структурно-функциональная характеристика гена BRAF 34
1.2.4.2 Структурно-функциональная характеристика белка BRAF 35
1.2.4.3 Клинически значимые мутации в reneBRAF 37
1.2.5 Распространенность мутаций в генах EGFR, KRAF, PIK3CA и BRAF в опухолях человека различной локализации 40
Раздел 1.3 Молекулярно-генетические методы диагностики соматических мутаций... 41
Раздел 1.4 Биологические микрочипы и их применение 47
ГЛАВА 2 Материалы и методы 51
2.1 Клинический материал 52
2.2 Экстракция ДНК 2.2.1 Экстракция ДНК из ткани, фиксированной в парафиновых блоках 55
2.2.2 Экстракция ДНК из свежезамороженной ткани 55
2.3 Конструирование и синтез олигонуклеотидов 55
2.3.1 Конструирование и синтез праймеров 55
2.3.2 Конструирование и синтез LNA-олигонуклеотидов 55
2.3.3 Конструирование и синтез зондов для иммобилизации на биочипах 56 2.4 Изготовление биологических микрочипов 56
2.5 Сайт-направленный мутагенез
2.5.1 Двухэтапный сайт-направленный мутагенез 57
2.5.2 Одноэтапный сайт-направленный мутагенез
2.6 Полимеразная цепная реакция (ПОР) 58
2.7 Гибридизация меченого продукта на биочипе 58
2.8 Регистрация изображения и анализ результатов гибридизации 59
2.9 Электрофоретическое разделение продуктов амплификации в агарозном геле 60
2.10 Секвенирование 60
2.11 Статистический анализ 60
2.12 Другие методы определения мутаций
2.12.1 Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ)... 61
2.12.2 Секвенирование с предварительным обогащением образца мутантной ДНК 61
2.12.3 Аллель-специфичная ПЦР в реальном времени 61
ГЛАВА 3 Результаты и обсуждение 62
Раздел 3.1 Разработка метода анализа соматических мутаций на основе биологических микрочипов 62
3.1.1 Конструирование системы амплификации для анализа целевых последовательностей генов 64
3.1.1.1 Разработка системы праймеров для проведения двухэтапной мультиплексной ПЦР 64
3.1.1.2 Конструирование LNA-олигонуклеотидов и выбор их оптимальной концентрации в ПЦР-смеси 65
3.1.1.3 Создание контрольных ДНК-матриц, содержащих мутации в генах EGFR, KRAS, BRAF и PIK3CA 68
3.1.2 Разработка олигонуклеотидных микрочипов 70
3.1.2.1 Конструирование олигонуклеотидных зондов для иммобилизации на микрочипах 70
3.1.2.2 Конструирование специализированных биочипов
3.1.2.2.1 Анализ мутаций в reneEGFR 73
3.1.2.2.2 Анализ мутаций в геие KRAS 75
3.1.2.2.3 Анализ мутаций в генах.PIK3CA nBRAF 77
ЗА.2.2 А Биочип для анализа мутаций в генах EGFR, KRAS, PIK3CA и BRAF 78
3.1.3 Определение аналитической чувствительности метода 80
Раздел 3.2 Генотипирование клинических образцов 81
3.2.1 Генотипирование образцов опухолей поджелудочной железы 81
3.2.1.1 Анализ мутаций в геие KRAS с помощью биочипов 81
3.2.1.2 Выявление ассоциаций между наличием мутаций в гене KRAS и клинико анамнестическими характеристиками пациентов с опухолями ПЖ 82
3.2.1.3 Верификация результатов генотипирования образцов опухолей ПЖ на наличие мутаций в геие KRAS 82
3.2.2 Генотипирование образцов колоректального рака 83
3.2.2.1 Анализ мутаций в генах KRAS, BRAF и PIK3CA с помощью биочипов 83
3.2.2.2 Выявление ассоциаций между молекулярно-генетическим статусом опухоли и клинико-анамнестическими характеристиками больных КРР 84
3.2.2.3 Верификация результатов генотипирования образцов КРР на наличие мутаций в геие KRAS 88
3.2.3 Генотипирование образцов меланомы 89
3.2.3.1 Анализ мутаций в генах.PIK3CA nBRAF 89
3.2.3.2 Выявление ассоциаций между молекулярно-генетическим статусом опухоли и клинико-анамнестическими характеристиками больных меланомой 92
