Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Общая характеристика микобактерий 11
1.1.1. Mycobacterium tuberculosis - возбудитель туберкулеза человека 13
1.1.2. Особенности строения Mycobacterium tuberculosis 16
1.2. Туберкулез человек 23
1.2.2. Роль Т-лимфоцитов в формирования иммунной защиты от Mycobacterium tuberculosis 29
1.2.3. Гуморальнный иммунный ответ при туберкулезе Mycobacterium tuberculosis 31
1.3.Диагностикая туберкулеза 31
1.3.1. Бактериоскопия и бактериогический метод диагностики Mycobacterium tuberculosis 32
1.3.2. Метод полимеразной цепной реакции 33
1.3.3. Иммунодиагностика 35
1.4.Антигены Mycobacterium tuberculosis 42
1.5.3аключение по обзору литературы 43
2. Материалы и методы исследования 43
2.1. Штаммы бактерий и биологические препараты 43
2.2. Питательные среды для культивирования Mycobacterium tuberculosis 43
2.3. Основное оборудование 44
2.4. Основные реактивы 44
2.5. Условия проведения анализов
2.5.1. Условия проведения иммуноферментного анализа 46
2.5.2. Условия проведения электрофореза 47
2.5.3. Условия проведения иммублотинга 48
2.5.4. Гель фильтрация на сефадексе G-200
3. Результаты и их обсуждение 49
3.1. Выявление секретируемых антигенов Mycobacterium tuberculosis 49
3.2. Выделение антигенных комплексов из фильтрата культурального супернатанта Mycobacterium tuberculosis с помощью этонола 53
3.3. Выделение антигенных комплексов Mycobacterium tuberculosis фильтрата культурального супернатанта методом ультрацентрифугирования 64
3.4. Спектр белков различных видов микобактерий 68
3.5. Получение антигена с молекулярной массой 45 кДа из клеток Mycobacterium tuberculosis 70
4. Заключение 76
Выводы 79
Список использованных источников литературы
- Mycobacterium tuberculosis - возбудитель туберкулеза человека
- Бактериоскопия и бактериогический метод диагностики Mycobacterium tuberculosis
- Условия проведения иммуноферментного анализа
- Выделение антигенных комплексов Mycobacterium tuberculosis фильтрата культурального супернатанта методом ультрацентрифугирования
Введение к работе
Актуальность темы. Туберкулез представляет собой важную медицинскую и социально-экономическую проблему во всем мире. Анализ сложившейся эпидемиологической ситуации показывает, что заболеваемость туберкулезом в России носит характер эпидемии [Карпов, 1998; Пунга, 1999; Онищенко, 2002]. По данным ВОЗ в период с 2000 по 2020 гг. туберкулезом в мире заболеет около 200 млн. человек, умрет около 35 млн. человек, будут инфицированы приблизительно 1 млрд. человек [World Health Organization, 2009]. В связи с этим, одной из важных задач мировой медицины является разработка надежных (эффективных и специфических), простых в использовании, методов для быстрой диагностики туберкулеза.
Важную проблему в настоящее время представляет сам возбудитель заболевания, в части носит его способность к выживанию в среде обитания и все увеличивающееся число устойчивых к противотуберкулезным препаратам первого ряда (стрептомицину, изониазиду, рифампицину и этамбутолу) форм, в том числе одновременно к нескольким (поли- и мультирезистентных), особенно у впервые заболевших [Dwyer et al, 1993; Diaz-Infantes et al, 2000]. Микробиологические исследования играют в современных условиях важную роль в выявлении, диагностике и дифференциальной диагностике туберкулеза, выборе лечения, оценке его эффективности.
Следует отметить, что из-за многообразия форм туберкулеза диагностика этой болезни весьма сложна. Обязательный диагностический минимум включает обследование с использованием клинических анализов крови и мочи, физикальных, рентгенологических, микроскопических и бактериологических, а также иммунологических методов.
До недавнего времени наиболее чувствительными и широко применяемыми методами для выявления антител к Mycobacterium tuberculosis являлись реакции пассивной гемагглютинации, агрегатагглютинации, связывания комплемента. В настоящее время используются для постановки диагноза более чувствительные серологические методы такие, как иммунофлуоресценция, радиоиммунный и иммуноферментный анализы (ИФА). Фактически серологические методы наиболее удобны для клинической и эпидемиологической работы по диагностике туберкулеза, так как для анализа используется легко доступный клинический материал - сыворотка или плазма крови человека. Однако эти методы, включая метод ИФА, не обладают достаточной диагностической чувствительностью.
