Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Современные бактериологические методы определения чувствительности Mycobacterium tuberculosis к противотуберкулезным препаратам
1.1.1 .Определение чувствительности Mycobacterium tuberculosis к противотуберкулезным препаратам на « плотных средах
1.1.2.Определение чувствительности Mycobacterium tuberculosis к противотуберкулезным препаратам на жидких средах
1.2. Молекулярные механизмы множественной лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis .
1.2.1. Устойчивость к рифампицину 17
1.2.2. Устойчивость к изониазду 21
1.3. Молекулярно-биологические методы определения мутаций, ведущих к становлению резистентности Mycobacterium tuberculosis к противотуберкулезным препаратам 29
1.3.1 Секвенирование ДНК 29
1.3.2. Метод денатурирующего градиентного гель электрофореза - DGGE (Denaturation Gradient Gel Electrophoresis)
1.3.3. Метод несовершенного дуплекса (CMC -Chemical Mismatch Cleavage) 32
1.3.4. Метод гетеродуплексного анализа (ПЦР - ГДА) 32
1.3.5. Метод выявления мутаций, приводящих к полиморфизму длин рестрикционных фрагментов ДНК (ПДРФ) (restriction fragments length polymorphism -RFLP)
1.3.6. Обнаружение мутаций путем оценки конфор-мационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК (single-stranded conformation polymorphism-SSCP)
1.3.7. Определение ЛУ МБТ методом гибридизации на олигонуклеотидном микрочипе
Глава 2. Материал и методы исследования
2.1. Пациенты и клинические образцы
2.2. Сбор материала
2.3. Определение лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis
2.3.1. Подготовка проб для «ТБ-БИОЧИП»
2.3.2. Условия проведения полимеразной цепной реакции
2.3.3. Проведение гибридизации
2.3.4. Регистрация результатов гибридизации
2.4. Определение устойчивости к изониазиду путем выявления мутаций в гене kasA методом конформа-ционного полиморфизма одноцепочечных фрагментов (SSCP)
2.4.1, Подготовка проб
2.4.2. Условия проведения полимеразной цепной реакции
2.4.3. Выявление мутаций в гене kasA
2.5. Статистическая обработка данных
Глава 3. Собственные исследования Сравнение эффективности выявления Mycobacterium tuberculosis, чувствительных и резистентных к рифампицину и изониазиду, методом «ТБ-БИОЧРШ» и бактериологическими методами в культурах и респираторных образцах
3.1. Определение лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis бактериологическими методами
3.2. Оценка эффективности выявления ДНК Mycobacterium tuberculosis и определения ее чувствительности к рифампицину и изониазиду в респираторных образцах с помощью тест-системы «ТБ-БИОЧИП»
3.3. Оценка эффективности выявления ДНК Mycobacterium tuberculosis и определения ее чувствительности к рифампицину и изониазиду, с помощью «ТБ-БИОЧИП» в культурах
3.4. Анализ сочетания мутаций в ДНК Mycobacterium ґибегси/аш, выделенных от больных, исследованных с помощью «ТБ-БИОЧИП»
3.4.1. Анализ сочетания мутаций в ДНК Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных с впервые выявленным туберкулезом
3.4.2. Анализ сочетания мутаций в ДНК Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных с хроническим течением туберкулеза
Глава 4. Анализ мутаций в гене kasA Mycobacterium tuberculosis с помощью метода конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов (SSCP)
4.1 . Выявление мутаций в гене kasA Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных с впервые выявленным туберкулезом легких, методом SSCP
4.2. Выявление мутаций в гене kasA Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных с хроническим течением туберкулеза, методом SSCP
Заключение 77
Выводы 91
Список литературы 93
- Современные бактериологические методы определения чувствительности Mycobacterium tuberculosis к противотуберкулезным препаратам
- Определение лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis
- Определение лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis бактериологическими методами
- Выявление мутаций в гене kasA Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных с впервые выявленным туберкулезом легких, методом SSCP
Введение к работе
Одной из основных причин увеличения числа больных туберкулезом в России в настоящее время является широкое распространение Mycobacterium tuberculosis, устойчивых к противотуберкулезным препаратам. Наиболее опасными в клиническом и эпидемиологическом плане являются штаммы с множественной лекарственной устойчивостью, характеризуемые наличием одновременной лекарственной устойчивости к рифампицину и изониазиду [31, 33, 80, 151].
