Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы
1. Гетерокариоз у мицелиальных грибов 10
1.1. Способы получения гетерокарионов 10
1.2. Различные типы гетерокарионов 12
1.3. Генетический контроль слияния вегетативных клеток 14
1.4. Контроль ядерного слияния 17
1.5. Тест на цитоплазматическую детерминацию признака. 19
1.6. Рекомбинация ядерного материала в гетерокарионах 20
1.7. Заключение 23
2. Гетерокариоз у дрожжей 25
2.1. Открытие явления гетерокариоза у дрожжей Sacch. cerevisiae 25
2.2. Открытие явления цитодукции 26
2.3. Изучение мутаций, контролирующих слияние ядер у дрожжей и ведущих к образованию гетерокариона 30
2.4. Частота спонтанной цитодукции 38
2.5. Изучение свойств дрожжевого гетерокариона 43
2.5.1. Споруляция гетерокарионов 43
2.5.2. Гибель ядер при образовании гетерокарионов . 44
2.5.3. Рекомбинация ядерных маркеров в гетерокарионе . 45
2.6. Использование явления цитодукции и гетерокариоза в генетике дрожжей 47
2.7. Перенос митохондрий при образовании цитодуктантов или сегрегации гетерокарионов 49
2.8. Использование цитодукции для определения цитоплаз-матической природы факторов 51
2.9. Использование метода цитодукции и теста с гете-рокарионом для локализации плазмид 52
3. Гетерокариоз и цитодукция при слиянии дрожжевых протопластов 56
4. Заключение 65
Глава II. Материалы и методу
1. Штаммы 69
2. Условия культивирования штаммов 73
3. Методы 75
3.1. Отбор цитодуктантов в скрещиваниях и при слиянии протопластов . 75
3.2. Получение инозитзависимых мутантов, определение аллельности мутаций 76
3.3. Схема получения гетерокарионов и изучение состава гетерокариотичных колоний 77
3.4. Определение частоты цитодуїщии и частоты образования гетерокарионов при слиянии протопластов 78
3.5. Определение частоты переноса плазмид при цитодукции 79
3.6. Синтез гетерокарионов с одной или двумя плазмцдами и определение частоты переноса плазмид при сегрегации гетерокарионов 80
3.7. Статистические методы 82
4. Терминология и номенклатура 82
Глава III. Эксперентальная часть
I. Гетерокариоз у дрожжей Sacaharomyces cerevisiae .84
1.1. Описание линии с высокой частотой цитодукции и выделение новой мутации hf сі » блокирующей кариогамию 84-
1.2. Получение мутаций инозитзависимости и определение их аллелыюсти 87
1.3. Получение гетерокарионов при скрещивании мутанта ino4 и штаммов дикого типа 88
1.4. Изучение влияния мутаций инозитзависимости в других локусах на кариогамию 104
1.5. Нарушение кариогашш при слиянии протопластов дрожжей 114
2. Изучение локализации химерных плазмид эписомного типа в клетках дрожжей 120
2.1. Изучение частоты переноса плазмид при образовании цитодуктантов 120
2.2. Изучение частоты переноса плазмид при сегрегации гетерокарионов 125
Глава IV. Обсуждение
1. Методы выделения мутаций, блокирующих кариогамию 128
2. Образование гетерокарионов у дрожжей Sacch.cerevisiae 129
3. Влияние на кариогамию мутаций инозитзависимости 157
4. Нарушешіе кариогамии при слиянии протопластов дрожжей
5. Локализация плазмид эписомного типа в клетках дрожжей 1^1
Список литературы
- Гетерокариоз у мицелиальных грибов
- Открытие явления гетерокариоза у дрожжей Sacch. cerevisiae
- Отбор цитодуктантов в скрещиваниях и при слиянии протопластов
- Описание линии с высокой частотой цитодукции и выделение новой мутации hf сі » блокирующей кариогамию
Введение к работе
В норме у дрожжей Saccharomyces cerevisiae состояние существует очень короткое время после слияния клеток перед кариогамией. Образование более длительно сохраняющегося гетерокариона у этих дрожжей происходит в результате нарушения процесса кариогамии, что может быть следствием мутаций или каких-либо других причин. В этом случае морфогенетический процесс образования диплоидного организма останавливается на стадии двухъядерной зиготы. Такая зигота может быть жизнеспособной и давать потомство двух типов гетерокарионы или ядерно-цитоплазматические гибриды-цитодуктанты.