При использовании в недавнем прошлом антигенных препаратов у лиц с установленным диагнозом туберкулез противотуберкулезные антитела (ПТАТ) обнаруживаются в 100% случаях только при фиброзно-кавернозном туберкулезе и при бактериовыделении [Карпов, 1998]. Однако больные с фиброзно-кавернозной формой туберкулеза составляют небольшую часть от общего количества больных туберкулезом. При очаговом туберкулезе ПТАТ обнаруживают только в 31% случаев, а при туберкулезе бронхов - в 15,5% случаев [Карпов, 1998]. В более поздних публикациях также отмечается не очень высокий процент выявляемости ПТАТ, в среднем в 71% случаев [Чуканов и Слогоцкая, 2007].
При применении отдельных рекомбинантных антигенов Mycobacterium tuberculosis, выявляемость ПТАТ в сыворотках больных туберкулезом, за исключением ВИЧ инфицированных пациентов, также невысока - около 60% [Mukherjee et al, 2004]. Есть данные, что использование набора значительного количества рекомбинантных антигенов приводило к улучшению результата: ПТАТ выявляли у 93% больных туберкулезом [Houghton et al, 2002; Wang et al, 2005]. Но, поскольку не ясно, у пациентов с какой формой туберкулеза обнаруживали такой высокий процент ПТАТ, трудно оценить диагностическую ценность предложенного набора антигенов.
В последние годы стало возможным применение метода полимеразной цепной реакции для диагностики туберкулеза, но из-за высокой стоимости анализа этот метод пока не получил широкого распространения. А если принять во внимание количество носителей палочки Коха в мире, и что большая часть их проживает в бедных и слаборазвитых странах, то вряд ли метод ПЦР будет приемлем в ближайшее время для скрининговых исследований.
Особо остро проблема туберкулеза встала с возникновением и распространением ВИЧ-инфекции. На фоне этого заболевания туберкулез развивается очень стремительно. Используемые в настоящее время скрининговые тест-системы, в связи с недостаточной чувствительностью, не позволяют своевременно выявить развитие этого заболевания. Поэтому работы по совершенствованию тест-систем, основанных на серологических реакциях, являются актуальными.
Цель исследования - разработка способа получения антигенных препаратов Mycobacterium tuberculosis и изучение их серологической активности в ИФА и иммуноблотинге.
Задачи работы:
-
Выявление антигенов Mycobacterium tuberculosis в фильтрате культурального супернатанта.
-
Определение целесобразности использования этанола для повышения активности и специфичности антигенов из супернатанта Mycobacterium tuberculosis, предназначенных для использования в ИФА и иммуноблотинге.
-
Определение возможности повышения специфичности антигенов Mycobacterium tuberculosis, содержащихся в супернатанте, с использованием метода ультрацентрифугирования
-
Определение особенностей антигенных спектров различных видов микобактерий.
-
Установление возможности использования комплексов Mycobacterium tuberculosis, выделенных из клеток с помощью экстракции 10% раствором ДМСО, для получения индивидуальных специфичных антигенов, пригодных для использования в реакции иммуноблотинга.
Научная новизна
Выявлены особенности антигенного профиля Mycobacterium tuberculosis шт. «Академия». Среди секретируемых белков серологическую активность проявляли доминирующий белок с молекулярной массой 38 кДа и белки 31 кДа, 29 кДа и 6,5 кДа. Белок с молекулярной массой 45 кДа присутствует в значительных количествах в спектрах белков Mycobacterium tuberculosis, M. intracellulare и M. avium и практически не выявляется у M. bovis и вакцинного штамма БЦЖ. Это позволяет использовать данный антиген в качестве компонента тест-системы, выявляющей противотуберкулезные антитела в сыворотке крови людей, инфицированных патогенными микобактериями, а также исключить из круга подозреваемых лиц, вакцинированных БЦЖ.
Практическая ценность
Разработаны методы получения растворимых антигенных комплексов Mycobacterium tuberculosis из супернатанта (белки с молекулярными массами 38кДа, 31 кДа, 29кДа, 6,5кДа) и клеточного антигена (белок с м.м. 45кДа). Определены приемы, позволяющие сохранить большую часть диагностически значимого антигенного материала и освободиться от значительной части балластных белков. Антигены M. tuberculosis 45 кДа, 38 кДа, 31 кДа, 29кДа и 6,5 кДа планируется использовать в разрабатываемой на основе метода иммуноблотинга тест-системе, необходимой практическому здравоохранению для эффективной диагностики туберкулеза
Положения, выносимые на защиту
-
-
При культивировании в среде Сотона в течение 14-28 суток Mycobacterium tuberculosis штамма «Академия» в фильтрате супернатанта обнаруживаются белки с молекулярными массами 38 кДа, 31 кДа, 29кДа и 6,5 кДа.
-
Осаждение этанолом фильтрата культурального супернатанта Mycobacterium tuberculosis приводит к повышению активности антигенсодержащего материала и позволяет избавиться от значительного количества балластных, нереагирующих с противотуберкулезными антителами белков.
-
Метод ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы позволяет выделить из супернатанта Mycobacterium tuberculosis материал с более высоким содержанием специфических антигенов.