Согласно статистическим данным в Москве в 2003 году Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью обнаружены у 7,6% больных с впервые выявленным туберкулезом легких и у 19,2% пациентов с хроническим течением заболевания [17].
Микробиологические методы диагностики и определения лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis являются достаточно точными и надежными, однако, получить видимый рост возбудителя на плотной питательной среде возможно только через 6-8 недель, что существенно замедляет процесс верификации диагноза. Для определения лекарственной чувствительности на плотной среде Левенштейна-Йенсена требуется еще 3-4 недели, в связи с чем, выбор обоснованного режима химиотерапии откладывается на 2-3 месяца, а назначение про-тиивотуберкулезных препаратов чаще всего носит эмпирический характер.
Для сокращения времени культуральной диагностики туберкулеза были разработаны автоматизированные бактериологические системы ВАСТЕС MGIT960 (Becton Dickinson) и МВ/ВасТ (BioMerieux), в которых рост микобактерий происходит на жидкой питательной среде. Однако и в этом случае выявление возбудителя в диагностическом материале
7 и определение его лекарственной чувствительности занимает около 3-4 недель [9,10].
Внедрение во фтизиатрию молекулярно-биологических методов дало возможность существенно сократить сроки определения лекарственной чувствительности микобактерий. В настоящее время известны гены Mycobacterium tuberculosis, кодирующие ферменты, которые взаимодействуют с лекарственными препаратами, и появление мутаций в этих генах приводит к становлению резистентности к противотуберкулезным препаратам [1,35,39,40].
Молекулярно-биологические методы обладают высокой точностью и надежностью и многие из них позволяют не только выявить, но и охарактеризовать мутации, возникшие в геноме микобактерий.
Методы определения мутаций различны. Как правило, они совмещают в себе клонирование исследуемого участка гена путем полимераз-ной цепной реакции и детекции полученных ампликонов путем прямого секвенирования ПЦР-продукта, определения полиморфизма длин рест-рикционных фрагментов (restriction fragments length polymorphism -RFLP), электрофореза продуктов ПЦР в денатурирующем градиентном геле (denaturing gradient gel electrophoresis DGGE)^ гетеродуплексного анализа, исследования конформационного полиморфизма одноцепочеч-ных фрагментов (single-stranded conformation polymorphism - SSCP). Большинство из указанных выше методов применяются, главным образом, в научных целях, хотя их адаптация, в частности метода SSCP, возможна для специализированных лабораторий, занимающихся ПЦР-диагностикой.
Принципиально новая, не имеющая аналогов тест-система «ТБ-БИОЧИП», разработанная в Институте молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН, и апробированная в Московском научно-практическом центре борьбы с туберкулезом в условиях клинико-диагностической лаборатории, включает в себя метод мультиплексной
8 асимметричной ПЦР и гибридизацию на микрочипе. На второй стадии амплификации используется праймер, меченый флуоресцентной меткой CY-5. Полученный меченый ПЦР-продукт подвергается гибридизации.
Микрочип представляет собой небольшое стекло, на которое иммобилизуют в виде правильно расположенных микроячеек небольшие фрагменты ДНК с известной последовательностью нуклеотидов. Данные ячейки объединены в 23 группы таким образом, что сравнение интенсивности флуоресцентных сигналов ячеек каждой группы позволяет сделать заключение о наличии/отсутствии мутации (минорного полиморфизма), приводящей к замене одного аминокислотного остатка. Интерпретация результатов гибридизации осуществляется при сравнении интенсивности флуоресцентных сигналов в ячейках, принадлежащих к одной группе. Максимальный флуоресцентный сигнал свидетельствует о наличии совершенного гибридизационного дуплекса [8].
Данная тест-система позволяет детектировать 29 типов мутаций по гену гроВ и 19 типов мутаций по генам katG, oxyR-ahpC и inhA. С помощью этого чипа удается выявить 80-85% всех случаев наличия микобак-терий с множественной лекарственной устойчивостью у обследуемых больных туберкулезом. Каждый этап адаптирован для условий молеку-лярно-диагностических лабораторий, метод не трудоемок и занимает 48 часов [19].
