Содержание к диссертации
Список сокращений 5
Введение 6
Глава 1. Обзор литературы 16
1.1 .Введение 16
1.2.Молекулярно-генетические основы резистентности
Mycobacterium tuberculosis к изониазиду 19
1.3.Молекулярные механизмы устойчивости Mycobacterium
tuberculosis к рифампицину 27
ІАГенотипирование штаммов Mycobacterium tuberculosis
по ДНК 31
1.5.Культуральные и молекулярные методы диагностики
чувствительности Mycobacterium tuberculosis к противо
туберкулезным препаратам 37
1.5.1 .Фенотипические методы диагностики 37
1.5.1.1.Определение чувствительности Mycobacterium tuberculosis
к противотуберкулезным препаратам на плотных ере- 37
дах
1.5.1.2.Определение чувствительности Mycobacterium tuberculosis
к противотуберкулезным препаратам на жидких ере- 39
дах
1.5.1.3. Анализ чувствительности Mycobacterium tuberculosis к 39 противотуберкулезным препаратам с помощью бактерио-
фагов(Р/га В-анализ)
1.5.2.Молекулярно-генетические методы определения чув
ствительности Mycobacterium tuberculosis к противоту
беркулезным препаратам 40
1.5.2.1.Методы пробоподготовки биологических образцов и вы
деления ДНК Mycobacterium tuberculosis 40
1.5.2.2.Методы детекции мутаций, ассоциированных с лекарст
венной устойчивостью 44
Глава 2. Материалы и методы 58
2.1 .Обследованные пациенты 58
2.2.Культуры Mycobacterium tuberculosis, выделенные
от больных туберкулезом 58
2.3.Методы исследования 59
2.3.1.Определение лекарственной чувствительности
Mycobacterium tuberculosis к рифампицину и изониазиду
бактериологическими методами 59
2.3.2.Обработка клинического материала для молекуляр
ных исследований 59
2.3.3.Выделение ДНК Mycobacterium tuberculosis из диаг
ностического материала 60
2.3.4 .Подбор праймеров 61
2.3.5.Определение ДНК Mycobacterium tuberculosis 62
2.3.5.1 .Реакция амплификации 62
2.3.5.2.Регистрация и анализ продуктов амплификации 64
Проверка специфичности полимеразной цепной реакции 66
Выявление мутаций в гене rpoB Mycobacterium tuberculosis методом гетеродуплексного анализа 66
2.3.7.1 .Получение универсального гетеродуплексного генератора 66
Прямое секвенирование ПЦР-фрагментов 70
Определение чувствительности Mycobacterium tuberculosis к рифампицину с помощью биологических микрочипов «ТБ-БИОЧИП-(РИФ)» 70
2.3.10.Метод конформационного полиморфизма одноцепо-
чечных фрагментов (SSCP) 72
2.3.10.1.Определение мутаций в генах, ответственных за рези
стентность к изониазиду katG, oxyR/ahpC, inhA, kasA 72
2.3.11. Выявление микобактерий резистентных к рифампи
цину и изониазиду с помощью биологических микрочи
пов «ТБ-БИОЧИП» 75
2.3.12.Статистическая обработка 75
Глава 3. Собственные исследования 78
3.1. Методические подходы применяемые для повышения
эффективности выделения ДНК Mycobacterium
tuberculosis и определения ее лекарственной чувстви
тельности 78
3.1.1 .Забор образцов 79
3.1.2.Пробоподготовка 79
3.1.3.Выделение ДНК 81
3.1.4.Определение Mycobacterium tuberculosis в зависимости
от формы туберкулеза и стадии туберкулезного процес- 90
са
3.2.Определение лекарственной чувствительности
Mycobacterium tuberculosis к рифампицину методом ге
теродуплексного анализа 95
3.3.Определение чувствительности Mycobacterium
tuberculosis к рифампицину с помощью биологических
микрочипов «ТБ-БИОЧИП-(РИФ)» 107
\
3.4. Определение чувствительности Mycobacterium
tuberculosis к изониазиду методом конформационного
полиморфизма одноцепочечных фрагментов 123
3.5.Определение лекарственной устойчивости
Mycobacterium tuberculosis к рифампицину и изониази
ду методом биологических микрочипов «ТБ-
БИОЧИП» 130
Заключение 151
Выводы 183
Список литературы 185
Список сокращений
ВГЛУ - внутригрудные лимфатические узлы
ГДА - гетеро дуплексный анализ
И - изониазид
ЛЧ - лекарственная чувствительность
ЛУ -лекарственная устойчивость
МЛУ - множественная лекарственная устойчивость
МНПЦБТ - Московский городской научно-практический центр борь-
бы с туберкулезом Департамента здравоохранения города Москвы
Введение к работе
Актуальность работы. Одной из основных причин повышения заболеваемости туберкулезом является увеличение числа лиц, инфицированных Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью, которые определяются как Mycobacterium tuberculosis, резистентные одновременно к изониазиду и рифампицину, независимо от наличия или отсутствия устойчивости к другим препаратам [Iseman М., Madsen D., 1989; Shinder D. et al, 1991; Kochi A. et al, 1993; Espinal M. et al, 2001; Gillespie S., 2002].