-
Классические приемы очистки белков, такие как осаждение при определенных значениях рН, фракционирование этанолом и сульфатом аммония с последующей гель-фильтрацией, позволяют получить из ДМСО- экстракта M. tuberculosis антигенный препарат, содержащий практически одну серопозитивную фракцию с молекулярной массой в 45 кДа.
Апробация работы
Основные положения диссертации представлены на Итоговых научных конференциях КФУ (Казань 2011, 2012), XIX Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2012», (Москва, 2012), III международной научно-практической конференции «Новые концепции механизмов воспаления, аутоиммуного ответа и развития опухоли» (Казань, 2012), III Международной интернет-конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнология» (Казань, 2012).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации
Mycobacterium tuberculosis - возбудитель туберкулеза человека
Клеточная стенка. Электронно-микроскопически в клеточной стенке выделяют три слоя толщиной по 10 нм, поверхностный - микрокапсула, которая состоит из полисахаридов и играет важную роль в жизнедеятельности микобактерии, в том числе обеспечивает их устойчивость к неблагоприятным воздействиям. В клеточной стенке находятся видоспецифические антигены. Вакцины, приготовленные из клеточных стенок туберкулезных микобактерии, имеют разную вирулентность и иммуногенность. Наиболее выраженный иммунитет вызывают вакцины из клеточных стенок высоковирулентных микобактерии. Клеточные стенки вызывают в организме здоровых животных развитие гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), антителообразование. Однако их сильные сенсибилизирующие свойства и наличие в них токсического корд-фактора значительно осложняют гипериммунизацию этой фракцией микобактерии туберкулеза [Перельман., 2006].
Клеточная стенка микобактерии устроена сложнее, чем у других бактерий. В ней преобладают липиды (более 60% сухой массы), в том числе специфичные для микобактерии. Именно они определяют нестандартность тинкториальных, физиологических и экологических свойств туберкулезной палочки. Большинство липидов представлено миколовыми кислотами и их производными - длинноцепочечными (60-90 углеродных атомов), разветвленными жирными кислотами. Часть миколовых кислот ковалентно связана с пептидогликаном посредством арабиногалактана. При экстракции
хлороформом его получают в виде фракции «воск D». Миколовые кислоты образуют подобие палисада, определяя восковидность структуры. Но миколовые кислоты не только фиксированы в каркасе клеточной стенки. Они присутствуют и в виде свободных гликолипидов-сульфолипидов (сульфатидов) и корд-фактора. Снаружи клеточная стенка окутана слоем гликолипидов (микозиды). Микозиды структурно и функционально напоминают липополисахариды наружной мембраны грамотрицательных бактерий, но лишены их агрессивности. Тем не менее, они токсичны и, подобно корд-фактору и сульфатидам, вызывают образование гранулем [Маянский, 2006].
Еще одним компонентом клеточной стенки микобактерий является липоарабиноманнан. Он заякорен на плазматической мембране, пронизывает клеточную стенку и выходит на ее поверхность. В этом отношении он похож на липотейхоевые кислоты грамположительных бактерий. Липоарабиноманнан представлен гетерогенной смесью высокомолекулярных липополисахаридов, углеводным компонентом которых служат разветвленные полимеры арабинозы и маннозы, а липидная часть состоит из диацилглицерольных производных пальмитиновой и туберкуло-стеариновой кислот. Особенности терминального фрагмента лилоарабиноманнана (прежде всего его маннозные радикалы — кэпы) существенно влияют на взаимоотношения микобактерий с макрофагами, вмешиваясь в патогенез туберкулезного процесса.
В составе клеточной стенки имеются белки, часть из них входит в состав диагностического препарата «туберкулин». Особую известность получил протеиновый комплекс под названием «антиген 85». Он состоит из трех близкородственных белков, которые относятся к числу сильных индукторов иммунного ответа против М. tuberculosis. Данный комплекс выполняет функцию фермента, соединяющего миколовые кислоты с трегалозой. Это делает его мишеныо для новых антибактериальных препаратов, которые в настоящее время проходят испытания [Маянский., 2006].
Цитоплазматическая мембрана. В состав цитоплазматической мембраны, расположенной под клеточной стенкой, входят липопротеидные комплексы. С ней связаны различные ферментные системы, в частности окислительно-восстановительные. В цитоплазматической мембране осуществляются процессы, ответственные за специфичность реакций микобактериальной клетки на окружающую среду. Цитоплазматическая мембрана микобактерий туберкулеза путем инвагинации в цитоплазму формирует внутрицитоплазматическую мембранную систему, или мезосому. Мезосомы полифункциональны. С ними связана локализация многих ферментных систем, они участвуют в синтезе материала клеточной стенки, выполняют роль посредника между ядром и цитоплазмой. Отмечено слабое развитие или отсутствие мезосом у авирулентных штаммов микобактерий туберкулеза и их L-форм [Тогунова., 1964]. Цитоплазма микобактерий туберкулеза состоит из гранул и вакуолей различной величины. Основная часть мелкогранулярных включений представлена рибосомами, на которых синтезируется специфический белок.
