Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 22
1.1. Фторхинолоны. Молекулярно-генетические механизмы развития устойчивости M. tuberculosis к фторхинолонам . 23
1.2. Микробиологическое (фенотипическое) определение лекарственной чувствительности M. tuberculosis к препаратам фторхиноло-ного ряда27
1.2.1. Определение лекарственной чувствительности M. tuberculosis к противотуберкулезным препаратам на плотных средах 27
1.2.2. Определение лекарственной чувствительности M. tuberculosis к противотуберкулезным препаратам на жидких средах 28
1.3. Молекулярно-генетические методы и современные техноло
гии определения лекарственной чувствительности M. tuberculosis к
фторхинолонам 32
1.3.1. Молекулярно-генетические методы с электрофоретиче-ской детекцией мутаций, обуславливающих развитие лекарственной устойчивости M. tuberculosis . 32
1.3.2. Молекулярно-генетические методы, позволяющие определять тип мутаций 37
Собственные исследования 45
ГЛАВА 2. Модификация метода sscp и оценка эффективности коммерческих тест-систем для выявления мутаций в генах gyra и gyrb mycobacterium tuberculo sis45
2.1. Модификация метода конформационного полиморфизма длин одноцепочечных фрагментов («M-SSCP») для выявления мутаций в гене gyrB ДНК M. tuberculosis, ответственных за устойчивость к фторхинолонам
2.2.Эффективность применения тест-систем «ТБ-БИОЧИП-2», «GenoType MTBDRsl» и метода «M-SSCP» в образцах мокроты 49
ГЛАВА 3. Анализ мутаций в генах-мишенях mycobac-terium tuberculosis, ответственных за лекарственную устойчивость к фторхинолонам, выделенных из биологического материала больных туберкулезом легких 54
3.1. Анализ спектра мутаций в генах gyrA и gyrB с помощью тест-системы «ТБ-БИОЧИП-2» и метода «M-SSCP» в культурах M. tubercu-losis 54
3.2. Анализ мутаций в генах gyrA и gyrB и их связь с уровнем устойчивости M. tuberculosis к левофлоксацину и моксифлоксацину 58
3.3. Анализ спектра мутаций в генах gyrA и gyrB ДНК M. tuberculosis, устойчивых к фторхинолонам, выделенных у больных с впервые выявленным туберкулезом легких и с хроническим течением процесса 62
Заключение 67
Выводы 76
Практические рекомендации 77
Перспективы дальнейшей разработки темы 78
Список сокращений 79
Список литературы 81
- Микробиологическое (фенотипическое) определение лекарственной чувствительности M. tuberculosis к препаратам фторхиноло-ного ряда
- Молекулярно-генетические методы, позволяющие определять тип мутаций
- Эффективность применения тест-систем «ТБ-БИОЧИП-2», «GenoType MTBDRsl» и метода «M-SSCP» в образцах мокроты
- Анализ мутаций в генах gyrA и gyrB и их связь с уровнем устойчивости M. tuberculosis к левофлоксацину и моксифлоксацину
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Современная эпидемическая обстановка по туберкулёзу характеризуется увеличением количества больных, у которых выявляются штаммы Mycobacterium tuberculosis (МБТ) с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) и широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ) как среди пациентов с хроническим течением процесса, так и у впервые выявленных лиц (Migliori G. et. al., 2009).
Фторхинолоны являются одними из основных препаратов в составе резервного ряда противотуберкулезных препаратов, используемых для химиотерапии больных туберкулёзом с множественной лекарственной устойчивостью (Chan E. et al., 2004; Chiang C. et al., 2006; Yew W. et al., 2000). Однако их широкое использование для лечения различных неспецифических заболеваний привело к быстрому развитию к ним лекарственной устойчивости (ЛУ) M. tuberculosis (Wang J. et al., 2007). В связи с этим необходимо быстрое выявление возбудителя и определение лекарственной чувствительности (ЛЧ) к этой группе препаратов.
Микробиологическое определение лекарственной чувствительности M. tuberculosis к фторхинолонам с использованием плотной среды Левенштейна-Йенсена (Л-Й) длительное. Использование жидких сред в автоматизированных системах типа Вactec 960 позволяет сократить время исследования. Однако в настоящее время сертифицированных культуральных тестов для определения лекарственной чувствительности M. tuberculosis к фторхинолонам в Вactec 960 нет, есть только рекомендованные критические концентрации (КК) к данным препаратам (Исаева Ю.Д. и др., 2012; Grace Lin S-Y. et al., 2009; Rsch-Gerdes S. et al., 2006).
В этом отношении молекулярно-генетические методы позволяют в течение двух суток выявлять ДНК M. tuberculosis непосредственно в диагностическом материале и определять мутации в генах-мишенях, связанных с развитием устойчивости M. tuberculosis к противотуберкулезным препаратам (ПТП).