Известно, что 5-16,8% штаммов возбудителя, резистентных к изо-ниазиду, имеют мутации в гене has А [24, 29, 51]. Поскольку использование мультиплексной полимеразной цепной реакции ограничивает количество анализируемых генов на микрочипе, для выявления мутаций в гене has А, можно использовать метод SSCP. Сочетание метода биологических микрочипов («ТБ-БИОЧИП») и SSCP позволяет охарактеризовать Mycobacterium tuberculosis по пяти наиболее изученным генам, определяющим наличие множественной лекарственной устойчивости.
9 Цель исследования
Определение множественной лекарственной устойчивости и анализ спектра мутаций в генах rpoB, katG, inhA, oxyR-ahpC и has A Mycobacterium tuberculosis, полученных от больных туберкулезом легких, с помощью молекулярно-биологических методов (биологических микрочипов и конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов), адаптированных для условий клинико-диагностической ГШР-лаборатории.
Задачи исследования
Проведение сравнительного анализа частоты выявления множественной лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis бактериологическими методами и с помощью тест-системы «ТБ-БИОЧИП».
Определение доли резистентных к изониазиду Mycobacterium tuberculosis, имеющих мутации в гене kasA, с помощью метода конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов.
Анализ спектра мутаций в Mycobacterium tuberculosis резистентных к рифампицину и изониазиду у больных с впервые выявленным туберкулезом легких с помощью тест-системы «ТБ-БИОЧИП».
Анализ спектра мутаций в Mycobacterium tuberculosis резистентных к рифампицину и изониазиду, у больных с хроническим течением процесса с помощью тест-системы «ТБ-БИОЧИП».
Научная новизна работы
Проведен сравнительный анализ частоты и сроков обнаружения множественной лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis с помощью сочетания методов биологических микрочипов и конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов, по сравнению с классическими бактериологическими методами.
Определен вклад мутаций в гене kasA в общее число Mycobacterium tuberculosis, резистентных к изониазиду.
10 3. С помощью молекулярно-биологических методов впервые проведены одновременные исследования Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных туберкулезом легких, по пяти генам, ответственным за множественную лекарственную устойчивость: rpoB, katG, inhA, oxyR-ahpCu has A.
Практическая значимость исследования
Сочетание методов биологических микрочипов и конформационно-го полиморфизма одноцепочечных фрагментов позволяет в короткие сроки с высокой степенью точности и надежности в полной мере охарактеризовать диагностический материал, получаемый от больных туберкулезом, на наличие Mycobacterium tuberculosis, обладающих множественной лекарственной устойчивостью.
Быстрое определение чувствительности Mycobacterium tuberculosis к рифампицину и изониазиду позволяет назначить пациентам адекватный режим химиотерапии непосредственно после поступления в специализированную клинику или внести коррективы в схему лечения в течение 2-3 суток.
Своевременное определение Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью способствует совершенствованию лечения больных и, в свою очередь, сокращает сроки их пребывания в стационаре, что, соответственно, приводит к уменьшению затрат и расхода лекарственных средств. Материалы диссертации были использованы при составлении методических рекомендаций «Определение множественной лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis молекулярно-биологическими методами», Москва, 2006.
Положения, выносимые на защиту:
1. Сочетание методов биологических микрочипов и конформаци-онного полиморфизма одноцепочечных фрагментов позволяет одновременно идентифицировать Mycobacterium tuberculosis и определить чувствительность возбудителя к рифампицину и изониазиду в более корот-
кие сроки (48 часов), по сравнению с классическими бактериологическими методами и охарактеризовать наличие мутаций одновременно в пяти генах, ассоциированных с резистентностью к данным противотуберкулезным препаратам.
Среди Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных с впервые выявленным туберкулезом легких, преобладали чувствительные к рифампицину и изониазиду. В штаммах с множественной лекарственной устойчивостью выявлялись наиболее распространенные типы мутаций, главным образом, в генах гроВ (531 кодон) и katG (315 ко дон).
Среди Mycobacterium tuberculosis, полученных от больных с хроническим течением туберкулезного процесса преобладали штаммы с множественной лекарственной устойчивостью и высокой вариабельностью сочетания мутаций в исследуемых генах.
Апробация работы
Материалы диссертации были доложены на Европейских респираторных конгрессах, Vienna, Austria, 2003; Glasgow, UK, 2004; Российском съезде фтизиатров, Москва, 2003.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 5 работ.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 110 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, заключения и выводов. В тексте содержится 10 рисунков и 15 таблиц. Библиография включает 155 источников литературы, из них на 33 русском и 122 на иностранном языках.