3.2.3.3 Верификация результатов генотипирования образцов меланомы на наличие мутации V600E в гене BRAF 95
3.2.4 Генотипирование образцов НМРЛ 95
3.2.4.1 Анализ мутаций в образцах НМРЛ с помощью биочипов 95
3.2.4.1.1 Анализ свежезамороженных опухолевых биопсий НМРЛ на наличие мутаций в генах EGFR, KRAS, PIK3CA и BRAF 97
3.2.4.1.2 Анализ фиксированных в парафиновых блоках образцов НМРЛ на наличие мутаций в генах EGFR и KRAS 3.2.4.2 Выявление ассоциаций между молекулярно-генетическим статусом опухоли и клинико-анамнестическими характеристиками больных НМРЛ.. 98
3.2.4.3 Верификация результатов генотипирования образцов НМРЛ на наличие мутации в генах EGFR, KRAS, PIK3CA и BRAF 102
3.2.5 Различие в спектре мутаций в гене KRAS в опухолях различной локализации 105
Заключение 106
Выводы 107
Список работ, опубликованных по теме диссертации 108
Список литературы
- Структурно-функциональная характеристика гена EGFR
- Распространенность мутаций в генах EGFR, KRAF, PIK3CA и BRAF в опухолях человека различной локализации
- Гибридизация меченого продукта на биочипе
- Создание контрольных ДНК-матриц, содержащих мутации в генах EGFR, KRAS, BRAF и PIK3CA
Структурно-функциональная характеристика гена EGFR
С течением времени стали активно разрабатываться ингибиторы других участников EGFR-зависимого сигнального каскада. К ним можно отнести специфические ингибиторы мутантного белка BRAF, который представляет собой серин/треонин протеинкиназу (King et al, 2006; Tsai et ah, 2008; Roskoski, 2010). В настоящее время на лекарственном рынке доступно 2 таргетных ингибитора BRAF - вемурафениб (Plexxikon; Зелбораф; RG7204, Roche Pharmaceuticals) и дабрафениб (Тафинлар, GlaxoSmithKline, LLC), которые были одобрены Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов США (FDA) для лечения метастатической и/или неоперабельной меланомы в 2011 и 2013 гг., соответственно (Jefferson, 2011; Drug Approvals and Databases, 2013a). В мае 2013 г. FDA одобрило применение для лечения метастатической и неоперабельной меланомы еще одного таргетного препарата - траметиниба (Мекинист, GlaxoSmithKline, LLC) - ингибитора МЕК1/2 (киназа митоген-активирующей протеин киназы), который является непосредственным эффектором BRAF (Drug Approvals and Databases, 2013b). Вышеперечисленные таргетные ингибиторы имеют ограничения по использованию. Они могут применяться только для лечения пациентов, опухоли которых несут определенные мутации в гене BRAF (Jefferson, 2011; Drug Approvals and Databases, 2013a; Drug Approvals and Databases, 2013b).
После серии клинических испытаний было установлено, что таргетные препараты эффективны в лечении далеко не всех пациентов. Результат напрямую зависел от генотипа опухоли больного. Для анти-EGFR препаратов критичными оказались мутации как в самом EGFR, как и в ряде его эффекторов, включая KRAS, BRAF и PIK3CA. Некоторые из мутаций были ассоциированы с чувствительностью опухоли к терапии таргетными препаратами, другие, наоборот, вызывали резистентность. Было выяснено, что для эффективного лечения пациентов необходима их предварительная селекция по молекулярно-генетическому статусу опухоли. Ниже приводится подробное описание как белков-мишеней таргетной терапии, так и других белков-участников EGFR-зависимого сигнального каскада, мутации в которых имеют важное клиническое значение при лечении таргетными препаратами.
