Введение к работе
Актуальность проблемы. Поиск средств лечения злокачественных новообразований, опасных вирусных инфекций продолжает оставаться актуальной проблемой современной медицины.
В настоящее время одним из наиболее изучаемых грибов является род Trichoderma. Повышенный интерес к этому роду обусловлен практической и экологической его значимостью. Грибы этого рода могут расти на различных субстратах, играют важную роль в биоценозе и используются как продуцент различных биологически-активных соединений (Yedidia, I. etal., 2001; Howell, C.R., 2003).
Особый интерес грибы рода Trichoderma представляют с точки зрения биосинтеза фермента L-лизин-а-оксидазы, который был впервые описан японскими исследователями в середине 70-х годов прошлого века. Они показали, что найденный штамм Trichoderma viride обладает антилейкозной активностью (Kusakabe С, 1979).
На кафедре биохимии Российского университета дружбы народов найден продуцент фермента L-лизин-а-оксидазы штамм Trichoderma harzianum Rifai F 180 (Смирнова И.П., Берёзов Т.Т.,1982), разработан метод определения его активности (Берёзов Т.Т., Сяткин СП., Смирнова И.П.,1983) и проводятся исследования фермента L-лизин-а-оксидазы. Фермент был получен в гомогенном состоянии (НПО «Фермент» г. Вильнюс). Результатами работ Жуковой О.С, Лукашевой Е.В. и Хадуева С.Х. было показано, что L-лизин-а-оксидаза отечественного штамма обладает противоопухолевой активностью (Жукова О.С. и др., 1986; Хадуев С.Х. и др., 1987, Лукашева Е.В. и др., 2004). Впоследствии была показана антивирусная активность продуцента Trichoderma harzianum Rifai F180 на герпес I и II типов, а также ингибирование ВИЧ инфекции (Смирнова И.П., Алексеев СБ., Берёзов Т.Т. и др., 1994, 1997,2000,2003).
Исследование L-лизин-а-оксидазы Trichoderma harzianum Rifai, изучение его биосинтеза, регуляции, термостабильности, новых биологических свойств, а также создание отечественной промышленной технологии получения лизиноксидазы представляют не только практический, но и большой теоретический интерес, поскольку полученные результаты будут способствовать выяснению тонких молекулярных механизмов действия ферментов.
Работа является частью исследований, проводимых с L-лизин-а-оксидазой Trichoderma harzianum Rifai на кафедре биохимии Российского университета дружбы народов, исследований, выполняемых в рамках Государственного контракта №П391 "Создание противоопухолевого и антивирусного препарата на основе фермента L-лизин-а-оксидазы" 2009г., а также фундаментального научного исследования НИР/НИОКР "Молекулярные основы патологических процессов и система их внутриклеточной регуляции; структура и биологическая активность бактериальных ферментов с антиопухолевой и антивирусной активностью" (тема №030520-1).
Цель работы: провести исследование культуральной жидкости Trichoderma harzianum Rifai F180 - продуцента L-лизин-а-оксидазы в процессе длительного хранения (7 лет), определить оптимальные условия биосинтеза L-лизин-а-оксидазы грибом Trichoderma harzianum Rifai в лабораторных условиях, разработать производственную схему технологии получения фермента, тест-систему определения антивирусной активности L-лизин-а-оксидазы на растительных объектах и изучить влияние L-лизин-а-оксидазы на некоторых возбудителей особо опасных заболеваний растений и человека.
Задачи исследования:
Исследовать биологические и биохимические свойства культуральной жидкости (КЖ) продуцента противоопухолевого и антивирусного фермента L-лизин-а-оксидазы Trichoderma harzianum Rifai F180 в процессе длительного хранения (7 лет) при температуре +4С.
Определить оптимальные условия для максимального образования L-лизин-а-оксидазы грибом Trichoderma harzianum Rifai при глубинном способе культивирования.
Осуществить культивирование Trichoderma harzianum Rifai штамм F180 в полупромышленных условиях с целью накопления исходного продукта.
Исследовать антивирусную активность L-лизин-а-оксидазы Trichoderma harzianum Rifai штамм F180 на объектах растительного происхождения.
Исследовать антивирусную активность L-лизин-а-оксидазы Trichoderma harzianum Rifai штамм F180 на объектах животного происхождения.
Научная новизна. Впервые показана стабильность L-лизин-а-оксидазы в культуральной жидкости гриба Trichoderma harzianum Rifai F180, полученной при
глубинном культивировании на среде с пшеничными отрубями и хранящейся при температуре +4С в течение 7 лет.
Установлена роль гемицеллюлозного субстрата (пшеничных отрубей) -индуктора биосинтеза L-лизин-а-оксидазы Trichoderma harzianum Rifai.
Впервые показан ингибирующий эффект L-лизин-а-оксидазы на опасные фитопатогены - тосповирус некротической пятнистости бальзамина и неповирус кольцевой пятнистости табака при активности фермента равной 2 Ед/мл и 1 Ед/мл соответственно.
Впервые показан ингибирующий эффект L-лизин-а-оксидазы на вирус клещевого энцефалита в концентрации 25 мкг/мл и 12,5 мкг/мл с удельной активностью фермента 50 Ед/мг белка.
Практическая значимость работы
1. Установлена термостабильность культуральной жидкости гриба Trichoderma harzianum Rifai F180 в процессе длительного хранения, позволяющая проводить ее накопление и хранение без потери активности ффментаЫжзин-а-оксидазы
2. Совместно с сотрудниками Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН им. Г.К. Скрябина (ИБФМ РАН) разработан
«Технологический регламент получения лизиноксидазы» в полупромышленных условиях.