Современные бактериологические методы определения чувствительности Mycobacterium tuberculosis к противотуберкулезным препаратам
В нашей стране наиболее широко распространен метод абсолютных концентраций, который позволяет обнаружить лекарственно рези 13 стентные клетки в культуре МБТ в течение 3-4 недель [6, 9, 10]. Суть метода состоит в определении концентрации ПТП, которая ингибирует рост микобактерий при выращивании их на средах с различным содержанием препаратов [46]. В соответствии с критериями чувствительности, при постановке опытов на плотных питательных средах рекомендуется пользоваться следующими концентрациями противотуберкулезных препаратов: стрептомицин 10 и 25 мкг/мл; изониазид 1 и 10 мкг/мл; рифам-пицин 40 и 80 мкг/мл; этамбутол 2 и 5 мкг/мл; канамицин 30 и 50 мкг/мл; протионамид (этионамид) 30 и 50 мкг/мл; циклосерин 30 и 50 мкг/мл; теризидон 30 и 50 мкг/мл; капреомицин 30 и 50 мкг/мл; офлоксацин 2 и 10 мкг/мл; ПАСК 1 и 5 мкг/мл [приказ МЗ РФ №109, 2003].
Время, необходимое для выделения МБТ из диагностического материала, и определения их лекарственной чувствительности на плотных питательных средах, составляет 6-10 недель, что является существенным недостатком данного метода, и значительно осложняет своевременную коррекцию проводимого лечения.
В настоящее время в специализированных микробиологических лабораториях в качестве быстрых, воспроизводимых и точных методов определения лекарственной чувствительности (ЛЧ) к препаратам первого ряда применяются одобренные FDA (US Food Drug Administration) методы определения ЛЧ Mycobacterium tuberculosis, выросших на жидких средах. Они зарегистрированы и в Российской Федерации.
ВАСТЕС 460 - первая полуавтоматическая тест-система, разработанная фирмой Becton Dickinson. Радиометрический метод определения ЛЧ на среде 7Н12 с помощью полуавтоматической системы ВАСТЕС 460 до недавнего времени считался одним из наиболее точных [13, 72, 116]. Для выявления возбудителя данным методом используют флаконы с жидкой питательной средой 12В, содержащей меченый изотопом угле 14 рода (14С) субстрат. Размножающиеся микобактерии утилизируют данный субстрат и выделяют радиоактивный углекислый газ І4СОг в пространство над средой во флаконе. В процессе тестирования газ автоматически забирается из флакона, уровень радиоактивности измеряется и регистрируется в виде индекса роста по шкале от 0 до 999. Результат посева считается положительным, если обнаруживается соответствующий уровень ,4CC 2 во флаконах и замеренная радиоактивность превышает заданный порог.
Система предназначена для определения чувствительности МБТ к препаратам первого ряда. Длительность тестирования составляет около месяца (2-3 недели - определение роста МБТ и 4-7 дней - определение ЛЧ). Принципиальным недостатком метода является применение радиоактивных изотопов.
Современные ускоренные автоматизированные бактериологические способы определения чувствительности микобактерии к ПТП первого ряда на жидкой среде с помощью автоматизированных систем ВАСТЕС 960 (Becton Dickinson) и МВ/ВасТ (BioMerieux) разработаны и внедряются в лабораторную практику с середины 90-х годов [National of Clinical Laboratory Standards: Antimycobacterial Susceptibility Testing for Mycobacterium tuberculosis. Tentative standard. NCCLS Document, 1995]. Они дают возможность получить результаты, хорошо сопоставимые с традиционными методами абсолютных концентраций на среде Л-Й или пропорций на среде Middlebrook 7Н10, но в достоверно более короткие сроки. Обе автоматизированные системы позволяют производить тестирование микобактериальных культур, выращенных как на плотной, так и на жидкой средах в приборах соответствующих фирм [National Committeee of Clinical Laboratory Standards: Antimycobacterial Susceptibility Testing for Mycobacterium tuberculosis. Tentative standard. NCCLS Document, 1995]. Bactec MGIT 960 - полуавтоматическая система (постоянный мониторинг сигнала роста) с быстрой колориметрической детекцией. Необходимость в радиоизотопах и риск кросс-контаминации при регистрации результатов отсутствуют. Основным компонентом данной системы является пробирка MGIT (Mycobacteria Growth Indicator Tube) с флуоресцентным индикатором роста - Трис 4,7-дифенил-1,10-фенантролин рутениум хлорид пентагидрат, который заключен под силиконом на дне пробирки и погашен высокими концентрациями кислорода, растворенными в среде. Размножающаяся микробная популяция активно поглощает кислород, высвобождая флуоресцентный компонент, который начинает светиться при ультрафиолетовом облучении. В приборе инкубируются пробирки после внесения диагностического материала, подвергаясь периодическому тестированию в ультрафиолетовом излучении.