Гетерокариоз и цитодукция у дрожжей описаны сравнительно недавно, но на основе этих явлений уже разработаны новые подходы для изучения цитоплазматической наследственности, ядерно-цитоплазматических отношений, сравнительного анализа радиочувствительности ядра и цитоплазмы. Цитодукция успешно используется при определении цитоплазматической или ядерной природы признаков, локализации плазмид в клетках, межъядерного переноса хромосом. В результате комбинации отдельных цитоплазматических факторов или отдельных хромосом с новым ядром, осуществляемой при пдтодукции или при сегрегации гетерокариона, были сконструированы новые штаммы, используемые в генетических исследованиях или представляющие ценность в производственном отношении.
Гетерокарионы с достаточно высокой частотой могут также образовываться при слиянии протопластов клеток. Использование метода слияния протопластов значительно расширило круг штаммов-партнёров, способных образовать гибриды, в том числе гетерокарионы и цитодуктанты.
Тем не менее, как сам процесс гетерокариоза у дрожжей, так и возможность его использования для решения вышеперечисленных проблем изучены слабо. Поэтому целью нашей работы было проанализировать особенности гетерокариоза у дрожжей,Sасch. cerevisiae и показать возможность использования этого процесса для расшифровки генетического контроля слияния ядер, а также для локализации челночных плазмид эписомного типа (с фрагментами 2 мкм ДНК) в клетках дрожжей.
Задачи исследования. Б связи с вышесказанным, задачи настоящих исследований заключались в следующем:
1. Разработать методы отбора мутаций, блокирующих кариогамию у дрожжей Saceh. cerevisiae , и получить соответствующие мутанты.
2. Использовать мутанты с блоком кариогамии для получения и изучения гетерокарионов.
3. Сравнить частоту образования цитодуктантов и гетерокарионов при сексуальных скрещиваниях и при слиянии протопластов дрожжей и изучить влияние локуса типа спаривания на кариогамию.
4. Изучить локализацию химерных плазмид эписомного типа в клетках дрожжей методом цитодукции и при использовании теста с гетерокарионом.
Научная новизна работы. В настоящей работе впервые выделен штамм Hfc-типа и усовершенствованы методы отбора мутантов Hfc; описана новая мутация, блокирующая кариогамию. Впервые описано влияние биохимических мутаций инозит зависимости на кариогамию при скрещивании некоторых линий дрожжей. Инозит зависимые мутанты удобно использовать для изучения гетерокариоза дрожжей, так как при этом мутация, вызывая нарушение слияния ядер, имеет самостоятельное фенотипическое выражение, которое легко учитывать. Мы впервые изучили свойства дрожжевых гетерока-рионов, несущих мутацию ino4 , и показали, что такие гетерокари-оны могут быть сбалансированными. Следует заметить, что к началу этой работы о гетерокариозе у дрожжей Sacch. cerevisiae имелась всего одна публикация зарубежных авторов (85). В настоящей работе нам впервые удалось связать нарушение кариогамии с конкретным биохимическим дефектом - блоком в синтезе инозита.
Гетерокарионы оригинального генотипа (гомоаллельные по типу спаривания) были получены нами также при слиянии протопластов дрожжей. Сравнивая частоту образования цитодуктантов и гетерока-рионов при сексуальном скрещивании и при слиянии протопластов, мы обнаружили, что при вегетативной гибридизации более часто нарушен процесс кариогамии. Причиной этого, вероятно, является отсутствие синхронизации ядер, объединённых в одной клетке принудительным способом. При сравнении частоты образования цитодуктантов, полученных при слиянии одинаковых и разных по типу спаривания протопластов, впервые выявлено влияние локуса типа спаривания на кариогамию у дрожжей Sacch. cerevisiae.