Мишенью действия фторхинолонов в M. tuberculosis является ДНК-гираза, которая состоит из двух субъединиц А и В, кодируемых генами gyrA и gyrB соответственно (Ginsburg A. et. al 2003; Lau R. et al. 2011; Shi R. et al. 2006; Takiff Н. et al. 1994). Регион, определяющий устойчивость к фторхинолонам (РОУФ) генов gyrA (320 п.н.) и gyrB (375 п.н.), является консервативной областью, где возникают нуклео-
тидные замены (мутации), связанные с устойчивостью M. tuberculosis к фторхиноло-нам. Преобладающее большинство мутаций (45-85%) сосредоточено в РОУФ гена gy-rA. Замены в гене gyrB встречаются как самостоятельно, так и в сочетании с геном gy-rA (Groll A. et al., 2009). Доля таких штаммов среди всех M. tuberculosis, устойчивых к фторхинолонам, составляет около 7%, однако роль некоторых из них в развитии устойчивости до конца не ясна (Wang J. et al., 2007). Кроме того, не все мутации в генах gyrA и gyrB связаны с перекрёстной устойчивостью M. tuberculosis ко всей группе фторхинолонов.
Таким образом, одновременное выявление мутаций в генах gyrA и gyrB может дать дополнительную информацию о лекарственной чувствительности к фторхиноло-нам исследуемого штамма, а также повысить корреляцию молекулярно-генетических данных с микробиологическими результатами лекарственной чувствительности M. tuberculosis к данным препаратам.
Степень разработанности темы исследования
Большой вклад в изучение молекулярного развития ЛУ МБТ к фторхинолонам внесли зарубежные ученые. В работах Takiff H.E, Ginsburg A, Shi R. было показано, что устойчивость МБТ к фторхинолонам связана с появлением мутаций в генах gyrA и gyrB (Takiff H. et al., 1994; Ginsburg A. et al., 2003; Shi R. et al., 2006). В настоящее время охарактеризовано их значительное количество. В 85% штаммов, устойчивых к фторхинолонам, мутации сосредоточены в РОУФ гена gyrA (320 п.н.), содержащих полиморфные кодоны 88, 90, 91, 94 и 95. Кодон 95 содержит естественно-обусловленный полиморфизм Ser95Thr, не влияющий на ЛЧ МБТ к фторхинолонам (Yew W. et al., 2002). Мутации в 90, 91 и 94 кодонах связаны с ЛУ ко всем препаратам группы фторхинолонов (An D. et al., 2009). Также описаны мутации вне РОУФ gyrA, вызывающие ЛУ к фторхинолонам (Devasia R. et. al, 2012). В последние годы в литературе широко обсуждается вопрос о влиянии мутаций в РОУФ гена gyrB (375 п.н.) на чувствительность МБТ к препаратам фторхинолонового ряда (Cui Z. et. al, 2011; Pantel A. et. al., 2011). Замены в гене gyrB могут встречаться как самостоятельно, так и в сочетании с мутациями в гене gyrA и составляют около 7% среди всех устойчивых МБТ к фторхинолонам (Wang J. et al., 2007; Groll A. et al., 2009).
В России среди ученых, которые занимаются изучением этой проблемы, в области диагностики и эпидемиологии лекарственно-устойчивых форм возбудителя ту-
беркулеза известны имена: Черноусова Л.Н., Грядунов Д.А., Антонова О.В., Мокро-усов И.В. и другие. Однако работы данных авторов в основном посвящены выявлению мутаций в гене gyrA. В то же время остается мало изученным вопрос о роли мутаций в гене gyrB МБТ или в сочетании с заменами в gyrA в развитии устойчивости ко всем фторхинолонам или к отдельным из них, а также их связь с уровнем устойчивости.
Цель исследования
Выявить мутации в генах gyrA и gyrB и определить их спектр с помощью биологических микрочипов и модифицированного метода конформационного полиморфизма длин одноцепочечных фрагментов («M-SSCP») для быстрого и точного определения лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis к фторхинолонам у больных туберкулезом легких.
Задачи исследования:
1. Разработать модификацию метода конформационного полиморфизма длин
одноцепочечных фрагментов («M-SSCP») и оценить эффективность его применения
для выявления мутаций в гене gyrB ДНК M. tuberculosis из диагностического матери
ала (мокроты).
2. Провести сравнительный анализ результатов молекулярно-генетического
определения лекарственной чувствительности M. tuberculosis к фторхинолонам в гене
gyrA с помощью коммерческих тест-систем «ТБ-БИОЧИП-2» и «GenoType
MTBDRsl» в диагностическом материале (мокроте).
-
Провести анализ мутаций в генах gyrA и gyrB M. tuberculosis с помощью «ТБ-БИОЧИП-2» и метода «M-SSCP» в культурах, выделенных из диагностического материала больных туберкулёзом легких.