Инфицирование человека Mycobacterium tuberculosis происходит различными путями: в большинстве случаев - случаев воздушно-капельным и воздушно пылевым путем, в редких случаях - алиментарным путем. Возможно также инфицирование через слизистые оболочки, конъюнктиву глаза, миндалин. [Bodnar et al., 2001, von Reyn and Vuola., 2002;]. У беременной женщины при тяжелой форме туберкулеза может произойти внутриутробное заражение плода. Решающими факторами для развития заболевания являются количество МБТ, попавшее в организм, и длительность контакта здорового человека с больным. Чаще всего болезнь возникает при семейных контактах с больным. Принято выделять два патогенетических варианта туберкулеза. Первичный ТБ, который возникает у лиц, ранее не имевших контакта с возбудителем; он определяется особенностями врожденного иммунитета, в то время как реакции специфического иммунитета включаются значительно позднее. Вторичный туберкулез относят к разряду иммунопатологии. Особенности взаимоотношения человека с Mycobacterium tuberculosis представлены на рисунке 1.
Бактериоскопия и бактериогический метод диагностики Mycobacterium tuberculosis
У М. tuberculosis описан комплекс 85В, являющийся основной антигенной фракцией фильтрата культур ТМБ. В его состав входятследующие антигены: Ag85A, Ag85B, Ag85C и Ag85D [Wiker and Harboe., 1992]. Комплексу свойственна миколил-трансферазная активность, необходимая для синтеза одного из факторов патогенности, а именно корд-фактора [Belisle et al., 1997]. Ag85B, имеющий молекулярную массу 30 кДа, является основным секретируемым антигеном и появляется в фильтрате культуральной жидкости уже через 72 часа выращивания М. tuberculosis. Использование Ag85B в серологических реакциях позволяет диагностировать до 94% случаев инфцирования возбудителем туберкулеза, а также при туберкулезе, ассоциированным с ВИЧ-инфекцией. [Raja et al., 2002]. Некоторые авторы отмечают высокую перекрестную реактивность комплекса Ag85 с антигенами практически всех микобактерий [Wiker and Harboe., 1992], что в значительной степени снижает специфичность тест-систем. Значительно специфичнее тесты, проводимые только с одним компонентом комплекса - антигеном Ag85D с м.м. 27 кДа [Ramalingam et ah, 2004]. Специфичность подобных тестов составляет около 70%, что позволяет рекомендовать его для диагностики туберкулеза, ассоциированного с ВИЧ-инфекцией.
Еще один антиген — Rv0455c представлен в фильтратах культуральной жидкости ТМБ. Имеет молекулярную массу 14 кДа. Специфические антитела к данному антигену присутствуют в сыворотке крови у большинства инфицированных М. tuberculosis людей, при этом у больных кожно-аллергические реакции с туберкулином (реакция Манту) не регистрируются [Jackett et al., 1988]. Показана возможность использования данного антигена для диагностики туберкулезного менингита при исследовании спинномозгового ликвора [Sumi et al., 1999].
Описан растворимый антиген МРТ32, активно секретируемый культурами М. tuberculosis [Nagai et al., 1991]. Охарактеризован как белок, гомологичный фибронектин-связывающему антигену М. leprae [Harboe and Wiker., 1998]. Секретируется возбудителем туберкулеза на ранней стадии инфекции и продолжается до образования каверн в легких [Samanich et al., 2000; Houghton et al., 2002]. Антитела к антигену MPT32 регистрируются у большинства больных ТБ, а также у ТБ/ВИЧ инфицированных людей. [Samanich et al, 1998; Samanich et al, 2000].