Явления гетерокариоза и цитодукции у дрожжей использованы нами при изучении локализации челночных плазмид эписомного типа (с фрагментом 2 мкм ДНК) в клетках дрожжей. Впервые показано, что плазмиды такого типа локализованы в ядре клетки.
Практическая значимость работы. Как уже указывалось, методы цитодукции позволяют осуществлять перенос цитоплазматических факторов, плазмид, хромосом. Изучение условий образования гетерокарионов и цитодуктантов при слиянии протопластов делают эти тест-системы универсальными, так как перенос цитоплазматических факторов, плазмид, хромосом или фрагментов хромосом возможен в этом случае не только при внутри- или межвидовой, но и при межродовой гибридизации. Эти методы уже использованы для конструирования новых производственных штаммов, а также для изучения гомологии хромосом производственных и лабораторных дрожжей, для изучения генетической и молекулярной структуры отдельных хромосом производственных штаммов дрожжей. Более эффективное использование их с этими целями возможно при более глубоком изучении явления цитодукции и гетерокариоза у дрожжей и получении новых мутаций, блокирующих кариогамию. Описанные в данной работе мутанты могут быть рекомендованы для такого рода исследований.
Сведения о локализации плазмид могут быть полезными при изучении и практическом использовании трансформации клеток, так как, если плазмиды локализованы в ядре, процесс трансформации клеток химерными плазмидами состоит по крайней мере из двух этапов: сначала плазмида должна проникнуть в клетку, а потом в ядро.
Место проведения работы и апробация. Наши исследования проводились в Ленинградском институте ядерной физики игл. Б.П.Константинова АН СССР в лаборатории (секторе) радиационной генетики (заведующий - доктор биологических наук, профессор И.А.Захаров). Вся экспериментальная работа выполнена непосредственно мною. Я благодарна Илье Артемьевичу Захарову за участие в организации и проведении исследований, за обсуждение результатов работы, Фёдоровой И.В. за дружескую поддержку и участие в обсуждении результатов работы, Кожиной Т.Н. за организацию работы по слиянию протопластов, за предоставление трансформантов, а также как соавтору одной из работ по изучению локализации плазмид, Евстюхинои Т.А. за участие в оформлении настоящей работы. Результаты работы докладывались или были представлены на: Четвёртом съезде ВОГиС им. Н.И.Вавилова (Кишинёв, 1981) и Всесоюзной конференции Рекомбинантные гшазмиды ЧЕущино, 1982).
Гетерокариоз у мицелиальных грибов
Термин гетерокарион обозначает разноядерность в клетках грибов. В литературе отмечается, что в вопросе приоритета открытия гетерокариоза допущена ошибка, бытующая до настоящего времени (70). Впервые явление гетерокариоза описано у гриба Pnycomyces nit ens Бургоффом в 1912 г. { 75), а не Хансеном и Смитом в 1932 г. у Botryces cinerea , как принято считать, и им же сформулированы термины: гетерокарион, гетерокариотичность {клетки содержат ядра разного генотипа), гомокариотичность {одного генотипа). Бургофф обнаружил связь между соотношением ядерных генотипов спор в спорангии и фенотипом развивающегося мицелия. Им же показано расщепление гетерокариона на гомокариотичные компоненты и объяснено появление секторов в гетерокариотичных колониях. Бургофф предположил, что различная скорость деления ядер в гетерокарионе может постепенно привести к гомокариотизации {пит. по 70).
Явление гетерокариоза широко распространено у мицелиальных грибов { 77, 14, 38, 28, 114 ). у большинства из них гетерокарион возшшает вследствие появления анастомозов между гифами разного генотипа, через которые происходит переход ядер и цитоплазмы. Таким способом гетерокарионы образуются у мицелиальных грибов, как имеющих половой процесс, так и у несовершенных грибов, у которых половой процесс отсутствует (189, 180).