-
Определить связь мутаций в генах gyrA и gyrB ДНК M. tuberculosis с уровнем устойчивости к левофлоксацину и моксифлоксацину с использованием модифицированных жидких сред Middlebrook 7Н9 в автоматизированной системе Вactec 960.
-
Изучить спектр мутаций в генах gyrA и gyrB ДНК M. tuberculosis, устойчивых к фторхинолонам, выделенных у впервые выявленных больных туберкулезом легких и с хроническим течением процесса.
Научная новизна
Впервые с помощью метода «M-SSCP», разработанного в ГКУЗ МНПЦ борьбы с туберкулезом ДЗМ, определен вклад мутаций в гене gyrB в развитие лекарственной устойчивости M. tuberculosis к фторхинолонам (Патент на изобретение РФ № 2439162 от 10.01.2012 «Способ диагностики чувствительности штаммов Mycobacterium tuberculosis к фторхинолонам по гену gyrВ»).
Впервые разработанный молекулярно-генетический метод «M-SSCP» в сочетании с коммерческой тест-системой «ТБ-БИОЧИП-2» позволил расширить анализируемый спектр мутаций в генах, ответственных за лекарственную устойчивость M. tuberculosis к фторхинолонам.
Установлена связь между типом мутаций в генах gyrA и gyrB ДНК M. tuberculosis и уровнем устойчивости к левофлоксацину и моксифлоксацину.
На большом количестве биологического материала показано процентное распределение мутаций в двух генах M. tuberculosis, выделенных у впервые выявленных больных и с хроническим течением процесса, что имеет большое эпидемиологическое значение.
Теоретическая и практическая значимость работы
Получены новые данные, демонстрирующие, что одновременное выявление мутаций в генах gyrA и gyrB позволяет расширить анализируемый спектр мутаций и дать более полную информацию о лекарственной чувствительности M. tuberculosis к фторхинолонам исследуемого штамма.
Установлено, что коммерческая тест-система «ТБ-БИОЧИП-2» позволяет с высокой чувствительностью одновременно выявлять ДНК M. tuberculosis и определять как часто, так и редко встречающиеся мутации в гене gyrA. Применение ее для исследования диагностического материала позволит сократить время получения результата и тем самым своевременно скорректировать режим химиотерапии. Разработанный метод «M-SSCP» можно применять как скрининг-тест для быстрого выявления мутаций в гене gyrB M. tuberculosis.
Разработанные методические рекомендации «Определение лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis с помощью биочипов», утвержденные Департаментом Здравоохранения города Москвы от 29.09.2008 года, применяются в клинической практике противотуберкулезных учреждений.
Полученные данные анализа мутаций в генах gyrA и gyrB с помощью метода «M-SSCP» и секвенирования были использованы в разработке тест-системы «ТБ-ТЕСТ», основанной на технологии гидрогелевых биочипов в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (Работа поддержана государственным контрактом с Министерством образования и науки РФ № 16.522.11.2003 и программой фундаментальных исследований президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология»). В настоящее время данная тест-система проходит клинические испытания.
Методология и методы исследования
Методология настоящего исследования спланирована согласно поставленной цели. Предметом исследования стали проблемы, связанные с лекарственной устойчивостью M. tuberculosis к препаратам резервного ряда (фторхинолонам). Анализ научной литературы, посвященной проблеме, проведен на основе формально-логических методов исследования. Планирование и проведение исследований, направленных на решение поставленных задач, осуществлялось на основе общенаучных и специфических методов. Основным объектом исследования являлся респираторный материал (мокрота) и культуры M. tuberculosis, полученные от больных туберкулезом легких.
Исследование проводилось в отделе проблем лабораторной диагностики туберкулеза и патоморфологии ГКУЗ МНПЦ борьбы с туберкулезом ДЗМ.
Микробиологическое (фенотипическое) определение лекарственной чувствительности M. tuberculosis к препаратам фторхиноло-ного ряда
Устойчивость (резистентность) МБТ к ПТП определяется как снижение чувствительности до такой степени, что данный штамм микобактерий способен размножаться при воздействии на него препарата в критической или более высокой концентрации [18].
Критической концентрацией принято считать самую низкую концентрацию, которая ингибирует рост 95% встречающихся чувствительных МБТ, ранее не контактировавших с препаратом [3]. Для каждой среды или системы культивирования должны быть подобраны соответствующие КК препаратов.
В международной практике используют следующие классические бактериологические методы: абсолютных концентраций на плотной питательной среде Л-Й, пропорций на среде Л-Й или на среде Middlebrook 7Н10 (М7Н10) и коэффициента резистентности.
В России в большинстве микробиологических лабораторий применяют метод абсолютных концентраций на плотной питательной среде Л-Й, который позволяет обнаружить ЛУ колонии МБТ в течение 3-4 недель [3, 5, 6].