J. Разработана тест-система определения антивирусной активности L-
лизин-а-оксидазы на растительных объектах, показан ингибирующий эффект культуральной жидкости продуцента и гомогенного фермента на опасные вирусные заболевания растений: вирус некротической пятнистости бальзамина (Impatiens necrotic spot tospoviras) и вирус кольцевой пятнистости табака (Tobacco ringspot nepovims). Поданы заявки на 2 патента: Смирнова И.П., Шнейдер Ю.А. Заявка на Патент Регистрационный № 2010150343 / Штамм Trichoderma harzianum Rifai -продуцент ингибитора тосповируса некротической пятнистости бальзамина (Impatiens
necrotic spot tospoviras) от 09.12.2010 г.; Смирнова И.П., Шнейдер Ю.А. Заявка на Патент Регистрационный № 2011111098 / Штамм Trichoderma harzianum Rifai -продуцент ингибитора вируса кольцевой пятнистости табака (Tobacco ringspot virus) от 24.03.2011 г.
4. Показано влияние фермента L-лизин-а-оксидазы штамма Trichoderma harzianum Rifai F180 на опасное вирусное заболевание человека: вирус клещевого энцефалита. Установлен ингибирующий эффект L-лизин-а-оксидазы на вирус клещевого энцефалита.
Основные положения, выносимые на защиту:
Культуральная жидкость Trichoderma harzianum Rifai F180, проявляет биологическую и биохимическую стабильность в процессе длительного хранения (7 лет, при температуре +4С).
Гемице ллю лозный субстрат (пшеничные отруби) оказывает индуцирующий эффект на биосинтез L-лизин-а-оксидазы. Определены оптимальные условия биосинтеза L-лизин-а-оксидазы в лабораторных условиях.
3. Осуществлена разработка и апробация препаративных методов выделения
и очистки L-лизин-а-оксидазы (хроматографического и мембранного). Предложена
схема получения L-лизин-а-оксидазы Trichoderma harzianum Rifai в
полупромышленных условиях. По разработанной схеме на ферментере БИОР-01
осуществлена наработка исходной культуральной жидкости гриба с удельной
активностью L-лизин-а-оксидазы 50 Ед/мг белка.
Разработана тест-система, позволяющая выявлять антивирусное действие L-лизин-а-оксидазы на объектах растительного происхождения.
Впервые установлено антивирусное действие L-лизин-а-оксидазы, фермента Trichoderma harzianum Rifai штамм F180, на тосповирус некротической пятнистости бальзамина (Impatiens necrotic spot tospoviras) при активности фермента равной 2 Ед/мл и на неповирус кольцевой пятнистости табака (Tobacco ringspot nepovims), при активности 1 Ед/мл.
Впервые проведено исследование влияния L-лизин-а-оксидазы на ряд опасных вирусных инфекций человека (вирус клещевого энцефалита и вирус Западного Нила (сем. Flaviviridae), вирус Синдбис (Alphavirus), вирус Дхори (сем. Orthomyxoviridae), вирус Тягиня (сем. Bunyaviridae}), которое показало, что
максимальная антивирусная активность L-лизин-а-оксидазы проявлялась в отношении вируса клещевого энцефалита. Было отмечено снижение титра вируса клещевого энцефалита с 8,0 lg ЦПД10о до 5,0 lg ЦПД10о при добавлении L-лизин-а-оксидазы в концентрации фермента как 25 мкг/мл, так и 12,5 мкг/мл, что показывает ее антивирусное действие.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на XII Научно-практической конференции по медицинской микологии (XII Кашкинские чтения) (С.-Петербург, 2009); VI Международной конференции «Биоресурсы и вирусы» (Киев, Украина, 2010), Международной конференции «Возобновляемые лесные и растительные ресурсы: химия, технология, фармакология, медицина» (С.Петербург, 2011); International conference: Ecology of soil microorganisms (Prague, Czech Republic. 2011); XIV Научно-практической конференции по медицинской микологии (XIV Кашкинские чтения) (С.-Петербург, 2011); Международной научно-практической конференции «Интегрированная защита растений: стратегия и практика» (Минск, Республика Беларусь, 2011)
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ. Из них 7 - статьи в журналах, рекомендованных ВАК для публикаций материалов докторских и кандидатских диссертаций, остальные тезисы докладов на международных конференциях. Поданы 2 заявки на патенты.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственного исследования и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографического списка. Работа изложена на 150 страницах машинописного текста, содержит 23 таблицы, 22 рисунка. Библиографический список используемой литературы включает 245 источников, из которых 202 зарубежных.
Личный вклад автора.
Диссертационная работа представляет собой законченный, самостоятельно выполненный труд автора. Все представленные в диссертации результаты получены лично Шнейдером Ю.А. на базе лаборатории кафедры биохимии и кафедры ботаники, физиологии, патологии растений и агробиотехнологии РУДН, в лаборатории ГУ НИИ вирусологии им.Д.И. Ивановского РАМН, в лаборатории Института геохимии и
аналитической химии им. В.И. Вернадского, а также на опытной технологической установке ИБФМ РАН им. Г.К. Скрябина (г. Пушино, Московская обл.). Автором проанализированы отечественные и зарубежные литературные источники по теме диссертации, получены и обобщены результаты исследования. В работах, выполненных в соавторстве, использованы результаты исследований с долей личного участия автора 75-95%.
