Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время в зависимости от уровня деятельности диагностических служб удельный вес внелегочного туберкулеза в различных регионах колеблется от 4 до 16% (Гусейнов Г.К., 2000). Внелегочные локализации туберкулеза не играют значительную роль в создании напряженности эпидемиологической ситуации. Однако именно эти формы заболевания, в силу особенностей патогенеза и клинической картины, остается одной из самых сложных диагностических и лечебных проблем фтизиатрии. Число больных тяжелыми и запущенными формами заболевания - 45-60% удельного веса ВЛТ. Нарастает число больных полиорганным туберкулезом. Эти данные говорят о недостаточной работе структур, занимающихся диагностикой и выявлением заболевания (Шилова М.В., 2005; Левашев Ю.Н., Гришко А.Н., Шеремет А.В., 2006).
Микробиологические исследования занимают важное место в общем комплексе клинико-диагностических методов, применяемых для диагностики туберкулеза. Следует отметить значительные трудности в установлении феномена бактериовыделения у больных внелегочным туберкулезом (Вишневский Б.И., Маничева О.А. и др., 1998). Не всегда удается выделить обычные клеточные формы возбудителя, поскольку клинические образцы, как правило, олигобацилярны или содержат измененные варианты микобактерий, возникающие вследствие проводимой неадекватной противотуберкулезной химиотерапией, собственными факторами резистентности макроорганизма и пр. (Земскова З.С., Дорожкова И.Р., 1984).
Для их обнаружения следует использовать специальные элективные питательные среды (Попеску Т.Т., 1990; Дыхно М.М., 1984). Измененные формы микобактерий способны вызывать инфекционный процесс со стертыми клиническими проявлениями или длительно бессимптомно персистировать в организме (Земскова З.С., Дорожкова И.Р., 1984). Внелегочный туберкулез характеризуется тем, что выделить типичный возбудитель удается лишь тогда, когда происходят значительные патологические изменения в пораженных органах и это создает необходимость проведения длительного, часто органоуносящего лечения. При этом отсутствует гарантия полного излечения от туберкулеза или восстановления функций пораженного органа. Ко всему прочему, невыявленные и поздно обнаруженные больные внелегочным туберкулезом создают дополнительный резервуар туберкулезной инфекции (Левашев Ю.Н., Гарбуз А.Е., 2001).
Перспективы совершенствования бактериологической диагностики туберкулеза внелегочных локализаций предусматривают целенаправленный поиск не только типичных клеточных форм, но и L–трансформированных вариантов возбудителя (Прозоровский С.В., Кац Л.Н., Каган Г.Я., 1981). При этом вопрос точной видовой идентификации выделенных L–форм остается не решенным окончательно. Для разрешения этой проблемы целесообразно применение молекулярно-генетических методов, позволяющих проводить идентификацию выделенного варианта возбудителя на уровне генома. А также эти методы позволят в кратчайшие сроки провести изучение лекарственной чувствительности возбудителя, что особенно актуально в современной эпидемической ситуации по туберкулезу, сопровождающейся повсеместным нарастанием первичной и вторичной лекарственной устойчивости, а также утяжелением ее структуры за счет роста поли- и мультирезистентности.
Цель работы: повышение эффективности бактериологической диагностики внелегочного туберкулеза путем выделения L-трансформированных вариантов возбудителя с последующей характеристикой их культуральных, морфологических и молекулярно-генетических свойств.
Задачи исследования:
1. Составить характеристику типов выделенных L-форм микобактерий при различных локализациях внелегочного туберкулеза
2. Изучить чувствительность и специфичность выделения L-форм микобактерий при различных локализациях внелегочного туберкулеза.
3. Сравнить частоту выделения L-форм микобактерий при туберкулезе органов дыхания и внелегочных локализациях.
4. Провести молекулярно-генетическую верификацию туберкулезной природы выделенных L-форм с помощью метода ПЦР.
5. Провести анализ мутаций, ассоциированных с резистентностью к рифампицину, в гене rpoB L-форм микобактерий.
Личный вклад автора. Личное участие автора осуществлялось на всех этапах работы, кроме проведения молекулярно-генетических исследований. Автор выполнил предварительную обработку диагностического материала, посев, и выделение культур L-форм микобактерий, отбор проб для молекулярно-генетических исследований. Произвел статистическую обработку результатов и проанализировал полученные данные.
Научная новизна исследования.
1. Установлена высокая диагностическая значимость выделения L-форм МБТ при внелегочном туберкулезе.
2. Впервые доказано, что определенные типы роста L-трансформированных вариантов возбудителя характерны для различных форм внелегочного туберкулеза и связаны с активностью процесса в очагах.