Антиген A60 — термостабильный компонент фильтрата культуральной жидкости М. bovis (вакцинный штамм) и М. tuberculosis [Harboe et al, 1977]. Входит в состав иммуноферментной тест-системы для диагностики ТБ фирмы «Anda Biologicals» (Франция). Антиген обеспечивает диапазон чувствительности от 36 до 91% и специфичности от 68 до 98 %, однако проявляет низкую чувствительность при туберкулезе детей и его внелегочных формах.[Chan et al, 2000; Garg et al, 2003]. Установлено, что с помощью антигена А60 можно отличить поствакцинальную реакцию, латентную инфекцию и активный туберкулез. Антитела к антигену А60 выявляются в различных биологических жидкостях: сыворотке крови, слюне, спинномозговом ликворе, плевральном выпоте, бронхо-альвеолярных смывах [Del Pezzo et al, 1996; Grubek-Jaworska et al, 1997; Maheshwari et al, 2000. Ghoshal et al, 2003], [Ghelani et al, 1999]. Однако данный антиген неспецифичен для микобактерий - он дает перекрестные реакции с нокардиями и коринебактериями, что снижает специфичность тестов на его основе [Li etal, 1998] Новая группа антигенов М. tuberculosis - ТМБ ТВ9.7, ТВ 15.3, ТВ 16.3 и ТВ51. По специфичности аналогичны антигену с м.м. 38 кДа. Получены их рекомбинантные аналоги, которые использовали для серодиагностики ТБ: чувствительность тестов составила 31-93%, а специфичность - 97% [Weldingh et al., 2005]. Установлена наибольшая ценность антигена ТВ 16.3 для диагностики ТБ, а антигена ТВ9.7- для ТБ/ВИЧ-инфекции. Гепаринсвязывающий гемагглютинирующий адгезии, или антиген Rv0475 представляет собой поверхностный антиген М. tuberculosis, обеспечивающий взаимодействие МБТ с клеткам эпителия и распространение патогена за пределы респираторного тракта [Menozzi et al., 1996; Pethe et al., 2001]. Выявлен у всех ТМБ, но отсутствует у непатогенного М. smegmatis [Pethe et al., 2001]. У инфицированных М. tuberculosis людей без клинических признаков болезни к антигену Rv0475 формируется иммунный ответ опосредованный CD4 клетками воспаления. Антитела появляются лишь в активной стадии болезни. [Masungi et ah, 2002]. Иммунитет аналогичен создаваемому при вакцинации БЦЖ и носит протективный характер.
Антигены М. tuberculosis, обозначаемые как РЕ и РРЕ в структуре N-терминального конца молекулы имеют аминокислотные последовательности пролин - глютамин (РЕ) и пролин - пролин - глютамин (РРЕ). Выявлены в результате полной расшифровки генома М. tuberculosis. РРЕ индуцируют выраженный иммунный ответ к М. tuberculosis, как гуморального, так и клеточного типов [Abou-Zeid et al., 1991]. В крови инфицированных обнаружены анти-РРЕ55 антитела, которые не выявляются у вакцинированных. [Singh, et al., 2005]. Антиген из группы РЕ экспрессируется только in vivo, а в клетках ТМБ отсутствует [Espitia et al., 1999].. Антиген Rv3872 из группы РЕ признан подходящим для серологической диагностики туберкулеза: чувствительность проводимого с его применением иммуноферментого теста составила при легочной и внелегочных формах туберкулеза 94 и 90% соответственно, а специфичность в обоих случаях оценена в 95% [ Mukherjee. et al., 2007].
Полисахаридный антиген липоарабиноманнан является компонентом клеточной стенки М. tuberculosis. В ИФА с сыворотками больных ТБ к нему обнаруживаются антитела в 72 и 89% случаев, при специфичности показаний 90 и 100%. Следует отметить, что у лиц с внелегочными формами туберкулеза и с ТБ/ВИЧ-инфекцией чувствительность теста- была значительно ниже. [Chan, Heifets and Iseman., 2000].
Антигены M. tuberculosis, включающие в качестве основного компонента трегалозосодержащие гликолипиды: 2,3-диацилтрегалоза (ДАТ); 2,3,6-триацилтрегалоза (ТАТ); 2,3,6,6-тетраацилтрегалоза 2-сульфат (сульфолипид-1) и трегалоза 6,6-димиколат (корд-фактор). При постановке ИФА с антигенами ДАТ и ТАТ чувствительность составляла 11-88% и 51-93% соответственно. [Julian et al., 2002]. Чувствительность теста, проводимого с применением сульфолипида-1, при выявлении специфических IgG, IgA и суммарно обоих типов антител составляла 81%, 66% и 93,7% соответственно, а специфичность - 77,6%, 87% и 67,5% соответственно [Laal. etal., 1997].
На основе некоторых иммунодоминантных антигенов МБТ разработаны комерческии тест-системы, которые используются для диагностики ТБ с разной эффективностью.
Заключение по обзору литературы.
Анализ литературы, посвященной исследованиям антигенного спектра М. tuberculosis, выполненным методом иммуноблотинга, демонстрируют на редкость разнообразный спектр антигенов, с которыми реагируют сыворотки пациентов больных туберкулезом. Однако следует отметить, что использование антиген содержащего материала часто приводит к получению высокого процента ложноположительных результатов. Поэтому представляется важным, что для повышения чувствительности диагностических тест-систем при сохранении специфичности необходимо выявлять и использовать специфические антиген, с которыми реагируют все сыворотки больных, или хотя бы большинство из них. Представляется, что сконструированная на основе 7-10 таких антигенов тест-система может удовлетворять современным требованиям диагностики туберкулеза.