Другой путь образования гетерокарионов - возникновение спонтанной или индуцированной мутации в одном из ядер гомокариона. Так, спонтанные реверсии к прототрофности в ядрах гомокариона
Nettrospora crassa » несущих мутацию лейцинзависимости, приводят к появлению гетерокарионов { 195 ). После облучения прототрофных гомокариотичных гиф Cochiiobolus sativus обнаружены гетерокарио-тичные клетки, несущие мутации ауксотрофности ( 220 ). Проявление гетерокариотичного состояния в этих случаях зависит от скорости размножения мутантного ядра, на что влияет как генотип гетерока-риотичных клеток, так и условия их культивирования { 95, 178). Необходимо подчеркнуть, что при слиянии гиф образуются гетерока-рионы со смешанной цитоплазмой (гетероплазмоны), в то время как в гетерокарионе, появившемся вследствие ядерной мутации, цитоплазма остаётся родительской (гомоплазмон), а ядра различаются только по одному локусу.
В лабораторных условиях для получения гетерокарионов обычно используют маркированные различными мутациями штаммы (14, 38,28,5). Для отбора гетерокарионов часто применяют те же селективные среды, что и для получения диплоидов, так как те и другие гибридные клетки имеют селективное преимущество вследствие комплементации мутаций по сравнению с родительскими штаммами. Например, на рис. I видно, что на используемой селективной среде родительские аук-сотрофные штаммы гриба Beauveria bassiana ( 59, 18) дают лишь слабый мицелиальный рост, в то время как гетерокарион, образовавшийся в месте перекреста, даёт интенсивный рост и обильное споро-ношение. Гетерокарион в отличие от диплоидов при делении клеток расщепляется на два родительских компонента ( 189). Так, рис.2 показывает, что споры гетерокариона гриба в. bassiana неоднородны по генотипу, при их прорастании образуются колонии обоих родительских типов. На этом рисунке также видно, что при соприкосновении мелких и крупных колоний происходит более интенсивный рост {"валики"), что указывает на образование новых гетерокарионов.
В последние годы получили распространение методы принудительной гибридизации клеток (слияние протопластов с помощью полиэти-ленгликоля, в электрическом поле, с помощью вируса СендайН 35, 50 ) Эти методы позволяют сочетать геномы, обычно в природе не сочетающиеся. При их использовании получены гетерокарионы у грибов, не имеющих ни полового, ни парасексуального процесса, а также у штаммов, несовместимых по типу спаривания или несущих гены несовместимости. При слиянии протопластов можно получать гетерокарионы при внутривидовой (123,112), межвидовой (182,224 ) и межродовой гибридизации { 181).
У грибов разработаны методы микроинъекции, при использовании которых можно переносить различные цитоплазматические частицы или ядра из одной клетки в другую и получать "искусственные" ге-тероплазмоны или гетерокарионы (237,236). Трансплантация грибных ядер впервые осуществлена Бургоффом на Phycomyces nitens ( 76). В последующих работах эти методы успешно применяли при исследовании цитоплазматической наследственности, явления несовместимости в гетерокарионе у N.crassa ( 101), Verticillium albo atrum И Y.dahliae (225, 224).