Ген EGFR кодирует рецептор эпидермального фактора роста. Он локализован в коротком плече седьмой хромосомы (7р14-р12) (Wang et al., 1993). Ген имеет общую протяженность около 200 kb и состоит из 28 экзонов, причем первый интрон имеет протяженность 123 kb (Reiter et al., 2001). Для данного гена свойственен альтернативный сплайсинг. Основной белковый продукт (изоформа А) кодируется двумя транскриптами 10,5 kb и 5,8 kb (Ishii et al., 1985). Кроме этих двух транскриптов, кодирующих полноразмерную изоформу EGFR, существует три альтернативных транскрипта 1,8 kb, 2,4 kb и 3,0 kb, кодирующих изоформы С, В и D, соответственно (рис. 2) (Reiter & Maihle, 1996; Reiter et al., 2001).
Структура основных изоформ EGFR. На изоформе А показаны домены, экзоны и нумерация аминокислот (Albitar et al, 2010). Транскрипт 1,8 kb (изоформа С) образуется в результате использования при транскрипции альтернативного сайта полиаденилирования, находящегося в 10 интроне. Изоформа С представляет собой белок размером 60/80Ша, содержащий только субдомены I, II и половину субдомена III внеклеточного домена EGFR (Albitar et al., 2010; Reiter & Maihle, 1996). Транскрипты размером 2,4 kb (изоформа В) и 3,0 kb (изоформа D), образуются в результате включения альтернативных экзонов 15А или 15В. Экзон 15А кодирует С-терминальный Ser, а экзон 15В - альтернативную С-концевую последовательность из 78 аминокислот (а.к.). В настоящее время изоформа В изучена недостаточно хорошо. Про изоформу D известно, что она образует белок размером 705 а.к. и массой 90/110 Ша (Reiter et al., 2001; Albitar et al., 2010). Она имеет все четыре субдомена лиганд-связывающего внеклеточного домена и не имеет трансмембранного и внутриклеточного доменов. В отличие от полноразмерного транскрипта, экспрессирующегося во всех тканях, изоформа D была обнаружена только в плаценте и культуре клеток карциномы, содержащей амплифицированный ген EGFR (Reiter et al., 2001).
EGFR (ErbBl) представляет собой белок размером 1210 а.к. и массой 170 Ша (изоформа A) (Carpenter, 1983; Ullrich et al., 1984; Reiter et al., 2001). Он является одним из четырех членов семейства ErbB (или HER) рецепторных тирозинкиназ (Yarden & Sliwkowski, 2001). Это семейство также включает белки ErbB2 (HER2/Neu), ЕгЬВЗ (HER3) и ErbB4 (HER4) (Garrett etal, 2002).
Молекула EGFR, как и молекулы всех рецепторных тирозинкиназ, состоит из 3-х основных доменов: внеклеточного N-концевого гликолизированного лиганд-связывающего участка, составляющего около 50% всей молекулы (621а. к.) и обеспечивающего специфичность восприятия сигнала, собственно трансмембранного ос-спирального участка, состоящего всего из 23 гидрофобных аминокислот, и внутриклеточного домена (542 а.к.) (рис. 2) (Gullick et al., 1985). Во внеклеточном домене выделяют четыре субдомена: два лиганд-связывающих (субдомены I и III) и два стабилизирующих цистеин-богатых региона (субдомены II и IV) (Reiter et al., 2001). Во внутриклеточной части рецептора выделяют тирозинкиназный и аутофосфорилируемый С-концевой домены (Albitar et al., 2010).