Данный метод заключается в определении КК ПТП, которые подавляют рост МБТ при культивировании их на питательной среде Л-Й, содержащей необходимые препараты [33]. Существенным недостатком данного метода является его длительность (6-12 недель), что значительно задерживает выбор режима химиотерапии. Кроме того, для определения ЛЧ МБТ к фторхинолонам методом абсолютных концентраций на плотной питательной среде Л-Й рекомендовано использовать только КК OFX 2 и 10 мкг/мл [18].
В лабораториях за рубежом для определения ЛЧ МБТ чаще всего используют метод пропорций на агаровой среде M7Н10, основанный на сравнении числа колониеобразующих единиц (КОЕ) выделенной культуры, выросших в отсутствии препарата и в его присутствии в КК. По данным ВОЗ, рекомендованные КК для CIP, OFX, LVX 2 мкг/мл и GTX 1мкг/мл для этого метода [114].
Метод коэффициента резистентности основан на определении соотношения минимальной ингибирующей концентрации (МИК), определяемой для данного штамма, выделенного от конкретного больного к МИК ЛЧ стандартного штамма H37Rv, постановка которого проводится в одном и том же исследовании. В данном случае штамм H37Rv используют не для контроля опыта, а для определения возможных вариаций при постановке теста. С этой точки зрения данный метод является наиболее точным из трех выше перечисленных, однако в силу необходимости использования большого количества пробирок с питательной средой он является наиболее дорогим и трудоемким. Последнее обстоятельство резко ограничивает его применение. 1.2.2. Определение лекарственной чувствительности M. tuberculosis к противотуберкулезным препаратам на жидких средах
С появлением автоматизированных систем культивирования, внедренных в специализированных лабораториях в РФ, был достигнут качественно новый уровень определения ЛЧ к ПТП. Это дало возможность получать результаты, хорошо сопоставимые с традиционными методами абсолютных концентраций на среде Л-Й или пропорций на среде M7H10, но в достоверно более короткие сроки. Автоматизированные системы позволяют производить тестирование ЛЧ у микобактериальных культур, давших рост как на плотной, так и на жидкой средах в приборах соответствующих фирм [76].
Одной из первых полуавтоматических систем, которая была разработана компанией Becton Dickinson, стала Вactec 460. Радиометрический метод детекции, используемый в этой системе для определения ЛЧ на среде Mid-dlebrook 7Н12, до недавнего времени считался одним из наиболее точных [8, 58, 88]. В данной системе рост микобактерий определяется путём регистрации уровня, меченого 14СО2, который образуется в процессе утилизации размножающимися микроорганизмами субстрата с пальмитиновой кислотой, содержащей радиоактивный 14С. В некоторых лабораториях мира система Вactec 460 получила широкое распространение и стала своеобразным рефе-ренс-методом, с которым сравнивали вновь создаваемые системы бульонного культивирования. Несмотря на очевидные достоинства, система имеет ряд недостатков, главным из которых является работа с радиоизотопами и необходимость утилизации радиоактивных отходов, что способствовало прекращению её использования в клинической микробиологии.
Следующей системой для ускоренного бактериологического выявления микобактерий туберкулеза и определения ЛЧ к ПТП также стала полуавтоматическая система Вactec 960 с использованием жидкой питательной среды Middlebrook 7Н9 (М7Н9). Принцип метода заключается в постоянной регистрации сигнала роста в индикаторных пробирках MGIT (Mycobacteria Growth Indicator Tube) во время активного поглощения кислорода размножа ющейся микробной популяцией. Вследствие этого флуоресцентный компонент, заключенный на дне пробирки, высвобождается и начинает светиться при ультрафиолетовом облучении. Прибор осуществляет постоянный мониторинг пробирок с внесенным диагностическим материалом во время инкубации [76].
Определение ЛЧ МБТ к ПТП первого ряда (стрептомицин (Sm), RIF, INH, этамбутол (EMB), пиразинамид (PZA)) в системе Вactec 960 занимает от четырех до четырнадцати дней после пересева выделенной культуры МБТ в пробирки с указанными лекарственными препаратами. Устойчивым является тот штамм, рост которого детектируется как в контрольной пробирке, так и в пробирке, содержащей препарат. Напротив, чувствительным является штамм, который в пробирке с препаратом не флуоресцирует спустя два дня после детекции роста в контрольной пробирке [59, 92].
Вместе с тем, до настоящего времени нет стандартизованных КК и готовых наборов для определения ЛЧ к препаратам второго (резервного) ряда (в частности, к фторхинолонам) в автоматизированной системе Вactec 960. Исследования в этой области ведут с 2004 как отдельные лаборатории в научных центрах, так и мультицентровые, в которых участвуют одновременно несколько лабораторий из разных стран. В качестве контрольных микробиологических методов сравнения результатов исследования используют метод пропорций на агаровой среде M7H10, коэффициент резистентности на плотной среде Л-Й, а также систему Вactec 460. Однако в ходе лабораторных исследований выявлены существенные различия в отношении методов тестирования, КК препаратов и предельно допустимых пропорций для выявления устойчивости. И в результате сопоставимые КК были определены только для OFX 2,0 мкг/мл и для CIP 1,0 мкг/мл [66, 89, 93]. В то время как для LVX и MOX значения КК различались и составили 1,5 мкг/мл и 2,0 мкг/мл, 0,125 мкг/мл, 0,5 мкг/мл и 1 мкг/мл соответственно [45, 53, 66, 89, 95].