У больных с впервые выявленным туберкулезом легких уровень Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью колеблется от 1,7% в Барселоне [Tudo G. et al., 2004], 5,0 - 7,0%о в Москве [Литвинов В.И. и др., 2004, 2005], до 10,0% в ряде других стран Европы [Nutini S., et al., 1998; van Deun A. et al., 1999; Gonzavez N. et al., 1999], хотя имеются публикации и о более высоком проценте 21,8%) в Эстонии [Kruuner A. et al., 1998; Leimane V., Leimans J., 1998], до 40,0%> в отдельных регионах Украины [Чернушенко Е.Ф., Клименко М.Ю., 1999], до 57,7% в Казахстане [Ильина Т.Я. и др., 2003]. По данным А.Г.Хоменко, В.И.Чуканова (1999), А.К.Стрелис и соавт.(2001), Б.И. Вишневского, Е.Б. Вишневской (2003) в разных регионах России множественная лекарственная устойчивость Mycobacterium tuberculosis в 2001 году зафиксирована от 8,0% до 61,0% у впервые выявленных больных.
В Москве у больных с хроническим течением туберкулеза легких, обнаруживают Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью в пределах 13,0-15,0%) [Сельцовский П.П. и др., 2005]. Эффективность лечения больных с множественно-лекарственно устойчивыми Mycobacterium tuberculosis составляет не более 50,0% [Coninx R. et al., 1999; Dye С. et al., 2002].
Во фтизиатрической практике до последнего времени туберкулез диагностируют на основании данных клинико-рентгенологических исследований с подтверждением роста Mycobacterium tuberculosis на плотных средах
7 («золотой стандарт»), хотя известно, что Mycobacterium tuberculosis вырастают на них не раньше, чем через 4-6 недель. Применение автоматизированных систем с использованием жидких сред [МВ/ВасТ или Bact/Alert 3D (BioMerieux) и Bactec MGIT 960 (Becton Dickinson)] сокращает время выделения возбудителя до 2 - 3 недель [Rohner P. et al., 1997; Brunello F., Fontana R., 2000; Somoskovi A. et al, 2001].
Определение чувствительности Mycobacterium tuberculosis к противотуберкулезным препаратам, в зависимости от применяемого метода, удлиняет время анализа еще на 1 - 3 недели и, как правило, больным назначают противотуберкулезные препараты, независимо от того, каким штаммом они заражены, хотя подбор схемы лечения, учитывающей характер чувствительности Mycobacterium tuberculosis у больного, в значительной степени определяет ее эффективность [Егоров A.M. и др., 2000; Соколова Г.Б. и др., 2000; Мишин В.Ю, 2001, 2005]. Кроме того, известно, что 6,0 - 7,0% пациентов, у которых выявляли Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью, умирают от лекарственной непереносимости и более чем у 16,0% из них развивается почечная недостаточность [Мишин В.Ю. и др., 2005; Olle-Goigl.etal, 1999].
Таким образом, вопрос разработки и внедрения экспресс-методов де-
* текции и определения лекарственной чувствительности Mycobacterium
tuberculosis, остается одной из самых актуальных проблем фтизиатрии.