Тест на чувствительность занимает от 3 до 14 дней. Штамм считается резистентным, если рост детектируется в контрольной пробирке и в пробирке, содержащей препарат. Образец считается чувствительным, если пробирки с препаратом не флуоресцируют через два дня после роста в контроле. Используют следующие концентрации ПТП: изониазид - 0,1 мкг/мл; рифампицин - 1,0 мкг/мл; этамбутол - 3,5 мкг/мл; стрептомицин - 0,8 мкг/мл. [74, 121].
MB/BacT(BioMerieux) - полуавтоматическая система, в которой используют для выявления роста МВТ технологию колориметрического детектирования углекислого газа, который накапливается в среде в результате метаболизма растущей культуры. Процессорный флакон МВ/ВасТ снабжен природным индикатором, реагирующим на увеличение концентрации углекислого газа просветлением окраски, что сопровождается увеличением коэффициента отражения и регистрируется компьютером.
Определение лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis
Данный метод основан на зависимости свойства плавления (денатурации) небольших двухцепочечных фрагментов ДНК от соотношения AT (аденин-тимин) и GC (гуанин-цитозин) пар в исследуемых фрагментах [18]. Различия в динамике плавления могут быть выявлены путем сравнения подвижности нормальных и мутантных двухцепочечных фрагментов ДНК при их электрофорезе в денатурирующих условиях. Мутации могут изменять температуру плавления локальных участков ДНК, называемых доменами. Совокупность доменов плавления определенного участка ДНК образует профиль плавления. Домены ДНК в зависимости от последовательности нуклеотидов в условиях постоянной температуры будут плавиться при определенных концентрациях денатурирующего агента. В результате положение фрагментов в геле по завершении электрофореза будет зависеть от профилей их плавления и, в конечном счете, от нуклеотидной последовательности доменов плавления [22]. При исследовании фрагментов до 600 п.н. эффективность выявления мутаций составляет 95%. К недостаткам метода следует отнести техническую сложность получения равномерного градиента денатурирующего агента в полиакриламидном геле, а также высокую стоимость искусственно синтезированных GC-концов, которые присоединяясь к концам амплифицированной ДНК, выполняют роль зажимов, что резко повышает возможность обнаружения всех точечных мутаций, независимо от их локализации внутри исследуемого фрагмента [7].
Метод основан на способности некоторых химических агентов разрывать нить ДНК в месте локализации не спаренного основания [22]. Так, цитозин чувствителен к действию гидроксиламина, а тимин - к действию осмия тетраоксида. Некоторые модификации метода используют чувствительность тимина и гуанина к карбодиимину [7]. Выявление мутаций осуществляется при помощи меченых ДНК-зондов, соответствующим, как правило, ДНК чувствительных МБТ. При проведении анализа эталонную меченую ДНК смешивают с избытком тестируемой ДНК или РНК. Смесь нагревают до полной денатурации двухцепочечных молекул и затем охлаждают, чтобы создать условия для образования дуплексов. При наличии мутаций в тестируемых образцах ДНК в гетеродуп-лексах, возникших в результате гибридизации между однонитиевыми фрагментами эталонной и тестируемой ДНК, образуются места негомологичного спаривания. После обработки соответствующими химическими агентами, локализация точечных мутаций определяется путем электрофореза и радиоавтографии [7]. Появление укороченных фрагментов ДІЖ на электрофореграмме в нижней части геля свидетельствует о наличии мутантного сайта. Современные модификации данного метода позволяют выявить 95-100% мутаций [66]. Однако необходимость использования радиоактивных меток не позволяют применять его широко.