Молекулярно-генетические методы, позволяющие определять тип мутаций
К молекулярным технологиям, которые позволяют не только выявлять ДНК МБТ, но и определять тип мутаций, относятся метод выявления мутаций, приводящих к полиморфизму длин рестрикционных фрагментов ДНК (ПДРФ), аллель-специфическая ПЦР, ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ), различные виды гибридизации и секвенирование.
Метод выявления мутаций, приводящих к полиморфизму длин ре-стрикционных фрагментов ДНК – restriction fragments length polymorphism – RFLP (ПДРФ)
Метод основан на выявлении полиморфного сайта рестрикции (мутации) после проведения амплификации тестируемого фрагмента ПЦР и его последующем расщеплением соответствующей рестриктазой. Наличие мутации в одном из сайтов рестрикции приводит к тому, что сайт остается нерасщепленным, а полученный фрагмент ДНК состоит из соединенных соседних рестрикционных фрагментов большего размера. Размер полученных фрагментов определяют с помощью электрофореза в агарозном геле. Метод зарекомендовал себя как надежный и простой в использовании и получил широкое распространение. Однако он имеет некоторые ограничения, связанные, в первую очередь, с тем, что можно определять только те мутации, которые расположены в сайтах рестрикции. Кроме того, с его помощью можно детектировать только уже известные мутации [20, 27, 113].
Аллель-специфическая ПЦР – allele specific primer extension (АС-ПЦР) Суть метода заключается в проведении ПЦР, с аллель-специфическими праймерами для мутантной или нормальной олигонуклеотидной последовательности. Аллель-специфические праймеры, полностью комплементарные лишь мутантным последовательностям анализируемой ДНК, позволяют выявлять мутации, в то время как последовательности нуклеотидов ДНК дикого типа (wild type – wt) не амплифицируются. Подобный подход позволяет обнаружить несколько десятков или сотен молекул мутантной ДНК на фоне десятков тысяч молекул ДНК wt [17]. Воспроизводимость классической АС-ПЦР зависит от условий амплификации, выбранных праймеров и концентрации матричной ДНК.
Современные модификации метода АС-ПЦР позволяют выявлять от 54,4% до 98,4% мутаций, связанных с ЛУ к ПТП первого и второго (резервного) ряда со 100% специфичностью [39, 49, 104, 108].
В РФ Шемякиным И.Г. и соавт. (2005) на основе классического метода АС-ПЦР был разработан метод деплиторной АС-ПЦР, который позволяет одновременно обнаруживать мутации к препаратам первого ряда INH и RIF, определять видовую принадлежность микроорганизма и контролировать качество анализируемого материала. В этом методе в качестве вспомогательных ампликонов были выбраны фрагменты гена mpt40 и инсерционной последовательности IS6110. Различия в длине ПЦР продуктов позволяют дифференцировать их при проведении электрофореза и эффективно подавлять накопление ложноположительных продуктов реакции, что увеличивает эффективность и специфичность метода [21].
Новый вариант метода – ПЦР в реальном времени – REALIME-PCR (ПЦР-РВ), главным преимуществом которого является исключение этапа электрофореза, обычно используемого для визуализации результатов детекции ДНК МБТ в анализируемых образцах [36]. Регистрацию накапливаемой ДНК возбудителя в исследуемом образце осуществляют с помощью специального оптического модуля амплификатора в течение прохождения всех циклов ПЦР. Метод позволяет за 1-2 часа с высокой чувствительностью и специфичностью выявлять в анализируемом диагностическом материале пациента как ДНК МБТ, так и мутации по интересующим фрагментам генов.
В настоящее время существуют коммерческие тест-системы, основанные на технологии ПЦР-РВ, которые предназначены для выявления МБТ, устойчивых к ПТП первого ряда (INH и RIF) и фторхинолонам, непосредственно в диагностическом материале больного. Тест-система «Амплитуб-МЛУ-РВ», разработанная («СИНТОЛ», Россия), позволяет выявлять мутации в гене rpoB (531, 526, 516, 533 кодоны), ответственные за устойчивость МБТ к RIF, генах katG (315 кодон) и inhA (209 кодон), ответственных за устойчивость к INH. В генах embB (306 кодон) и gyrA (90 и 94 кодоны), ответственных за устойчивость к EMB и фторхинолонам соответственно. В основе метода лежит мультиконкурентная АС-ПЦР, позволяющая выявлять мутации в перечисленных генах [2, 107]. Однако тест-система имеет ограничения, а именно анализ проводится только маркёрных генов с охватом не всех типов мутаций, что увеличивает расхождение с результатами бактериологического исследования.