В последние годы, в связи с внедрением в практику фтизиатрии методов молекулярной биологии, которые отличаются быстротой анализа, высокой чувствительностью и специфичностью, выявление микобактерий и определение их генотипических характеристик значительно облегчает постановку диагноза и назначение больному адекватного лечения. На данный период времени расшифрован геном Mycobacterium tuberculosis H37Rv, который
> имеет длину 4411529 пар нуклеотидов и включает в себя примерно 4000 ге-
нов [Cole S. et al, 1998]. Для ряда генов известны мутации, ответственные за изменение фенотипических свойств микобактерий, связанных с возникнове-
8 ниєм резистентности к противотуберкулезным препаратам. Установлено, что
Mycobacterium tuberculosis с различными типами мутаций требуют для предотвращения размножения разные дозы лекарственных препаратов [Williams D. et al., 1998; Stepanshina V. et al., 1999; Van Soolingen D. et al, 2000].
В настоящее время известно, что резистентность к изониазиду определяется мутациями в 4 основных генах: katG, inhA, ahpC/oxyR, kasA и еще некоторых других, менее изученных: fur A, ndh [Rouse D. et al., 1995; Musser J., 1995; Blanchard J., 1996; Rapiti E. et al., 1998; Riska P. et al., 2000; Zhang Y. et al., 2005].
Более 95% случаев резистентности к рифампицину у больных туберкулезом обусловлено мутациями в коротком фрагменте (81 пара нуклеотидов) гена гроВ, кодирующего /?-субъединицу РНК-полимеразы Mycobacterium tuberculosis [Генерозов Э.В. и др., 2003; Telenti A. et al., 1993; Kapur V. et al., 1994; Ramaswamy S, Musser J., 1998; Chaves F. et al, 2000].
Для выявления мутаций в молекулярной биологии применяют, как правило, сочетание нескольких методов. Прежде всего, это стадия полимеразной цепной реакции, с помощью которой происходит клонирование исследуемой части ДНК, и далее анализ полученных ампликонов с помощью рестриктаз, методом конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов
' или различными видами гибридизации с соответствующими олигонуклеоти-
дами. В большинстве случаев с помощью этих методов мутации в исследуемой области ДНК только выявляются. Для определения типа мутаций вводятся дополнительные стадии, что делает анализ более длительным [Патрушев Л.И., 2000] или используют дорогостоящие методы секвенирования, не имеющие в настоящее время практической перспективы.
В Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН под руководством академика А.Д.Мирзабекова была разработана технология
биологических микрочипов, кардинально изменившая возможности молеку-
лярно-диагностического анализа Mycobacterium tuberculosis [Mikhailovich V. et al, 2001]. С помощью «ТБ-БИОЧИП-(РИФ)» можно определить чувстви-
9 тельность к рифампицину, а «ТБ-БИОЧИП», предоставляет возможность
одномоментного выявления чувствительности Mycobacterium tuberculosis к рифампицину и изониазиду с определением 29 типов мутаций к первому препарату по гену гроВ и 19 типов мутаций ко второму препарату по генам katG, oxyR, inhA. Этот метод в 2004 году получил регистрационное удостоверение Федеральной службы РФ по надзору в сфере здравоохранения и социального развития. Принципиальным преимуществом этих тест-систем являются сроки получения результатов (48 часов) при сохранении 95% чувствительности и специфичности определения при выявлении Mycobacterium tuberculosis и определении ее лекарственной устойчивости.
В то же время, с помощью используемых молекулярно-генетических методов выявляется не весь спектр мутаций в целом ряде генов Mycobacterium tuberculosis, ответственных за множественную лекарственную устойчивость, нет единого технологического протокола всех этапов выполнения молекулярных исследований, позволяющих определить множественную лекарственную устойчивость, и совершенно нет данных о возможности их применения в клинико-лабораторной практике фтизиатрических учреждений.
Цель исследования. В связи с вышесказанным, целью данного диссертационного исследования являлась разработка и внедрение в практику единого протокола использования в клинике молекулярно-биологических экспресс тест-систем, позволяющих выявлять Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью у больных туберкулезом, и доказательство их принципиальных преимуществ перед общепринятыми микробиологическими методами.
Задачи исследования
1. Разработать технологию забора и обработки проб диагностического материала для выделения ДНК Mycobacterium tuberculosis для эффективного
10 определения их чувствительности и/или резистентности к изониазиду и ри-
фампицину.