В настоящее время, несмотря на значительное количество публикаций, посвященных изучению антигенов М. tuberculosis, работ, в которых имеется подробное описание процедуры их получения, недостаточно. Возможно, это связано с коммерческим интересом. Тем не менее, использующиеся сегодня диагностические тест-системы обладают недостаточной чувствительностью. Настоящая работа посвящена разработке способов получения серологических активных антигенных препаратов из М. tuberculosis, которые представляют интерес для диагностики туберкулеза методами ИФА и иммуноблотинга.
Условия проведения иммуноферментного анализа
От балластного, в том числе и серологически активного материала, освобождались, варьируя значениями рН антигенсодержащего раствора, методы высаливания и осаждения органическими растворителями, а также метод гель-фильтрации на сефадексе G-200. Контроль за ходом очистки проводили, используя электрофорез.
Схема очистки была следующей: на первом этапе рН ДМСО-экстракта доводили до значения 3,5-4,0 уксусной кислотой и выдерживали сутки при температуре 4 С. Образовавшийся осадок отделяли центрифугированием при 8000 об/мин в течение 20 минут. Для растворения осадка использовали 0,05 М Трис-НСІ, рН 7,4-7,6 в количестве 1/2 от первоначального объема ДМСО-экстракта, а рН доводили до значения 7,4-7,6 раствором 2М NaOH. В полученный раствор приливали этанол, охлажденный до -20С, до конечной концентрации 30% и отделяли выпавший осадок центрифугированием. Раствором NaOH доводили рН этанольного супернатанта до значения 4,0 и центрифугированием отделяли выпавший осадок. К супернатанту приливали охлажденный этанол до конечной концентрации 70%, а вновь образовавшийся осадок отделяли центрифугированием. Из супернатанта отделяли сульфат-аммонийный осадок, а содержащийся в нем материал фракционировали методом гель-фильтрации.
На рисунке 17 представлены иммуноблоты, которые были получены на промежуточных продуктах очистки антигена. Видно, что даже первый продукт очистки ДМСО-экстракта, который представлял осадок, выпавший при значении рН 4,0, содержит значительное количество серологически активных фракций. Этот рисунок демонстрирует также значительное своеобразие индивидуально ответа организма, инфицированного М. tuberculosis. я б в і я
Иммуноблоты, полученные на промежуточных продуктах очистки ДМСО-экстракта в реакциях с сыворотками 4 пациентов, больных туберкулезом легких: а) осадок, выпавший при значении рН 4,0; б) супернатант (№1), полученный после удаления выше упомянутого осадка; в) осадок, выпавший из супернатанта (№1) в присутствие 30% этанола г) осадок, полученный из этанольного супернатанта (№2) при рН 4,0; д) осадок, полученный из 3-го супернатанта после добавления 70% этанола; е) сульфат-аммоний осадок, полученный из 3-го супернатанта.
Иммуноблоты, полученные на материале осадка и супернатанта, представлены на рис. 17 (1а и 16 соответственно). Видно, что спектры серопозитивных фракций осадка и супернатанта мало отличаются между собой. В тоже время легко заметить индивидуальные различия в спектрах серопозитивных фракций, которые проявляются с сыворотками 4 больных туберкулезом. На наш взгляд указанные индивидуальные различия особенно отчетливо видны на денситограммах с иммуноблотов 1а, 2а, За и 4а. j
Наибольшая вариабельность по серологической активности наблюдается у ДМСО-фракций, имеющих молекулярные массы: 11 кДа, 13,5 кДа, 15,5 кДа, 22 кДа, 24,5 кДа, 30 кДа и 53 кДа. Что касается фракции с молекулярной массой в 45 кДА, то на нее приходится лишь незначительная доля общей серпозитивности. Следует в тоже время отметить, что в супернатанте эта фракция чуть более выражена и наблюдается у всех пациентов. По этой причине на очередном этапе было проведено осаждение материала супернатанта 30% этанолом. Видно (рис.16, 1в), что в осадке содержится большой спектр серопозитивных фракций. Доля фракции, содержащей антигены с молекулярной массой в 45 кДА, незначительна. Обращает внимание, что сыворотка пациента под № 1 весьма активно реагирует с фракциями в диапазоне молекулярных масс 31-200 кДа, а на стрипе пациента под № 4 проявляется мажорная фракция с молекулярной массой в 24,5 кДа.
На рис. 17 видно, что в осадке, образовавшемся при рН 4,0 (t 4 С) из 2-го супернатанта, большая доля серологической активности приходится на самые низкомолекулярные фракции (М.м. менее 6,5 кДа) и фракции с молекулярной массой более 45 кДа. (рис. 17, 1г).
В осадке, полученном из того же 2-го супернатанта, при внесении в него 70% этанола, спектр серопозитивных фракций мало отличался от спектра осадка, полученного при рН 4,0 (t 4 С). Исключение представлял спектр серопозитивных фракций пациента № 2. В его сыворотке присутствуют антитела, с которыми активно реагируют фракции, имеющие молекулярную массу в 18 и 19,5 кДа.