Распространенность мутаций в генах EGFR, KRAF, PIK3CA и BRAF в опухолях человека различной локализации
На первом этапе создается библиотека целевых ДНК-фрагментов (рис. 17). Библиотека может содержать фрагменты различных участков генома для нескольких образцов ДНК. Для получения библиотеки используют специальные праймеры, имеющие участок, комплементарный целевой последовательности гена, четырехнуклеотидный «ключ», уникальный для каждого анализируемого образца» и адаптерный участок. На следующем этапе все амплифицированные фрагменты ДНК смешивают и пришивают за адаптерную часть к специальным шарикам, причем количество шариков рассчитывают таким образом, чтобы с одним шариком связывалась одна молекула ДНК. Готовят масляную эмульсию, позволяющую обособить каплю воды вокруг каждого шарика, и проводят эмульсионную ПЦР. В результате, вокруг каждого из шариков образуется множество одинаковых молекул ДНК. На следующем этапе проводят определение первичной нуклеотидной последовательности пришитых к шарикам фрагментов. Шарики загружают в специальную пластину, содержащую 300 000 ячеек. Размер ячейки подобран таким образом, что в нее может поместиться только один шарик, поэтому при обработке результатов анализа исследователь может получить последовательности индивидуальных молекул ДНК. Анализ проводят методом пиросеквенирования на высокопроизводительных секвенаторах (Roche, 2010).
Данная методика с успехом может быть использована для выявления соматических мутаций при содержании мутантной ДНК 1% в образце (Roche, 2010). Однако, так как для проведения данного анализа требуются большие временные и материальные затраты, данный метод пока не получил широкого распространения в рутинной клинической практике. 4. Анализ конформации одноцепочечных фрагментов ДНК (Single-strand conformation polymorphism, SSCP)
Данный метод основан на регистрации различий в электрофоретической подвижности однонитевых фрагментов ДНК. Участок ДНК амплифицируют, денатурируют и анализируют его однонитевую структуру с помощью электрофореза. Так как изменения последовательности фрагмента ДНК даже в один нуклеотид влияет на его конформацию, и как следствие на его электрофоретическую подвижность, становится возможным дифференцировать молекулы ДНК с мутациями (Hayashi, 1992).
Данный метод достаточно дешев, но дает лишь косвенную информацию о нуклеотидной последовательности анализируемого фрагмента, не позволяет точно определить тип мутации и характеризуется невысокой аналитической чувствительностью.
При амплификации используются аллель-специфичные праймеры, 3 -конец которых комплементарен вариабельному нуклеотиду в анализируемом фрагменте ДНК. В классическом варианте данного метода для детекции однонуклеотиднои замены проводят ПЦР в двух параллельных реакциях. В первую пробирку добавляют пару праймеров, специфичных к последовательности «дикого типа», во вторую - специфичных к мутантной последовательности. По наличию/отсутствию ПЦР-продукта делают вывод о генотипе анализируемого образца. Для визуализации продуктов амплификации ранее активно применялся электрофорез в агарозном геле (Newton et ah, 1989). С развитием технологий амплификаторов стало возможно проводить ПЦР в реальном времени (РВ-ПЦР) с использованием интеркалирующих красителей. При максимальной оптимизации условий ПЦР возможно выявление 1% мутантной ДНК на фоне ДНК «дикого типа» (Lang et al., 2011). К достоинствам данного метода также можно отнести невысокую стоимость расходных материалов, к недостаткам - необходимость постановки параллельных реакций по количеству анализируемых мутаций.
Существует несколько вариантов флуоресцентных зондов, используемых в РВ-ПЦР. Рассмотрим наиболее распространенные из них. Зонды TaqMan имеют длину 20-30 нуклеотидов, их подбирают таким образом, чтобы они комплементарно связывались только с мутантной последовательностью гена. На 5 -конце зонд имеет флуоресцентный краситель, а на 3 - тушитель. В процессе удлинения праймеров, когда Taq-полимераза доходит до зонда, она благодаря своей 5 -3 -экзонуклеазной активности отщепляет от зонда флуоресцентный краситель, и он начинает светиться. Так как в растворе флуоресценция зонда блокируется его тушителем, по наличию флуоресцентного сигнала можно судить о том, что анализируемый образец содержит мутацию (Lie & Petropoulos, 1998).