Адаптировать метод гетеродуплексного анализа для выявления резистентных к рифампицину Mycobacterium tuberculosis путем определения мутаций в гене гроВ.
Оценить возможность применения в клинико-лабораторной практике метода биологических микрочипов для выявления резистентных к рифампицину Mycobacterium tuberculosis на чипах «ТБ-БИОЧИП-(РИФ)».
Разработать собственную тест-систему для выявления устойчивых к изониазиду Mycobacterium tuberculosis в генах katG, inhA, oxyR/ahpC, kasA с наиболее распространенными мутациями, на основе полимеразнои цепной реакции и конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов Single Strengh Conformation Polymorfism (SSCP).
Адаптировать для клинико-лабораторного применения тест-систему «ТБ-БИОЧИП», основанную на определении в Mycobacterium tuberculosis типа мутаций, ответственных за множественную лекарственную устойчивость.
6. Изучить молекулярно-генетические особенности Mycobacterium
tuberculosis, резистентных к рифампицину и изониазиду, характерных для
жителей Московского региона, Астрахани, Нижнего Новгорода, Саратова,
Республики Молдова (Кишинев) и Казахстан (Алматы).
Научная новизна. Разработана и практически апробирована технологическая цепочка забора, обработки различных биологических образцов и выделения из них ДНК Mycobacterium tuberculosis у больных туберкулезом, как основополагающий этап для эффективного определения чувствительности к противотуберкулезным препаратам (патент № 2231790 от 27 июня 2004 г. «Способ обработки цельной крови для выявления ДНК микобактерий туберкулеза методом ПНР»; патент № 2163022 от 28 мая 2001 г. «»Способ диагностики туберкулеза»).
Посредством подбора условий пробоподготовки расширены возможности использования других биологических секретов, кроме мокроты, для выявления ДНК Mycobacterium tuberculosis в различном биологическом материале.
Впервые для определения резистентности к изониазиду применен метод SSCP по определению мутаций сразу в 4-х генах (патент № 2200323 от 29 августа 2001г. «Способ диагностики чувствительности штаммов Mycobacterium tuberculosis к изониазиду с помощью ПЦР и конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов»).
Впервые для определения чувствительности L-форм Mycobacterium tuberculosis к рифампицину применен метод «ТБ-БИОЧИП-(РИФ)» (патент № 2263149 от 27 октября 2005г. «Способ определения лекарственной чувствительности L-форм Mycobacterium tuberculosis к рифампицину»)
Впервые использована система множественного генетического зондирования различных биологических образцов для выявления чувствительности к рифампицину и изониазиду в бактериальной и L-формах Mycobacterium tuberculosis методами гетеродуплексного анализа, конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов и биологических микрочипов.
Впервые в одном штамме Mycobacterium tuberculosis удалось одновременно определить мутации по пяти генам, ответственным за резистентность к рифампицину и изониазиду.
Впервые с помощью технологии биологических чипов проведено мо-лекулярно-генетическое паспортирование штаммов Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью, характерных для Московского региона, Астрахани, Саратова, Нижнего Новгорода, Республики Молдова (Кишинев) и Республики Казахстан (Алматы).
Практическая значимость работы заключается в разработке технологической цепочки забора и обработки разных биологических образцов и выделения из них ДНК Mycobacterium tuberculosis.
Используется в клинико-лабораторнтЯ. практике собственная тест-система «Нестед-ПЦР» для выявления ДНК микобактерий туберкулезного комплекса у больных туберкулезом, которая пригодна для любого биологического материала и отличается от коммерческих низкой себестоимостью и более высокой чувствительностью.
Разработана и апробирована для практического применения собственная тест-система выявления устойчивых к изониазиду Mycobacterium tuberculosis у больных туберкулезом методом конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов по генам katG, inhA, oxyR/ahpC, kasA.
Адаптирован метод гетеродуплексного анализа для определения чувствительности Mycobacterium tuberculosis к рифампицину по гену гроВ.
Адаптированы для клинико-лабораторной практики биологические микрочипы для выявления устойчивых к рифампицину Mycobacterium tuberculosis с помощью «ТБ-БИОЧИП-(РИФ)» и выявления Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью, устойчивых одновременно к изониазиду и рифампицину, с помощью тест-системы «ТБ-БИОЧИП».