Другая тест-система Xpert MTB/RIF в формате картриджа для использования с системой GeneXpert, разработанная компанией (Cepheid, США), предназначена для одновременного выявления ДНК МБТ и определения ЛУ только к одному ПТП (RIF) в гене rpoB МБТ. Исследование проводят на приборе GeneXpert в независимых шестиканальных модулях для ПЦР-РВ. Это полностью автоматизированная система, простая для исследования, включающая в себя процесс выделения ДНК, мультиплексную ПЦР в режиме реального времени и автоматическую интерпретацию результатов реакции. Результат может быть получен через 2,5 часа после поступления диагностического материала в лабораторию. Аналитическая чувствительность метода составляет 106 – 176 КОЕ/мл. Специфичность метода – 100%, чувствительность в оценке устойчивости к RIF– 96,7%, специфичность – 98,6% (для категории чувствительных МБТ к RIF) [28, 29, 61]. Преимущество технологии заключается в исключении этапа пробоподготовки материала, что связано с риском контаминации образцов во время экстракции ДНК МБТ. При этом необходимо отметить, что это полностью закрытая дорогостоящая тест-система, требующая закупки как прибора, так и расходных материалов в виде картриджей Xpert MTB/RIF. Кроме того, как и для «Амплитуб-МЛУ-РВ» существует недостаток, связанный, прежде всего, с самой технологией применения ПЦР-РВ для определения ЛЧ. Метод имеет ограничения в анализе количества исследуемых генов ДНК МБТ и/или смысловых замен (мутаций). Для препаратов фторхинолонового ряда в настоящее время готовых наборов картриджей пока ещё нет.
Метод твердофазной гибридизации на различных видах носителей включает амплификацию со специфическими биотинилированными прайме-рами гена-мишени и гибридизации ПЦР-продукта со специфическими оли-гонуклеотидными зондами, иммобилизованными на мембране в виде параллельных полос. В качестве мембраны могут использоваться различные виды носителей, такие как нитроцеллюлозные, нейлоновые или бумажные [60, 112].
В числе сертифицированных в РФ коммерческих тест-систем для определения ЛЧ МБТ к препаратам первого ряда используют систему GenoType MTBDRplus, а для второго (резервного) ряда GenoType MTBDRsl.
Эффективность применения тест-систем «ТБ-БИОЧИП-2», «GenoType MTBDRsl» и метода «M-SSCP» в образцах мокроты
Современные молекулярные тесты позволяют одновременно выявлять МБТ и определять их ЛЧ к ПТП в респираторном материале пациента. Нами был проведен сравнительный анализ эффективности выявления ДНК МБТ и молекулярного определения ЛЧ МБТ к фторхинолонам по гену gyrA в образцах мокроты с помощью двух тест-систем «ТБ-БИОЧИП-2» и «GenoType MTBDRsl». Тест-система «GenoType MTBDRsl» рекомендована ВОЗ для быстрого молекулярного определения ЛЧ МБТ к фторхинолонам, аминогли-козидам и препарату первого ряда EMB в образцах мокроты с положительной микроскопией и в культурах МБТ.
Для исследования были отобраны 74 образца мокроты, из которых была выделена культура МБТ на среде M7Н9 в системе Вactec 960. С помощью тест-систем «ТБ-БИОЧИП-2» ДНК МБТ была обнаружена во всех 74 (100%) образцах и только в 67 (90,5%) с помощью «GenoType MTBDRsl». Полученные результаты сравнивали с данными люминесцентной микроскопии и посевом в Вactec 960. Данные представлены в таблице 4.
Из данных, представленных в таблице 4, видно, что при положительной люминесцентной микроскопии и росте МБТ в Вactec 960 с помощью тест-системы «ТБ-БИОЧИП-2» ДНК МБТ была обнаружена в 54 образцах мокроты, а с помощью тест-системы «GenoType MTBDRsl» в 51 образце. При отрицательной люминесцентной микроскопии и положительном росте в 20 образцах мокроты была обнаружена ДНК МБТ с помощью «ТБ-БИОЧИП-2» и в 16 с помощью «GenoType MTBDRsl». Таким образом, результаты исследования показали, что достоверно большей чувствительностью (р 0,05) при выявлении ДНК МБТ в мокроте обладала тест-система «ТБ-БИОЧИП-2», совпадение с результатами бактериологических исследований для которой составило 100%. Совпадение результатов исследования «GenoType MTBDRsl» с бактериологическими исследованиями составило 90,5%. Далее было проведено сравнение результатов молекулярно генетического выявления мутаций в гене gyrA МБТ с помощью «ТБ-БИОЧИП-2», «GenoType MTBDRsl» и бактериологического определения ЛЧ к OFX на среде Л-Й в 67 образцах мокроты, в которых была обнаружена ДНК МБТ двумя тест-системами. Данные представлены в таблице 5.