Весьма близким по принципу к CMC-методу является метод расщепления гетеродуплексов РНКазой А (метод mismatch). Этот метод используют для определения мутации в ДНК МБТ, обусловливающих устойчивость к рифампицину. Он основан на способности двухцепочеч-ной РНК противостоять расщеплению РНКазой А [143].
ДНК-мишень амплифицируют, используя праймеры, один из которых содержит РНК-полимеразный промотер. ДНК МБТ, чувствительных к препарату, амплифицируется с такими же праймерами, однако промотер находится на обратном праймере. Полученные ПЦР-продукты объединяют в реакции транскрипции, используя необходимую РНК-полимеразу. Комплементарные транскрипты обоих ПЦР-продуктов гиб-ридизуют, а полученные гибриды подвергают действию РНКазы. Наличие мутаций в тестируемом транскрипте приводит к образованию несовершенного дуплекса при гибридизации с контрольным транскриптом. В точках некомплементарности эти дуплексы будут расщепляться. Полученные целые и расщепленные продукты детектируются с помощью электрофореза в агарозном геле.
Этот метод прост в исполнении и относительно дешев. Однако при транскрипции и последующими манипуляциями с РНК требуется много предосторожностей для защиты от контаминации РНКазой [7, 24].
Данная методика, описанная D. Williams и соавт. (1996) [148], основана на том, что ПЦР-продукт, полученный от исследуемых микроорганизмов и чувствительных контрольных штаммов смешивается для получения гибридной ДНК. Наличие резистентного штамма приводит к образованию в двухцепочечном фрагменте ДНК не спаренных оснований (даже одной пары), что изменяет конформацию такого гетеродуп-лекса, и, следовательно, электрофоретическую подвижность фрагмента при проведении гель электрофореза в определенных условиях. Несмотря на свою простоту, метод также позволяет находить до 80% мутаций [36, 148]. В частности, он применяется для выявления МБТ, устойчивых к рифампицину с мутациями на участке гена гроВ из 305 п.н. [106]. Данное исследование не требует радиоактивных соединений, что делает его подходящим для клинических лабораторий.
Определение лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis бактериологическими методами
Во всех несовпадающих вариантах возможно присутствие штаммов возбудителя с различной чувствительностью, которые при росте на средах с препаратами могут вести себя по-разному, а выявиться с помощью «ТБ-БИОЧИП» могут присутствующие в большем количестве микобак-терии.
Особый интерес представляют штаммы, в которых перед посевом на среды с ПТП с помощью «ТБ-БИОЧИП» выявляются МЛУ МБТ, их количество составляет 41,7% из всех штаммов, результаты которых по чувствительности не совпали. При росте на среде Л-И они вырастают как резистентные к рифампицину (33,3%) так и к изониазиду (8,3%). Эти данные подчеркивают важность момента определения ЛЧ штаммов перед посевом на среды с ПТП. Случаи, когда перед посевом на среды с ПТП штамм определяется как чувствительный, а оказывается резистентным к какому-то из препаратов, составляет значительный процент (16,7%). В данной ситуации причиной различия может быть как наличие в штамме микобактерий с разной чувствительностью к ПТП, так и отсутствие на чипе компрометирующих олигонуклеотидов, выявляющих мутацию, находящуюся видимо вне изучаемого фрагмента гена. Пли резистентность к изониазиду не связана с мутациями в исследованных фрагментах генов. Для любой из тест-систем, применяемых в медицине, подобный процент считается вполне допустимым. Поскольку речь идет о назначении больному адекватного лечения, было бы надежным применение параллельно метода, например, исследования на жидких средах.