В супернатант, после отделения осадка, образовавшегося в 70% этаноле, вносили сульфат аммоний до конечной концентрации 60%. Сульфат-аммонийный осадок (рис. 17, 1е) имел практически такой же набор серопозитивных фракций, как и осадок, образовавшийся в 70% этаноле и осадок, выпавший при рН 4,0 (t 4 С) из второго супернатанта (рис.17, Зг).
Ввиду своеобразного распределения активности, которая в основном располагалась в области молекулярных масс более 45 кДа и менее 21 кДа, для дальнейшей очистки использовали метод гель-фильтрации. Гель-фильтрацию материала сульфат-аммонийного осадка проводили на колонке с сефадексом G-200. Материал элюировался двумя пиками. На рисунке 17 представлена электрофореграмма материала 1 пика, которая свидетельствует о достаточной однородности препарата.
На рисунке 20 представлены иммуноблоты, полученные с 24 сыворотками больных туберкулезом легких и антигенным материалом первого пика. Видно, что на всех иммуноблотах весьма четко представлена серопозитивная фракция с молекулярной массой в 45 кДа. Следует в тоже время отметить, что сыворотки 3 пациентов (№ 2, №12 и №20) достаточно активно среагировали с наиболее медленно мигрирующей фракцией, которая не обнаруживается на электрофореграмме при использовании красителя Кумасси ярко-голубой G-250. Пациенты X«: 1 23 45 б 7 g 9 10 И 12 13 14 15 16 17 IS 19 2021 22 23 24
jj " Грігаш= геля45kDa 1 Рис. 20. Иммуноблоты антигенного коплекса, полученного после гель фильтрации на сефадексе G-200, с 24 сыворотками больных туберкулезом.
Представленные результаты дают основание предполагать, что на полученном антигене 45 кДа проявляется 100% чувствительность тест-системы. Однако по данным литературным известно, что в 100% случаях противотуберкулезные антитела выявляются только при фиброзно-кавернозном туберкулезе и при бактериовыделении [Waters etal., 2004]. Во всех остальных формах туберкулеза процент выявляемое ПТАТ был ниже. Мы не исключаем, что проявление столь высокой чувствительности связано с тем, что все использованные в иммуноблотинге сыворотки имели высокий показатель оптической плотности в ИФА (более 2,0 оптических единиц).
Выделение антигенных комплексов Mycobacterium tuberculosis фильтрата культурального супернатанта методом ультрацентрифугирования
Ультрацентрифугирование позволяет быстро разделять материалы, обладающие различной плотностью, даже если эти различия весьма небольшие. По этой причине различные варианты центрифугирования широко используются при очистке белков.
В следующей серии экспериментов нами было проведено фракционирование исходного ФКС методом ультрацентрифугирования, которое проводили в ступенчатом градиенте сахарозы: 7,5%, 15%, 30%, 60%. Сахарозу готовили на 0,05 М Трис-HCl буфере, рН 6,8. Отбор материала из центрифужных пробирок проводили шприцом, последовательно отбирая его из верхней части пробирок (рис. 11). Всего было получено 9 фракций, включая осадок.
Результаты исследования фракций в ИФА представлены на рисунках 12 и 13, которые свидетельствует о том, что наиболее высокая активность антигенов М. tuberculosis проявляется вофракциях № 5, 6 и 7, тогда как наибольшая специфичность проявляется антигенным материалом из фракций 1, 2, 3 и 4. Низкие значения ОП в последних перечисленных образцах связаныс низкой концентрацией материала, содержащегося в них. О-4" 8.266
Показатели ОП фракций ФКС, полученных в результате ультрацентрифугирования в ступенчатом градиенте плотности сахарозы. Для сенсибилизации лунок полистеролового планшета исследуемые фракции разводили 1:5 в 0,05 М трис-НС1, рН 7,2-7,4.
Показатели ОП фракций ФКС, полученных в результате ультрацентрифугирования в ступенчатом градиенте плотности сахарозы. Для сенсибилизации лунок полистеролового планшета исследуемые фракции разводили 1:25 в 0,05 М трис-НС1, рН 7,2-7,4.
Белковый спектр фракций представлен на рисунке 14. Видно что, в пробах преобладают белки с достаточно высокой молекулярной массой -более 29 кДа. Некоторые из этих белковых фракций не обнаруживаются на электрофореграмме исходного ФКС (рис. 14, трек 10). Таковыми являются антигены с М. м. 180 кДа, 105,8 кДа и 70 кДа. Треки: 2 3 4 5 6 7 8 9 -116кДа МОбкДа
Электрофорез в ПАГ различных фракций ФСК М. tuberculosis, полученных ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Фракции: 2) в 7,5% сахарозе; 3) в 15% сахарозе; 4) в 30% сахарозе, верхняя часть; 5) в 30 % сахарозе, средняя часть; 6) в 30% сахарозе, нижняя часть; 7) в 60% сахарозе, верхняя часть; 8) в 60% сахарозе; 9) осадок со дна пробирки; 10) исходный ФКС.