Как следует из таблицы 5, результаты, полученные с помощью тест-систем «ТБ-БИОЧИП-2» и «GenoType MTBDRsl», показали, что в 29 образцах мутации в гене gyrA МБТ не были обнаружены, что совпало с результатами бактериологического определения ЛЧ к OFX. Из 38 образцов мокроты, в которых МБТ показали фенотипическую устойчивость к OFX, в 35 были выявлены мутации в гене gyrA с помощью тест-системы «ТБ-БИОЧИП-2» и в 34 с помощью «GenoType MTBDRsl».
Далее все образцы мокроты исследовали на наличие мутаций в гене gyrB ДНК МБТ с помощью метода «M-SSCP», после чего был проведён анализ спектра мутаций в генах gyrA и gyrB ДНК МБТ тремя тест-системами в 74 образцах мокроты. Данные представлены в таблице 6.
Из результатов, представленных в таблице 6, видно, что из 74 образцов, в которых с помощью «ТБ-БИОЧИП-2» и «M-SSCP» была выявлена ДНК МБТ и определен спектр мутаций в генах gyrA и gyrB, в 7 с помощью «GenoType MTBDRsl» ДНК МБТ обнаружить не удалось. В 29 из 31 чувствительных МБТ к OFX, по данным микробиологического определения, тест-системой «ТБ-БИОЧИП-2» была выявлена полиморфная замена (Ser95Thr). Напротив, с помощью «GenoType MTBDRsl» обнаружена ДНК МБТ с wt, так как 95 кодон не включен в данную тест-систему. В 32 из 43 устойчивых МБТ к OFX спектр мутаций совпал по двум тест-системам, в двух мутация Asp94Asn, которая была выявлена «ТБ-БИОЧИП-2», не конкретизируется «GenoType MTBDRsl» Asp94Asn/Tyr. В одном случае тест-система «GenoType MTBDRsl» не выявила мутацию Gly88Cys, так как 88 ко-дон не включен в данную систему.
Из трех образцов ДНК МБТ, выделенных из мокроты, в которых не были выявлены мутации в гене gyrA двумя тест-системами, в двух были обнаружены отличия на электрофореграмме и после секвенирования определены тип мутации в гене gyrB Ala543Thr. В одном образце мутации не были обнаружены. Можно предположить, что замены в генах gyrA и gyrB находятся за пределами РОУФ исследуемого тест-системами «ТБ-БИОЧИП-2», «GenoType MTBDRsl» и методом «M-SSCP», или в развитии лекарственной устойчивости задействованы другие молекулярные механизмы [44, 57, 106, 110]. Также рекомендованная в приказе № 109 от 21марта 2003 года «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации» КК OFX – 2,0 мкг/мл на плотной среде Л-Й может является низкой для оценки ЛУ МБТ [15].
Таким образом, результаты исследования показали, что наибольшей эффективностью обладает тест-система «ТБ-БИОЧИП-2», которая с достаточной чувствительностью позволяет одновременно выявлять ДНК МБТ в мокроте и определять не только часто встречаемые мутации в 90, 91, 94 ко-донах, но и редко определяемую Gly на Cys в 88 кодоне гена gyrA. В то же время метод «M-SSCP» может применяться как скрининг-тест для выявления ДНК МБТ из мокроты и определения электрофоретических отличий, связанных с появлением мутаций в гене gyrB непосредственно из мокроты. Поэтому в дальнейшей работе по анализу мутаций в генах gyrA и gyrB мы использовали тест-систему «ТБ-БИОЧИП-2» и метод «M-SSCP».
Анализ мутаций в генах gyrA и gyrB и их связь с уровнем устойчивости M. tuberculosis к левофлоксацину и моксифлоксацину
Результаты исследований последних лет о возможной связи между типом мутации в генах gyrA/B и уровнем устойчивости к препаратам фторхи-нолонового ряда разноречивы [44, 67, 96]. Кроме того, не все замены в гене gyrB связаны с ЛУ ко всей группе препаратов фторхинолонового ряда [71, 81].
В связи с этим для исследования случайным образом были отобраны 68 культур МБТ, из которых 38 были фенотипически устойчивые к OFX и 30 чувствительные. Среди устойчивых штаммов МБТ к OFX 35 были также устойчивыми к INH и RIF (МБТ-МЛУ), два – устойчивыми к RIF и один – чувствительным к обоим препаратам. Из 30 чувствительных к OFX культур МБТ 22 были чувствительными к INH и RIF, 3 устойчивыми к обоим препаратам, 2 – устойчивыми к RIF и 3 – устойчивыми к INH.