Таким образом, сравнение двух методов (метод абсолютных концентраций на среде Л-Й и метод «ТБ-БИОЧИП») по определению лекарственной чувствительности МБТ, выделенных из диагностического материала и культур показало, что: - по определению чувствительности представленными методами совпадение результатов составляет 92,3%, а по резистентности 95,7%; - определение лекарственной чувствительности микобактерий, выделенных из респираторных образцов, показало, что только для 2,8% случаев полученные результаты не совпадали; - исследование штаммов, которые не выросли на плотной среде Л-Й (12), с помощью «ТБ-БИОЧИП» показало, что среди них присутствуют штаммы резистентные к одному из препаратов, с множественной лекарственной устойчивостью (41,6%)) и чувствительные; - определение лекарственной чувствительности МБТ двумя методами в культурах, выделенных от больных туберкулезом, показало также большой процент совпадения (90,5% для чувствительных и 90,9% для резистентных); - в 7,4% случаях данные по определению чувствительности МБТ в культурах двумя методами не совпали, что является вполне допустимым для тест-систем; - важным является тот факт, что 3,1% штаммов перед посевом на среды с препаратами были с множественной лекарственной устойчивостью, а выросли резистентными только к одному из изучаемых препаратов, что подчеркивает важность определения микобактерий с множественной лекарственной устойчивостью в биологическом образце. 3.4. Анализ сочетания мутаций в ДНК Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных, исследованных с помощью «ТБ-БИОЧИП» В ранее проведенных исследованиях, как правило, изучали 1-2 наиболее распространенные мутации в каждом гене МБТ, связанные с развитием лекарственной устойчивости [42, 52, 55, 79]. С помощью тест-системы «ТБ-БИОЧИП» в четырех генах можно определить около 50 мутаций, что значительно расширяет возможности выявления МЛУ штаммов возбудителя. 3.4.1. Анализ сочетания мутаций в ДНК Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных с впервые выявленным туберкулезом Определение типов мутаций в ДНК МБТ, выделенных из 68 респираторных образцов и культур, полученных от 55 больных с впервые выявленным туберкулезом легких, не показало большого разнообразия. Результаты исследования представлены в таблице 7. Полученные данные показали, что у находящихся на лечении в МНПЦБТ больных с впервые выявленным туберкулезом легких преобладали чувствительные МБТ - 53 штамма (77,9%). Резистентных штаммов МБТ установлено 15 (22,1%), причем обладающих резистентностью к рифампицину не выявлено, в то время как резистентных к изониазиду выявлено 8 (11,8%). В 7 случаях (10,3%) обнаружены МБТ с МЛУ. Штаммов с мутациями во всех четырех изучаемых генах не обнаружено. В трех генах имелись мутации только у двух штаммов (причем оба обладали МЛУ), в двух генах - у шести (пять из них обладали МЛУ), и МБТ с мутацией в одном гене были резистентными к изониазиду. В 7 резистентных к изониазиду штаммах определена мутация только в одном гене. Анализ типов сочетания мутаций в ДНК Mycobacterium tuberculosis у больных с впервые выявленным туберкулезом легких Анализ типов сочетания мутаций в ДНК МБТ, выделенных от больных с впервые выявленным туберкулезом легких показал, что для МБТ, резистентных к изониазиду, имеется только три разных варианта генотипов и для штаммов с МЛУ - так же три разных варианта.
Выявление мутаций в гене kasA Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных с впервые выявленным туберкулезом легких, методом SSCP
Сопоставление результатов определения лекарственной чувствительности культур Mycobacterium tuberculosis, выращенных на среде Ле-венштейна-Иенсена, показало высокий процент совпадения результатов, полученных с помощью «ТБ-БИОЧИП» и метода абсолютных концентраций (90,5% для чувствительных и 90,9% для резистентных штаммов). При исследовании с помощью метода абсолютных концентраций 42 (26,1%) штамма были определены как чувствительные к рифампицину и изониазиду, 29 (18,0%) - как резистентные к одному из препаратов и 90 (55,9%) как множественно лекарственно устойчивые, в то время как при исследовании на «ТБ-БИОЧИП» только 40 (24,8%) были определены как чувствительные, 27 (16,8%) - как резистентные к одному из препаратов и 94 (58,4 %) обладали множественной лекарственной устойчивостью. В 7,4% случаях были несовпадения результатов при определении лекарственной чувствительности двумя методами.
В основе расхождения полученных результатов могут быть следующие причины: - с помощью биологических микрочипов можно выявить наиболее часто встречающиеся мутации. Новые мутации, которые могут появиться в изучаемых и не изучаемых кодонах исследованных генов на чипах выявить нельзя. В частности, как показало исследование методом SSCP (см. ниже) мутация в одном из образцов ДНК микобактерий, который был определен бактериологическими методами как резистентный к изо 82 ниазиду, а с помощью «ТБ-БИОЧИП» как чувствительный, была локализована в гене kasA, поэтому ее не удалось выявить; - из литературы известно, что в популяции Mycobacterium tuberculosis больного могут присутствовать микобактерии с различной чувствительностью к противотуберкулезным препаратам [53]; - рост некоторых микобактерии, выше в присутствии противотуберкулезных препаратов [54]; - кроме того, согласно некоторым литературным данным, Mycobacterium tuberculosis с большим количеством мутаций могут обладать меньшей жизнеспособностью [54]. В данной ситуации, скорее всего, Mycobacterium tuberculosis, устойчивых к рифампицину и изониазиду, оказалось в процентном соотношении меньше, чем резистентных к одному из данных препаратов и при росте с противотуберкулезными препаратами количество последних превалировало над количеством микобактерии с множественной лекарственной устойчивостью, поэтому «ТБ-БИОЧИП» их и выявляет.