Существует еще одна группа зондов - гибридизационные зонды. Такие зонды подбираются в паре. Один из них содержит донорный флуорофор, второй -акцепторный. Если амплифицируемая последовательность соответствует структуре зондов, они одновременно связывается с ней. В результате, донор и акцептор располагаются рядом в пространстве (встык), и становится возможным их стереохимическое взаимодействие. При возбуждении донора одной длиной волны он передает сигнал на акцептор и тот излучает флуоресцентный сигнал в определенном спектре. По наличию/отсутствию свечения можно сделать вывод о генотипе анализируемого образца (Haugland, 2002).
Использование флуоресцентных зондов удорожает метод, но позволяет производить детекцию нескольких вариантов мутаций в одной пробирке. 7. ПЦР с использованием блокирующих зондов
В ПЦР-смесь добавляется зонд, избирательно связывающийся с целевой последовательностью «дикого типа», препятствуя ее амплификации (рис. 18). В результате, преимущественно увеличивается копийность мутантной последовательности гена. По наличию ПЦР-продукта можно судить о наличии мутации в анализируемом образце. ПЦР с использованием блокирующих зондов выгодно проводить в режиме реального времени. Данная методика обладает довольно высокой аналитической чувствительностью и позволяет детектировать мутантные последовательности при значительном количественном преимуществе последовательностей «дикого типа» (Nagai et al, 2005; Beranek et al, 2006).
Гибридизация меченого продукта на биочипе
ASCO и RUSSCO рекомендуют проводить анализ молекулярно-генетического статуса гена KRAS у больных КРР при назначении терапии цетуксимабом и панитумумабом, поскольку наличие мутаций в данном гене обуславливает устойчивость опухоли к данным таргетным препаратам.
При конструировании биочипа в анализ, помимо самых распространенных мутаций в ко донах 12 и 13, были включены две мутации в кодоне 61 гена KRAS. На рисунке 26 приведена схема иммобилизации олигонуклеотидных зондов для анализа 13 наиболее часто встречающихся клинически значимых мутаций в гене KRAS.
Схема расположения олигонуклеотидных зондов на биочипе для анализа мутаций в гене KRAS. В верхнем ряду иммобилизованы олигонуклеотиды, комплементарные анализируемым последовательностям «дикого типа» (Wt). Ниже расположены ячейки, содержащие зонды, комплементарные последовательностям, несущим мутации. Обозначение ячеек соответствует однобуквенной аббревиатуре аминокислот.
На рисунке 27 представлены гибридизационные картины (слева) и гистограммы нормированных сигналов флуоресценции по каждой группе ячеек (справа), полученные при анализе образца, не содержащего искомых мутаций (27А) и образца, несущего мутацию G12V (27Б). Отношение рассматриваемых сигналов JMJJWT ДЛЯ кодона 12 гена KRAS (рис. 27Б) составило 8,3, что свидетельствует о наличии мутации G12V в анализируемом образце.
Гибридизационные картины (слева) и гистограммы нормированных сигналов флуоресценции ячеек (справа), полученные при анализе образца, не содержащего исследуемых мутаций в гене KRAS (А) и образца, несущего мутацию G12V (Б). 3.1.2.2.3 Анализ мутаций в генах PIK3CA и BRAF FDA рекомендует использование вемурафениба, дабрафениба и траметиниба только для лечения больных меланомой, несущих мутацию в 600 кодоне гена BRAF. Согласно литературным данным, наличие мутации V600E в гене BRAF обуславливает невосприимчивость к анти-EGFR терапии при лечении КРР, поэтому больным КРР с «диким типом» гена KRAS также рекомендуется проведение теста на выявление мутации V600E.