Открытие явления гетерокариоза у дрожжей Sacch. cerevisiae
Явление гетерокариоза у дрожжей Sacch. cerevisiae было обнаружено в 1951 г. Фаувеллом (цит. по 240 ). Несколько позднее Раит и Ледерберг (240 ) подтвердили его результаты. Они анализировали потомство индивидуальных зигот, рассевая образующиеся после спаривания микроколонии (20-100 клеток) или изолируя отдельные почки зигот. Из 530 проанализированных зигот 91 дала, наряду с диплоидньаш, гаплоидное клеточное потомство, 33 из них показали расщепление на оба родительских генотипа по ядерным маркерам, 58 зигот выщепляли ауксотрофы одного из родительских генотипов. В 90 из 91 случаев рекомбинации по ядерным маркерам не наблюдали и в одном случае зигота дала анеуплоидное потомство. В некоторых опытах был использован высоко супрессивный rho штамм,и при образовании гаплоидного потомства rho+ и rho детерминанты сочетались иногда с ядром неродительского генотипа. На основании полученных результатов был сделан вывод, что слиянию ядер в зиготах дрожжей Saccharomyces cerevisiae иногда пред -шествует состояние временного гетерокариона, последствием которого является образование гаплоидного потомства зигот. Фактор дыхательной недостаточности передаётся через гетерокариотичную цитоплазму при делении таких клеток и, следовательно, локализован в цитоплазме. Явление гетерокариоза у дрожжей долгое время не изучалось и не использовалось в генетическом анализе, поскольку присутствие незначительного количества ауксотрофных (гаплоидных)кле-ток среди большинства прототрофных трудно обнаружить без исполь зования специальных методов отбора.
В 1969 г. И.А.Захаровым с соавторами (19,7) было открыто явление цитодукции, а для регистрации нарушений кариогамии в зиготах был предложен простой метод отбора. При скрещивании изоген-НЫХ ЛИНИЙ дрожжей [rho4 alc4 АБЕ2 х [rho"j аС ade2 АІД4 на среде, селективной для [rholADE2 и [rlio+] ade2 клеток, были обнаружены не только нормальные диплоиды, но и ядерно- цитоплазматические гибриды, имеющие ядерный генотип реципиента, но гибридную цитоплазму, что определяли по переносу rho+ митохондрий. Такие гаплоидные гибриды отличались по фенотипу (красный цвет колоний) от ди-плоидов (белый цвет) и от исходных родительских штаммов (белого и рыжего цвета), которые к тому же на этой селективной среде не росли. Таким образом, признак нарушения карногалош в зиготах как бы приобрёл своё стенотипическое выражение. В опытах наблюдали появление секторных и цельных колоний гаплоидных ядерно- цито-плазматических гибридов. Считали, что образованию секторных колоний предшествует состояние временного гетерокариона, описанное Фаувеллом, Райтом и Ледербергом. Однако, для объяснения появления цельных колоний было недостаточно гипотезы о задержке кариогамша в зиготах. Потомство такой гибридной колонии могла бы дать зигота другого типа, а именно зигота, в которой ядро донора погибло. Гибель ядер в зиготах и появление вследствие этого генетически-однородного по ядерным признакам, но гибридного по цитоплазме,потомства было названо явлением цитодукции (19,17,10,244).Первоначально термин цитодуктант обозначал гаплоидные ядерно-цитоплазматические гибриды, возникшие в результате такого абортивного полового процесса. Именно цельные колонии цитодуктантов были использованы в последующих экспериментах по изучению автономного переноса цитоплазматических факторов (60, 49, 8, 243, 244).
Вскоре были получены экспериментальные данные, подтверждающие предположение о гибели ядра донора в зиготах при образовании цитодуктантов. Как известно, облучение УФ-лучами приводит в первую очередь к инактивации клеточного ядра (42,46 ). Оказалось, что цитодукция может быть индуцирована УФ-лучами, причём частота её зависит от дозы УФ-излучения и генотипа скрещиваемых штаммов ( 17, 51 ). Так, при облучении штамма alc4 rad2, дефектного по эксцизи-онной репарации, с последующим его скрещиванием с необлучённым ре-ципиентным штаммом генотипа [rho" rad2 частота цитодукции возрастает в 4 раза, а со штаммом с ненарушенной системой репарации [гЬо"1ш + только в 1,5 раза. Аналогичные данные получены в опытах с рентгеновским облучением (53). Авторы наблюдали в скрещиваниях штаммов [rho+]racL54 зс [rho"Jcad54 , несущих мутации чувствительности к рентгеновым лучам, всегда более высокую частоту цитодукціш по сравнению со скрещиваниями [rho adSA х [rhojEiAD и объяснили эти результаты большей инактивацией ядер в первом варианте опытов, так как репарация индуцированных рентгеновыми лучами повреждений в этом случае была нарушена
Отбор цитодуктантов в скрещиваниях и при слиянии протопластов
В работе использовано два метода для отбора цитодуктантов как при сексуальных скрещиваниях, так и при слиянии протопластов дрожжей.