Особый интерес представляют данные, когда в респираторном образце (один случай) или культуре (два случая) с помощью чипа выявляли Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью, а бактериологическими методами обнаруживали микобактерии, устойчивые только к одному из препаратов. По всей вероятности, микобактерии с множественной лекарственной устойчивостью частично погибли и поэтому при исследовании культуры, выросшей на среде Ле-венштейна-Иенсена, с помощью биочипов их не выявили.
Таким образом, применение биологических микрочипов помогает значительно сократить время анализа, определить лекарственную чувствительность Mycobacterium tuberculosis в мокроте и определить лекарственную чувствительность в штаммах, которые могут не вырасти на среде Левенштейна-Йенсена. Согласно литературным данным, в 2003 году, в Москве у больных с впервые выявленным туберкулезом количество штаммов, обладающих множественной лекарственной устойчивостью, составило 7,6%. Среди контингента больных с хроническим течением туберкулеза ее уровень достигал 20% [17]. Таким образом, проблема максимально быстрого и специфического выявления штаммов микобактерий с множественной лекарственной устойчивостью у больных туберкулезом является весьма важной.
Нами было проанализировано 68 респираторных образцов и культур микобактерий, полученных от 55 больных с впервые выявленным туберкулезом легких.
Изучение множественной лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных с впервые выявленным туберкулезом легких показало, что среди штаммов преобладали чувствительные — 77,9%. Mycobacterium tuberculosis, устойчивые к изониазиду выявили в 11,8% случаев. В тоже время, микобактерий с множественной лекарственной устойчивостью были обнаружены в 10,3%. Резистентных к рифампицину штаммов выявлено не было.
Известно, что устойчивость к рифампицину в 95% случаев связана с мутациями в гене гроВ, кодирующем й-субъединицу РНК-полимеразы Mycobacterium tuberculosis [40, 42, 105]. В настоящее время известно более 40 мутаций в этом гене, обусловливающих резистентность к рифампицину. В основном они сосредоточены в коротком сегменте гена гроВ, состоящем из 81 основания и кодирующем аминокислоты 507-533 [113]. Примерно 4% штаммов не имеют мутаций в этом сегменте [1]
Резистентность к изониазиду обусловливается мутациями в четырех, основных генах: katG, inhA, oxyR-ahpC и has А. Мутации в гене katG встречаются в 50-79% устойчивых к изониазиду штаммов возбудителя, по данным М. Stoecle и соавт. (1993) [131] и более чем в 90%, по данным X. Chen и соавт. (2005) [51]. Устойчивость к изониазиду благодаря мутациям в гене inhA, возникает в 10-20% случаев. Мутации в межгенной области генов ahpC и oxyR встречаются, приблизительно в 10% резистентных к изониазиду штаммах [25], и являются компенсаторной реакцией на снижение каталазно-пероксидазной активности, контролируемой генами katG и inhA. [124]. Мутации в гене has А характерны для 4-16,8% штаммов, имеющих резистентность к изониазиду.
По литературным данным, определение лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis одновременно к рифампицину и изониазиду проводили, как правило, по генам гроВ и katG, причем изучали кодоны 531 и 315, в которых мутации встречаются наиболее часто, хотя имеются исследования по выявлению мутаций, ответственных за резистентность к данным противотуберкулезным препаратам и в других кодонах [51, 92, 113]. Что касается географического анализа устойчивости к рифампицину, то на Филиппинах она определяется в 531 и 510 кодонах гена гроВ, в Кении в 526 и 531 кодонах [62, 63, 75], в Индии в 531, 530, 511 и 514 кодонах [132]. Таким образом, изучение мутаций в 531 кодоне гена гроВ и 315 кодоне гена katG оправданы, так как они чаще всего встречаются в штаммах микобактерий, полученных от больных туберкулезом в разных странах.