3. Впервые представлен анализ молекулярной основы развития лекарственной устойчивости к рифампицину у L-трансформированных вариантов M. tuberculosis, полученных от больных внелегочным туберкулезом.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Характеристика типов роста L-форм микобактерий имеет прогностическое значение при отсутствии классического бактериовыделения. Типы L-форм В, С и, особенно, А могут указывать на более тяжелое течение внелегочного туберкулеза, чем при типе Д.
2. Средняя чувствительность метода посева исследуемого материала из внелегочных туберкулезных очагов с выявлением L-форм МБТ составляет 46,0%, что повышает результативность бактериологического метода диагностики внелегочного туберкулеза почти в 3 раза.
3. Специфичность метода выделения L-форм из клинического материала при внелегочном туберкулезе составляет 88,5%.
4. При внелегочных формах туберкулеза L-трансформированные варианты возбудителя выделяются в три с половиной раза чаще, чем при легочном туберкулезе (35,3% против 10,3%).
5. L-формы, выделяемые из биологических образцов от больных внелегочным туберкулезом и идентифицированные методом полимеразной цепной реакции, в 85% случаев принадлежат к M.tuberculosis complex.
6. Молекулярно-генетическая методика определения мутаций в гене rpoB, позволяет выявлять устойчивость L-форм микобактерий к рифампицину как маркеру мультирезистентности.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Теоретическая значимость работы заключается в том, что молекулярно-генетическими методами возможно установить принадлежность L-форм, выявленных у больных внелегочным туберкулезом к микобактериям туберкулезного комплекса (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG). Изучение мутаций, ассоциированных с устойчивостью к рифампицину как маркеру мультирезистентности, L-форм микобактерий, вегетирующих во внелегочных туберкулезных очагах позволит провести своевременную соответствующую коррекцию химиотерапии.
Практическая значимость заключается в том, что полученные данные позволят повысить эффективность диагностики туберкулеза внелегочной локализации бактериологическими методами:
- при генитальном туберкулезе у женщин почти в 30 раз;
-при туберкулезе позвоночника - в 10 раз;
-при костно-суставном туберкулезе - в 5 раз;
-при туберкулезе периферических лимфатических узлов - в 5 раз.
По типам роста выделенных L-трансформированных вариантов возбудителя можно судить об активности туберкулезного процесса во внелегочных очагах. Для начальных этапов развития туберкулезного процесса во внелегочных очагах характерными являются типы роста С и Д (незначительный в более длительные сроки), тогда как при более тяжелых, осложненных процессах чаще выделяются типы А и Б (массивный в более ранние сроки) и нередко сопровождаются бактериовыделением типичных МБТ.
Апробация материалов диссертации.
Основные положения работы доложены и обсуждены на: Санкт-Петербургском научном обществе микробиологов (1997, 1998), Научно-практи-ческой конференции Санкт-Петербургского НИИ фтизиопульмонологии (1997, 1998, 2007), Всероссийском съезде микробиологов и эпидемиологов (Москва, 1998), Всероссийской научно-практической конференции "ПЦР-диагностика инфекционных заболеваний" (СПб, 1998), Всероссийском съезде фтизиатров (Москва, 2003), Российско-шведском семинаре (Санкт-Петербург, 2000, 2001), Российско-американском симпозиуме (Санкт-Петербург, 2003), Семинарах фтизиобактериологов (В.Новгород,2004; Калининград, 2005; Санкт-Петербург, 2006(сентябрь, октябрь, ноябрь, декабрь)).
Реализация работы.
Материалы исследования использованы в Методических рекомендациях № 2000/170 «Бактериологическая диагностика туберкулеза внелегочных локализаций с использованием полимеразной цепной реакции и выявления L-форм микобактерий», утверждены 10.04.2001 года Первым заместителем министра здравоохранения РФ А.И. Вялковым, а также в пособии для врачей «Клинические особенности и лечебная тактика при туберкулезе женских половых органов с различной биологической характеристикой возбудителя», утверждены 19.11.2003 года академиком РАМН М.И. Перельманом.
Результаты работы внедрены в клинико-лабораторную практику бактериологической лаборатории и используются в клиниках внелегочного туберкулеза ФГУ «Санкт-Петербургский НИИ фтизиопульмонологии Росздрава» и в учебном курсе кафедры фтизиатрии ГОУ ДПО «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».
Публикации.
По теме диссертации: опубликовано 13 научных работ, в том числе в ведущих рецензируемых изданиях- 5.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 124 страницах текста и состоит из введения, обзора литературы, 4 глав с изложением использованных методов и результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 18 таблицами и 12 рисунками. Библиография включает 184 источника, в том числе 132 отечественных и 52 иностранных.