Простой метод отбора цитодуктантов описан впервые в 1969 г. (19), его принцип был изложен нами в обзоре литературы (стр. 26 ). Среда Ц, которую мы использовали в экспериментах, селективна как для диплоидов (белые колонии), так и для цитодуктантов (красные колонии), и поэтому в опытах было легко определять частоту цитодукции. Мы применяли этот метод при отборе мутантов, дающих высокую частоту цитодукции, при изучении влияния мутаций инозитзависимости на кариогамию, при изучении частоты спонтанной цитодукции в сексуальных скрещиваниях и при слиянии протоп ластов.
Среда ПС (со спиртом и циклогексимидом) селективна только для цитодуктантов, которые образуются в скрещиваниях типа [riio+I auxi ADE CYH x [гЬо шс2 adе cyhE . Цитодуктанты отбирали по признакам дыхательной компетентности, красному цвету колоний и цик-логексимидустойчивости. На этой среде могли вырастать только колонии генотипа [rho"5cyhR , т.е. цитодуктанты, дающие клоны красного цвета, и редкие белые колонии диплоидов, гомозиготных по мутации cyhR , возникающих в результате митотического крос-синговера. Диплоиды, гетерозиготные по признаку циклогексимидус-тойчивости, на этой среде не растут, так как использованные мутации cyiiR рецессивны. Эту строго селективную для отбора цитодуктантов тест-систему удобно использовать в тех случаях, когда нужно получать большое количество цитодуктантов. Мы её применяли в работе по изучению локализации плазмид эписомного типа в клетках дрожжей, а также использовали на первом этапе отбора нового мутанта, блокирующего кариогамию.
При получении мутантов inoA-inoD , а также других ауксотро-фов, отмеченных в табл. 3 двумя звёздочками, клеточную суспензию прототрофного штамма І5В-П4 облучали УФ-лучами дозой 217 Дж/ кг (1% выживаемость) и применяли в дальнейшем стандартные методы для их отбора ( 12 ).
Для определения аллельности пяти независимо полученных нами мутаций инозитзависимости штаммы, несущие эти мутации и дополнительные маркеры ауксотрофности, скрещивали как между собой, так и с известными мутантами inoi, ino2, ino4 в разных комбинациях на среде М. Поскольку для локуса inoi известна межаллель-ная комплементация { 90, 165 ) ., для определения аллельности изучаемых мутаций мы брали мутанты с некомплементируюпщми аллелями I I-24a, I 1-36 ы( 165). Б качестве дополнительного критерия мы провели скрещивание с мутантом I 1-16а, аллель которого комплементирует с большинством других inoi аллелей {165 ).
В работе также использованы многочисленные мейотичеекие сег-реганты различных диплоидов { табл. 3, 4), при получении которых применяли стандартные методы, описанные в руководстве (12 ).
Схема получения гетерокарионов и изучения состава гетерокариотичных колоний была следующей:
1. На среде М смешивали клеточную суспензию двух штаммов (10 + I05 клеток на чашку), через неделю культивирования при 30 подсчитывали соотношение диплоидных и гетерокариотичных колоний, т.е. определяли частоту появления гетерокарионов (особенности гетерокариотичных колоний описаны ниже).
2. Некоторое количество гетерокариотичных колоний отбирали и рассевали каждую на 2-3 чашки со средой М. Дальнейшая работа проводилась с полученными при этом индивидуальными клонами.