Ряд исследований свидетельствует, что мутации в гене PIK3CA ассоциированы с резистентностью к анти-EGFR терапии. Поэтому для анализа с помощью биочипа были выбраны наиболее часто встречающиеся и при этом имеющие предиктивное значение мутации: Е542К, Е545К, Q546K, H1047L, H1047R в геие PIK3CA и V600E в гене BRAF. На рис. 28А представлена схема локализации олигонуклеотидных зондов на биочипе. В верхнем ряду иммобилизованы олигонуклеотиды для анализируемых последовательностей «дикого типа». Различные мутантные варианты тех же самых последовательностей иммобилизованы в ячейках, расположенных ниже. В качестве примера гибридизационных картин (слева) и гистограмм нормализованных сигналов флуоресценции (справа) представлены результаты анализа образца, не содержащего исследуемых мутаций (рис. 28Б) и образца, содержащего мутации Е542К в гене PIK3CA и V600E в гене BRAF (рис. 28В). Отношение рассматриваемых сигналов JMUJJWT ДЛЯ кодона 542 гена PIK3CA и JMJJWT ДЛЯ кодона 600 гена BRAF (рис. 28В) составило 6,1 и 7,6, соответственно, что свидетельствует о наличии мутаций Е542К PIK3CA и V600E BRAF в анализируемом образце. PIK3CA BRAF кодон542 кодон545 кодон546 кодон1047 кодонбОО
Схема расположения олигонуклеотидных зондов на биочипе для анализа мутаций в генах РІКЗСА и BRAF (А). Гибридизационные картины (слева) и гистограммы нормализованных сигналов флуоресценции ячеек (справа), полученные при анализе образца, не содержащего исследуемых мутаций (Б) и образца, несущего мутации Е542К в гене РІКЗСА и
Биочип для анализа мутаций в генах EGFR, KRAS, РІКЗСА и BRAF Выше были представлены три различных схемы нанесения олигонуклеотидных зондов для анализа соматических мутаций в генах EGFR, KRAS, РІКЗСА и BRAF.
В ряде случаев возникает необходимость одновременного анализа всех четырех генов, например, при молекулярно-генетическом анализе пациентов с НМРЛ. Для решения этой задачи олигонуклеотиды, соответствующие описанным схемам, без внесения принципиальных изменений могут быть объединены на единой подложке (рис. 29).
Было определено минимальное процентное содержание мутантной ДНК в образце на фоне ДНК «дикого типа», которое может быть выявлено с помощью разработанной методики. Для этого ДНК, содержащая различные мутации (EGFR E746-A750del, G719S, Т790М, L858R; KRAS G12V, Q61H; РІКЗСА Е542К, Е545К, H1047R; BRAF V600E), была смешана с ДНК «дикого типа» в различных пропорциях (10%, 5%, 2%, 1%, 0,5% и 0,2% Mut ДНК на фоне WT ДНК) и проанализирована с использованием биочипов.
Определение порогового содержания мутации G12V гена KRAS на фоне ДНК «дикого типа» в серии разведений: 10%, 5%, 2%, 1%, 0,5% и 0,2%. Фрагмент биочипа (слева) и нормализованные сигналы флуоресценции (справа), соответствующие 12 кодону гена KRAS, представлены для каждого разведения.
Следующим шагом было определение минимального количества ДНК, необходимого для анализа. Для этого образец ДНК, содержащий минимально определяемую долю мутантной ДНК, был разведен и проанализирован, как описано выше. Было установлено, что для достоверного определения мутаций с заданной аналитической чувствительностью ПЦР-смесь первого этапа ПЦР должна содержать не менее 10 нг ДНК.
Анализ соматических мутаций в генах EGFR, KRAS, PIK3CA и BRAF с использованием биочипов проведен в выборках образцов опухолей поджелудочной железы, КРР, меланомы и НМРЛ.
Поскольку для каждого заболевания характерны мутации в определенных генах, анализ клинических образцов проводили только на наличие этих специфичных для конкретного типа опухоли мутаций в соответствующих генах. Так, образцы опухолей поджелудочной железы тестировали на наличие мутаций в гене KRAS, образцы КРР анализировали на наличие мутаций в генах KRAS, PIK3CA и BRAF, образцы меланомы тестировали на наличие мутаций в генах PIK3CA и BRAF, а в образцах НМРЛ изучали мутации во всех четырех генах.