Определены молекулярно-генетические; характеристики Mycobacterium tuberculosis, выявляемые у жителей Московского региона, Астрахани, Саратова, Нижнего Новгорода, Республики Молдова (Кишинев) и Республики Казахстан (Алматы).
Положения, которые выносятся на защиту:
Доказана важность дифференцированного подхода при выборе метода, применяемого для обработки биологических образцов и выделения ДНК Mycobacterium tuberculosis, в зависимости от целей исследования.
Определена возможность выявления ДНК Mycobacterium tuberculosis в образцах, взятых от больных с разными формами туберкулеза в динамике лечения.
3. Показана эффективность использования метода гетеродуплексно-
го анализа для определения устойчивых к рифампицину штаммов Mycobacterium tuberculosis.
Осуществлена адаптация метода биологических микрочипов «ТБ-БИОЧИП-(РИФ)» для выявления устойчивых к рифампицину Mycobacterium tuberculosis.
Установлена возможность применения метода конформационно-го полиморфизма одноцепочечных фрагментов для выявления мутаций в генах katG, inhA, oxyR, kasA, ответственных за резистентность к изониазиду.
Разработана клинико-диагностическая цепочка, состоящая из этапов обработки диагностических образцов и выделения ДНК для наиболее эффективного применения тест-системы «ТБ-БИОЧИП», определяющей Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью.
Осуществлено молекулярно-генетическое паспортирование резистентных к рифампицину и изониазиду штаммов Mycobacterium tuberculosis из различных регионов Российской Федерации и ряда стран СНГ.
Внедрение результатов исследования в практику. Результаты диссертации используются в Московском городском научно-практическом центре борьбы с туберкулезом Департамента здравоохранения города Москвы и в Институте молекулярной генетики РАН для выявления Mycobacterium tuberculosis методом ПЦР в различном диагностическом материале от больных разными формами туберкулеза на разных стадиях лечения. Адаптированный метод гетеродуплексного анализа применяется для определения штаммов Mycobacterium tuberculosis, резистентных к рифампицину и метод конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов применяется для характеристики штаммов Mycobacterium tuberculosis, резистентных к изониазиду по четырем генам {katG, inhA, oxyR, kasA) в МНПЦБТ. Для одномоментного выявления штаммов Mycobacterium tuberculosis, резистентных к рифампицину и изониазиду, применяются биологические микрочипы «ТБ-
14 БИОЧИП». С их помощью также производится молекулярно-генетическое паспортирование штаммов Mycobacterium tuberculosis, то есть в МНПЦБТ создается банк штаммов Mycobacterium tuberculosis с определенными типами мутаций по исследуемым генам.
Материалы диссертации использованы при составлении методических рекомендаций «Выявление ДНК микобактерий туберкулезного комплекса методом «Нестед-ПЦР» в различных биологических пробах», М. (2001).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 32 печатные работы, в том числе 2 монографии, получено 4 патента.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на IV съезде научно-медицинской ассоциации фтизиатров, Йошкар-Ола (1999); 3-й Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика в современной медицине», Москва (2000); конференции памяти профессора М.М.Авербаха «Туберкулез сегодня: проблемы и перспективы», Москва, (2000); Первой Российской научно-практической конференции с международным участием «Нозокомиальная туберкулезная инфекция», Москва (2001); конференции к 75-летию ведущего противотуберкулезного учреждения г. Москвы (2001); Международной конференции «Туберкулез - старая проблема в новом тысячелетии», Новосибирск (2002); Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний», Москва (2002); 12 Национальном конгрессе по болезням органов дыхания, Москва (2002); УПРоссийском съезде фтизиатров, Москва ( 2003); 13th Annual Congress of European Respiratory Society, Vienna (2003); 11 International Congress on Infectious Diseases, Mexico (2004); 15 Национальном конгрессе по болезням органов дыхания и 1-й Учредительном конгрессе Евроазиатского Респираторного общества, Москва (2005).
15 Содержание работы. Диссертация изложена на 215 страницах машинописного текста и состоит из: введения, обзора литературы, главы собственных исследований, заключения, выводов. В тексте содержится 31 таблица и 18 рисунков. Библиография включает 298 источников литературы, из них 66 на русском и 232 на иностранных языках.