3. Суспензию клеток гетерокариотичного клона рассевали на среды М и П из расчёта 200 клеток на I чашку (I рассев). На среде М подсчитывали количество выросших гетерокариотичных и диплоидных колоний. На среде П подсчитывали соотношение диплоидных, гетерокариотичных и гаплоидных (сегрегантов гетерокариона) колоний. Определяли ядерный и митохондриальный генотип клеток из гаплоидных колоний, применяя стандартные методы { 12).
4. Производили трёхкратный пересев (П-ІУ) клеток из гетерока-риотичной колонии истощающим штрихом на среде М.
5. Пятый рассев клеток гетерокариотичной колонии делали как описано в пункте 3, с таким же анализом клеточного состава колонии.
В таблицах, описывающих эти опыты, использовали сокращения: П-Г22 - номера гетерокариотичных колоний, один из родителей несёт мутацию inoA *, СГ - колонии гетерокариона спонтанного происхождения.
Описание линии с высокой частотой цитодукции и выделение новой мутации hf сі » блокирующей кариогамию
С частым нарушением кариогамии в некоторых скрещиваниях мы впервые встретились, проводя генетическое изучение ale- мутантов. Если в большинстве случаев в скрещиваниях различных мутантов ale с rho""ade тестерами появлялись белые диплоидные и немногочисленные (1%) красные колонии цитодуктантов (табл.1), то при скрещивании a alcl7 (23-й) частота образования красных колоний доходила до 42% (табл.5). Изучение генотипа клеток этих красных колоний показало, что они - гаплоиды, получившие ядро от одного родителя, а цитоплазму от другого, т.е. являются цитодуктантами. Было замечено также, что при скрещивании мутанта 23 очень высока частота образования красных секторных колоний с цитодуктантами. Красные сектора могут появляться в процессе роста гетерозиготных по adel или ade2 диплоидов за счёт митотической рекомбинации. Однако, частота спонтанного появления таких сегрегантов для Гатчинских линий дрожжей составляет только 0,2% (15), т.е. на два порядка ниже полученной нами (табл.5).
Проведенное в нашей лаборатории изучение многих других скрещиваний показало (табл.1), что в норме частота цитодукции намного ниже. Был сделан вывод, что высокая частота появления цитодуктантов генетически детерминирована. Линию с высокой частотой цитодукции назвали линией Hfcd (High frequency of cytoduction).
Штамм 23 не был генетически изучен в отношении признака Hfed , а в дальнейшем утерян. Поэтому перед нами стала задача получения мутанта Hfe . Мутацию hfcl мы выделяли следующим образом. Клетки реципиента цитоплазглы [rho""]o(ade2 leu2 cyhA облучали УФ-лучами, после чего их скрещивали на мембранных фильтрах, лежащих на среде П, с необлучёнными клетками штамма-донора [rho a Ieu2 шгаЗ . Через 6-8 часов фильтр с клетками помещали в пробирку с водой. Приготовленная таким образом суспензия состояла из клеток разного генотипа: зигот (диплоидных и гетерокариотичных) и гаплоидов, не принимавших участия в спаривании. Известно, что цитодуктанты (xho+o( ade2 leu2 cyhA ) образуются как потомство гетерокариотичных зигот (85,108,155,69). Селективной средой для их отбора (по признаку дыхательной компетентности и циклогексимидустоіічивости) служила среда ПС. Суспензию клеток из расчёта 5.10 на одну чашку высевали в растопленную (45) среду ПС, которую тут же разливали по чашкам с твёрдой средой такого же состава. Клетки оказывались в толще селективной среды. На поверхность агара прорастали только клетки цитодуктантов, колонии которых появлялись приблизительно через 10 дней при отсутствии фонового роста родительских штаммов и диплоидов, чувствительных к циклогексимиду.