Определение МИК LVX и MOX для выбранных устойчивых к OFX штаммов МБТ проводили в жидкой среде M7H9 с использованием системы Вactec 960. В качестве референсного контрольного штамма использовали M. tuberculosis H37Rv ATCC 25618, чувствительного ко всем ПТП. Конечные концентрации LVX в пробирках со средой MGIT колебались в пределах от 0,125 до 32,0 мкг/мл и MOX от 0,063 до 10,0 мкг/мл. Устойчивость определяли при МИК 2 мкг/мл для LVX и 0,5 мкг/мл для MOX [93].
MOX был выбран как один из наиболее эффективных препаратов последнего поколения фторхинолонов, который в исследованиях in vivo и in vitro показал высокую активность и наименьшее значение МИК в отношении МБТ и МБТ-МЛУ [64].
Мутации в гене gyrA были выявлены в 36 из 38 культур МБТ, устойчивых к OFX, и в двух в гене gyrB (Asn538Asp и Asp500His). Из 30 чувствительных штаммов МБТ в 29 мутации в этих генах отсутствовали, в одном была выявлена мутация в гене gyrB с заменой Arg485His. Результаты представлены в таблице 10.
Значение МИК LVX и MOX для 30 чувствительных культур МБТ, включая штамм с заменой Arg485His в гене gyrB, колебались в пределах 0,125 – 1,0 мкг/мл и 0,063 – 0,25 мкг/мл соответственно. В то время как МИК этих же препаратов для 38 устойчивых МБТ превышали данные значения (Таблица 10). Для штаммов МБТ с различными нуклеотидными заменами в 94 кодоне значения МИК для LVX составили 2,0 – 16,0 мкг/мл и 0,5 – 2,0 мкг/мл для MOX. Значения МИК препаратов для штаммов МБТ с мутацией Ala90Val также колебались в этих пределах. Из девяти штаммов МБТ с этой заменой у пяти определена умеренная и высокая ЛУ к LVX (МИК 4,0 и 8,0 мкг/мл) и к MOX (МИК 1,0 и 2,0 мкг/мл) и у четырех – низкий уровень устойчивости к данным препаратам. У штаммов с мутацией Ser91Pro установлен низкий уровень устойчивости к LVX (МИК 2,0 мкг/мл) и умеренный к MOX (МИК 1,0 мкг/мл).
Двойные мутации в гене gyrA ДНК МБТ были выявлены как при высоких значениях МИК 32,0 и 8,0 мкг/мл для LVX и MOX (Asp94Gly и Ala90Va), при умеренных МИК 4,0 мкг/мл для LVX и высокой 2,0 мкг/мл для MOX (Asp94Gly и Asp94Asn), так и при низкой 2,0 мкг/мл для LVX и при умеренной 1,0 мкг/мл для MOX (Gly88Ala и His70Arg, Asp94Tyr и Ala90Val). Однако для МБТ с определенными заменами в 94 кодоне (типами мутаций) МИК LVX и MOX имели высокие и умеренные значения. Из 13 штаммов МБТ с заменой Asp94Gly для 12 (92,3%) значения МИК LVX составили 4,0 мкг/мл и 2,0 мкг/мл MOX. Для мутаций Asp94Tyr и Asp94His определен высокий уровень устойчивости к LVX (МИК 4,0 мкг/мл) и к MOX (МИК 1,0 и 2,0 мкг/мл). Для МБТ с мутацией Gly88Cys определены высокие значения МИК LVX и MOX 8,0 и 4,0 мкг/мл соответственно.
Для штаммов МБТ с мутациями в гене gyrB Asn538Asp и Asp500His значения МИК LVX составили 2,0 и 4,0 мкг/мл (низкий и высокий уровень устойчивости) соответственно. Для MOX эти значения были наименьшими – 0,5 мкг/мл. В то же время S. Malik и соавторы (2012) в своей работе показали, что замена Asp500His связана только с устойчивостью к OFX и LVX, но не к MOX, а мутация Asn538Asp – ко всем фторхинолонам [71]. В работе A. Panel и соавторов (2011) было показано, что замена Asn538Asp связана с устойчивостью ко всем фторхинолонам [81]. В нашем исследовании данные замены приводили к низкому уровню устойчивости с наименьшим значением МИК (0,5 мкг/мл) MOX.
Таким образом, из полученных результатов следует, что мутации в гене gyrA и две замены Asn538Asp и Asp500His в гене gyrB связаны с перекрёстной устойчивостью МБТ к фторхинолонам. Мутация Arg485His в гене gyrB не приводит к устойчивости МБТ к LVX и MOX. Высокий уровень устойчивости к обоим препаратам связан с заменами в 94 кодоне гена gyrA Asp94Gly, His, Tyr, в 88 Gly на Cys и двумя двойными мутациями Asp94Gly и Asp94Asn, Asp94Gly и Ala90Val. Напротив, мутация Asn538Asp в гене gyrB связана с низким уровнем устойчивости МБТ к обоим препаратам, а Asp500His – с умеренным к LVX и низким к MOX.