Больший интерес представляют, на наш взгляд, антигены, присутствующие во фракциях с низким содержанием сахарозы: 7,5%, 15% и самые верхние фракции, практически не содержащие сахарозы, представляющие буферный раствор, в котором был растворен фракционируемый материал. Из-за низкой концентрации содержащегося в нем материала он не был выявлен на электрофореграммах, но по данным ИФА эти фракции содержат наиболее специфичный антигенный материал ИФА.
Таким образом, метод ультрацентрофугирования позволяет выделить из ФСК материал с более высоким содержанием специфических антигенов М. tuberculosis, чем они представлены в исходном ФКС. 3.4. Спектр белков различных видов микобактерий
В настоящее время туберкулез человека вызывают Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium microti, Mycobacterium canettii, Mycobacterium pinnipedii, Mycobacterium caprae, Mycobacterium microti, Mycobacterium avium. В частности отмечено, что в некоторых регионах Африки в 15% случаев этиологическим агентом туберкулеза человека является Mycobacterium avium. Особенно часто эта микобактерия встречается у ВИЧ-инфицированных [Clivt and Pettipher et. al., 2001]. Количество исследованных в серологических реакциях антигенов М. tuberculosis весьма обширно и насчитывает не один десяток. В частности, [Suman. et. al., 1997] приводят список из 34 антигенов. [Wang et. al., 2005]. По данным некоторых исследователей наиболее интересными являются антигены с М. м. 88 кДа, 45-47 кДа, 38 кДа. 29-31 кДа, 16 кДа, 14 кДа и 6,5 кДа.
В связи с этим было интересно оценить наличие указанных белков в клетках различных видах микобактерий. На рис. 15 представлены электрофореграммы полных клеточных лизатов ряда микобактерий, некоторые из которых являются этиологическими агентами туберкулеза. Видно, что различия в балансе белков достаточно значительные. Особенно они заметны в количестве мажорных фракций. У М. tuberculosis их четыре: с М.м. 120 кДа, 90 кДа, 55 кДа и 45 кДа, тогда как М. bovis имеет одну мажорную фракцию с М.м. 55 кДа, а М. intracelliilare, М. avium также по одной мажорной фракции, но с М.м. 45 кДа. Спектры белка четырех микобактерий, в том числе и М. bovis, достаточно сильно отличаются от спектра белков вакцины БЦЖ тем, что вакцинный штамм М. bovis имеет значительно большее количество низкомолекулярных белков. Обращает внимание большое содержание белка с М.м. 45 кДа у М. tuberculosis, М. intracelliilare, М. avium и малое его количество у М. bovis и в вакцине БЦЖ. 31-29кДа 26кДа
На рис.16 представлена электрофореграмма, которая позволяет более детально рассмотреть белковые фракции в интервале молекулярных масс 29 кДа и выше. Видно, что фракция с М.м. 45 кДа у вакцинного штамма БЦЖ практически отсутствует. Полагая, что у вакцинированных БЦЖ людей отсутствуют антитела к нему, то использование антигена 45 кДа в предполагаемой диагностической системе будет полезным, нами была выполнена работа по выделению этого антигена из клеток М. tuberculosis.
В ряде исследований по изучению антигенов М. tuberculosis указывается на диагностическую ценность антигена с молекулярной массой 45 кДа [Diagbouga et al, 1997 and Roman F. et al, 1999]. В ФКС видимых количеств этого антигена нами не было выявлено. Ниже мы приводим описание схемы выделения данного антигена из клеток М. tuberculosis.
Диметилсульфоксид (ДМСО) является биполярным апротонным растворителем. Он широко применяется в биологии и медицине. В частности используется как проникающий криопротектор. Из-за высокой растворяющей способности его часто используют для получения антигенных препаратов из патогенных микроорганизмов [Якупов и Хаертдинов, 2010]
Выращенные в среде Сотона клетки М. tuberculosis осаждали центрифугированием в течение 30 минут при 8000 об/мин и трижды промывали физиологическим раствором, рН 7,4 с последующим центрифугированием. Бактериальные клетки суспендировали в равном объеме 10% водном растворе диметилсульфоксида и в течение 30 минут гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе. Гомогенат подвергали исчерпывающему диализу против дистиллированной воды, а затем диализировали против 0,05 М Трис-HCl буфера со значением рН 7,4-7,6. Центрифугированием в течение 30 минут при 8000 об/мин освобождались от клеток. Полученный ДМСО-экстракт служил исходным материалом для получения антигенного препарата с молекулярной массой 45 кДа.
Похожие диссертации на Получение антигенов Mycobacterium tuberculosis и выявление наиболее значимых из них для диагностики туберкулеза
-