Таким образом, наїли были отобраны цитодуктанты после спаривания облучённых УФ-лучаш клеток реципиента с клетками донора. Причины возникновения каждого из них могут быть разными. С низкой частотой цитодуктанты образуются спонтанно (19). Появление цито-дуктантов может быть индуцировано УФ- или рентгеновыми лучами за счёт поражения одного из ядер (17,53). И, наконец, с определённой частотой могут быть индуцированы мутации, ведущие к блоку кариогамии. Частота появления таких мутаций по данным Степановой и Заха-рова (54) составляет 1.10 , и близкая ей величина - 0,6-2,4.10 определена сходными методами в работе Инге-Вечтомова и Карповой (22). Обычно мутантные колонии среди цитодуктаытов выявляют, проверяя каждый из них индивидуально на способность образовывать ге-терокарион при скрещивании с тестерными штаммами (85,185). Для того, чтобы облегчить эту задачу и ускорить поиск мы использовали второй селективный метод (54). Вследствие отсутствия фонового роста на чашках с цитодуктантами мы смогли колонии перенести бархатом на селективную среду Ц,засеянную тестером (xho a adel ). При этом большинство клеток мутантного клона, спариваясь, образовывали цитодуктанты генотипа a adel , дающие колонии красного цвета, в то время как большинство клеток немутантного клона образовывали диплоиды, гетерозиготные по локусам adel, ade2 , дающие колонии белого цвета. Таким образом, мы нашли мутант Ы2-Д3012 , при спаривании которого с тестерными штаммами на соответствующих средах с частотой 82% образуются гетерокарионы.
Так как мутация, ведущая к блоку кариогамии, первоначально выявлена по способности клеток образовывать цитодуктанты с высокой частотой, она была обозначена - hfcl . Анализ расщеплений в случайной выборке гаплоидного потомства диплоида, гетерозиготного по локусу bfcl, показал следующее соотношение сегрегантов: 89 hfc : 86HFC , т.е. близкое 1:1, что свидетельствует о моногенном контроле признака дефектной кариогамии.
Эта мутация была индуцирована при УФ-облучении штамма, полученного от скрещивания Гатчинских линий дрожжей с французским штаммом 754, маркированным мутациями leu 2-3, 2-II2 (см. с.73). МутантЬ. 12 -Д30І2, сочетающий в генотипе мутацию, блокирующую кариогамию, и неревертирутощие мутации leu 2-3, 2-II2, был необходим при изучении локализации плазмид pYF9I и pYGOOI , несущих ген ЬЕїї2(см. с. 73).
Как указывалось в главе I (рис.3), секторные колонии, которые наблюдались в наших опытах, а также во всех других скрещиваниях С 19,52 ), но с малой частотой, были интерпретированы как свидетельство сохранения гетерокариотичного состояния. Сколь оно может быть продолжительно у дрожжей? Опыты Райта и Ледерберга, писавших о временном преходящем гетерокариозе, не давали на это ответ (240), опыты по методике, служившей для выявления цитодукпии также не говорили о продолжительности сохранения гетерокариотичного состояния. Надо было разработать другую методику, которая позволяла бы длительно поддерживать гетерокарионы. Это и было нами сделано первоначально в опытах с инозитзависимыми мутантами, у которых наблюдалась тенденция к нарушению кариогамии. Поэтому сперва опишем выделение 1по мутантов.
![Идентификация и характеристика генов, влияющих на поддержание и фенотипическое проявление прионоподобного детерминанта [ISP+], у дрожжей Saccharomyces cerevisiae](/i/i/4278/150135.png "Идентификация и характеристика генов, влияющих на поддержание и фенотипическое проявление прионоподобного детерминанта [ISP+], у дрожжей Saccharomyces cerevisiae Аксенова Анна Юрьевна")
![Влияние мутаций в прионизующем домене белка Sup35 на свойства приона [PSI+] дрожжей Saccharomyces cerevisiae](/i/i/4705/549604.png "Влияние мутаций в прионизующем домене белка Sup35 на свойства приона [PSI+] дрожжей Saccharomyces cerevisiae Бондарев Станислав Александрович")