Создание контрольных ДНК-матриц, содержащих мутации в генах EGFR, KRAS, BRAF и PIK3CA
Так как мутация в гене BRAF обнаружена только у одного пациента, статистическую обработку клинических данных и выявление ассоциаций не производили. Пациент с мутацией V600E являлся 32-летним курящим мужчиной с плоско клеточным НМРЛ I стадии (T1N0M0).
В данном исследовании мутации в генах EGFR, KRAS, PIK3CA и BRAF в рандомизированной выборке больных были обнаружены в 12,5%, 18,8%, 10,7% и 0,9% случаев, соответственно. Эти результаты очень близки к частотам, ранее описанным для европейской популяции (Boch et al., 2013; Rosell et al., 2009; Xu et al., 2011-2012; Carcereny et al., 2011; Graziano et al., 1999; Tam et al., 2006; Brose et al., 2002; Bunn et al., 2011; van Eijk et al., 2013). Установлено, что мутации в гене EGFR чаще встречаются у женщин, в аденокарциномах и у некурящих пациентов, что подтверждает исследования других авторов (Kosaka et al, 2004; Xu et al, 2011-2012; Tam et al, 2006; Li et al, 2013). Мутации в гене KRAS чаще встречались в аденокарциномах и у курильщиков, что также согласуется с литературными данными (Xu et al., 2011-2012; Graziano et al., 1999; Tam et al., 2006). В исследовании Xu с коллегами было показано, что мутации в гене KRAS чаще встречаются у мужчин, чем у женщин (.Р=0,004). Данная тенденция прослеживается и в результатах нашей работы, однако разница не достигла статистически значимого уровня (Р=0,23). Мутации в гене PIK3CA чаще обнаруживались при плоскоклеточном раке по сравнению с другими гистологическими типами, как и в работе Kawano с коллегами (Kawano et al., 2006), однако, в нашем исследовании различие не достигло статистически значимого уровня (Р=0,07). Аналогично другим исследованиям (Kawano et al., 2006), ассоциаций между наличием мутаций в гене PIK3CA и полом, возрастом и историей курения в анамнезе не выявлено.
Наличие мутаций в генах EGFR, KRAS и BRAF было взаимоисключающим, в то время как мутации в гене PIK3CA часто встречались одновременно с мутациями в других генах, что также соответствует литературным данным (Tam et al., 2006; Carcereny et al., 2011; Zimmermann & Peters, 2012).
Результаты генотипирования 112 образцов свежезамороженного биопсийного материала, полученные на биочипах, были валидированы секвенированием по Сенгеру. Всего с помощью биочипов мы обнаружили 50 мутаций в генах EGFR, KRAS, PIK3CA и BRAF. Однако только 33 из них были выявлены секвенированием (табл. 24): 11/14 (78,6%) EGFR мутаций (6/6 Е746-А750 del, 1/1 L747751del, 4/7 L858R); 17/21 (81,0%) KRAS мутаций (5/7 G12C, 5/5 G12D, 3/4 G12A, 3/3 G12V,1/1 G13C, 0/1 Q61H), 4/14 (28,6%) PIK3CA мутаций (1/2 Е542К, 1/6 Е545К, 2/6 H1047R) и 1/1 (100%) мутация BRAF V600E.
Идентификация мутаций в генах EGFR, KRAS, PIK3CA и BRAF с помощью биочипов, секвенирования и LNA-блокирующей ПЦР с последующим секвенированием (не включены пациенты, в опухолях которых мутации не обнаружены). Пациент Образец Биочип Секвенирование no Сенгеру LNA-блокирующаяПЦР + секвенированиепо Сенгеру
Для того чтобы определить количество ложноположительных результатов, полученных с использованием биочипов, 17 образцов, для которых результаты генотипирования двумя различными методами не совпали, были проанализированы с помощью LNА-блокирующей ПЦР с последующим секвенированием. Результаты этого анализа были идентичны результатам анализа на биочипах. Для примера, результаты секвенирования образцов опухолевой ДНК от пациентов №24 и №86 после ПЦР без/в присутствии LNA-олигонуклеотидов представлены на рисунке 34. На основе полученных данных мы можем сделать вывод, что использование при амплификации LNA-олигонуклеотидов является критически важным для выявления соматических мутаций с высокой аналитической чувствительностью.
Анализ секвенированием по Сенгеру. (А, Б) Сиквенс образца ДНК пациента №24, несущего мутацию Е545К в гене PIK3CA. (В, Г) Сиквенс образца ДНК пациента №86, несущего мутацию L858R в гене EGFR. (А, В) ПЦР-смесь не содержала LNA-олигонуклеотидов. (Б, Г) ПЦР-смесь содержала LNA-олигонуклеотиды. Добавление LNA-олигонуклеотида в ПЦР-смесь имеет принципиальное значение для выявления соматических мутаций.
Результаты генотипирования образцов ДНК, выделенных из парафиновых блоков, на наличие мутации в гене EGFR, были проверены секвенированием. Подготовка материала для выделения ДНК включала отбор опухолевых клеток под гистологическим контролем. Секвенирование было выполнено сотрудниками лаборатории онкогеномики НИИ Канцерогенеза, ФГБУ "Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина" РАМН. Мутации были обнаружены в 16 из 46 (34,8%) образцов. Таким образом, результаты генотипирования двумя различными методами совпали в 43 из 46 (93,5%) случаев. В трех образцах мутации в гене EGFR были выявлены секвенированием, но не обнаружены с помощью биочипов. В двух случаях это были делеции в 19 экзоне (Е746751del и E746-K754del), которые не могут быть выявлены с помощью гибридизации на биочипе, так как олигонуклеотиды, комплементарные им на биочипе отсутствуют. В одном образце только секвенированием была обнаружена замена L858R.
Для 23 пациентов, свежезамороженный биопсийный материал которых был проанализирован с использованием биочипов, был проведен параллельный анализ их опухолевого материала, фиксированного в парафиновых блоках, на наличие мутаций в гене EGFR с помощью секвенирования. Несмотря на то, что ДНК получали разными методами и из разных участков опухоли, результаты совпали в 95,6% случаев. Только в одном случае мутация L858R была обнаружена с помощью биочипа в препаратах ДНК из свежей ткани и парафинового среза, но не была выявлена при секвенировании ДНК из среза. Этот спорный случай был проверен с помощью ПЦР в реальном времени: мутация была выявлена во вновь выделенном препарате ДНК от этого пациента.
Для 11 случаев НМРЛ было проанализировано по два препарата ДНК из разных участков свежезамороженной опухоли. При анализе на биочипах результаты с разными препаратами ДНК от одного больного совпали во всех случаях, кроме одного пациента, у которого мутация РІКЗСА Е545К была обнаружена только в одном препарате из двух. Данное расхождение результатов может быть объяснено гетерогенностью опухоли.
При анализе результатов генотипирования опухолей поджелудочной железы, КРР и НМРЛ было замечено, что спектр мутаций в гене KRAS в каждой из выборок имеет некоторые отличия (рис. 35). Из-за малой численности анализируемых групп, статистический анализ для выявления ассоциаций между типом мутации в гене KRAS и локализацией опухоли был выполнен только для мутаций G12C, G12D и G12V.
Несмотря на невозможность проведения статистического анализа, стоит отметить, что мутация G13D значительно чаще встречалась у пациентов с КРР. Мутация G12R была обнаружена преимущественно у больных раком поджелудочной железы, a G12A - при НМРЛ. Возможно, при увеличении размеров анализируемых выборок, эти закономерности получили бы статистическое подтверждение.
![Молекулярно-генетический анализ и функционально значимые генетические мутации вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней [Электронный ресурс]](/i/i/4361/178845.png "Молекулярно-генетический анализ и функционально значимые генетические мутации вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней [Электронный ресурс] Воробьева Ирина Валерьевна")
