Содержание к диссертации
стр.
Список сокращений 4
Введение 5
Глава I. Обзор литературы 8
1. Систематика рода Avena L. 8
1.1 История изучения представителей рода A vena 8
История изучения систематики рода Avena 12
Описание морфологии видов Avena 22
2. Кариология рода Avena 34
История кариологических исследований видов рода Avena. Геномный состав 34 кариотипов Avena
Описание морфологии хромосом и кариотипов видов представителей рода 40 Avena L.
Дифференциальное окрашивание хромосом Avena 47
3. Молекулярно-филогенетические исследования рода Avena 50
RFLP-анализ межвидовых отношений в роде Avena 53
Амплификация мини-, микросателлитов, RAPD- и AFLP как инструмент для 53 анализа межвидовых отношений в роде Avena
Геносистематика Avena: сравнительный анализ нуклеотидных 57 последовательностей генов
Заключение 64
Глава II. Материалы и методы 65
Материалы 65
Методы 66
2.1. Метод получения препаратов митотических хромосом 66
2.2. Методы окрашивания препаратов хромосом нуклеотид-специфичными 67
флуорохромами
Метод выделения геномной ДНК из зеленых тканей растений 68
Амплификация ДНК с помощью полимеразной цепной реакции 69
Методика выделения пробы ДНК из агарозного геля 69
Секвенирование ДНК 71
Выравнивание и анализ первичных последовательностей ДНК 71
Моделирование вторичных структур ITS и 5.8S рРНК 71
Глава III. Результаты и обсуждение 71
1. Кариология диплоидных видов рода A vena 71
1.1. Дифференциальное окрашивание кариотипов видов с геномом As красителями 72
DAPI и хромомицин Аз
Дифференциальное окрашивание хромосом Avena longiglumis (геном А1) 74 красителями DAPI и хромомицин Аз
Дифференциальное окрашивание хромосом Avena prostrata (геном Ар) 75 красителями DAPI и хромомицин Аз
Дифференциальное окрашивание хромосом Avena damascena (геном Ad) 75 красителями DAPI и хромомицин Аз
1.5. Дифференциальное окрашивание хромосом Avena pilosa (геном Ср) 75
красителями DAPI и хромомицин Аз
1.6. Молекулярная гетерогенность гетерохроматина Avena 76
2. Исследование последовательностей внутренних транскрибируемых спейсеров 78
ITS1 и ITS2, а также последовательностей генов 5.8S рРНК у представителей рода
Avena
Общая характеристика района ITS1-5.8S pflHK-ITS2 ядерного генома A vena 82
Эволюционно консервативный ген 5.8S рРНК в геноме Avena и других злаков 86
Быстро эволюционирующие последовательности ITS1 и ITS2 в геноме Avena и 94 других злаков
Связь мутаций в ITS1 и ITS2 Avena с особенностями вторичной структуры ITS 102
Филогенетические связи между видами Avena и место Avena среди Aveneae и 105 Роеае по данным молекулярно-филогенетического анализа ITS1 и ITS2
Эволюция кариотипов овсов на ранних этапах дивергенции видов Avena 114 Выводы 115 Список литературы 117 Благодарности 134 Приложения 135
Список сокращений
млн.п.н. - миллион пар нуклеотидов
п. н. - пара нуклеотидов
рРНК- рибосомальная рибонуклеиновая кислота
т. п. н.— тысяча пар нуклеотидов
А - остаток адениловой кислоты
AMD - актиномицин Д
С — остаток цитидиловой кислоты
СМ А- хромомицин Аз
DA -дистамицин А
DAPI - диамидино-2-фенилиндол
ETS - (external transcribed spacer) внешний транскрибируемый спейсер
G - остаток гуаниловой кислоты
GenBank- база данных нуклеотидных последовательностей NCBI ()
ITS - (internal transcribed spacer) внутренний транскрибируемый спейсер
K=G или Т
LSU - большая субъединица рибосом
М=А или С
NCBI- национальный центр биотехнологической информации при Институте здравоохранения США, содержащий открытую и доступную через Интернет базу данных GenBank, другие базы данных и системы поиска по ним
NTS - межгенные нетранскрибируемые спейсеры.
R=A или G
S=С или G
SSU - малая субъединица рибосом
Т - остаток тимидиловой кислоты
U - остаток уридиловой кислоты
UPGMA - невзвешенный парно-групповой метод с арифметическим усреднением, Uweighted Pair Group Method using Arithmetic averages
W=A или T
Y= С или T (пиримидиновый нуклеотид)
Введение к работе
Актуальность темы. Avena L. (Овес) - род однолетних и многолетних злаков трибы Aveneae. В странах древнего Средиземноморья распространено около 25-28 видов овса, из которых встречаются на территории бывшего СССР 12 (A. sterilis L., A. ludoviciana Dur., A. byzantina C.Koch, A.fatuaL., A. sativa L., A. barbata Pott ex Link, A. strigosa Schreb., A. wiestii Steud., A. clauda Dur., A. pilosa MB., A. ventricosa Balan., A. bruhnsiana Grun.) (Лоскутов, 2003) или 16 видов (кроме вышеперечисленных, Н.Н. Цвелев (1976) признает видовой статус за A. aemulans Nevski, A. volgensis (Vav.) Nevski, A. chinensis (Fisch. ex Roem. et Schult.) Metzg. и A. nuda L.). Вопросы происхождения и родства многих видов и эколого-географических форм Avena, их таксономическое положение и таксономический статус -предмет дискуссий, в ходе которых существенными аргументами являются результаты кариологических и молекулярно-генетических исследований (обзоры: Leggett, 1992с; Лоскутов, 2003).
Развитие методов молекулярной цитогенетики и геносистематики (молекулярной филогении) в конце XX века открыло принципиально новые возможности для сравнительного анализа геномов и кариотипов животных и растений. Эти подходы стали продуктивным инструментом современной биосистематики, направленной на изучение степени сходства и дивергенции исследуемых таксонов и определение наиболее вероятных путей их возникновения в эволюции. Применялись они и при исследовании таксономии и видообразования в роде Avena (Fominaya et al., 1988a,b; Leggett, Markhand, 1995; Li et al., 2000; Перчук и соавт., 2002; Drossou et al., 2004). Тем не менее, надо констатировать, что из всех родов злаков, представители которых являются экономически важными биологическими ресурсами (таких, как Triticum, Secale, Oryza, Zea, Hordeum), род Avena наименее изучен с молекулярно-цитогенетической и молекулярно-филогенетической точек зрения. Достаточно сказать, что, до начала наших исследований, данных о Q(DAPI)- и СМА-исчерченности хромосом Avena не было, а в базах данных нуклеотидных последовательностей можно было найти лишь последовательности ITS A. longiglumis (Chatterton et al., 1992) и A. sativa (Grebenstein et al., 1998), до сих пор только у двух видов Avena {A.fatua и A. sativa) секвенирован ген rbcL (Duvall et al., 1993; Salamin et al., 2004), только у двух видов {A. pilosa и A. sativa) частично секвенирован ген trnL (Gielly, Taberlet, 1994; James, Schmidt, 2004; Catalan et al., 2004), только у A. sativa секвенирован ген matK (Hilu et al., 1999). Эти разрозненные данные не давали информации о генетической (филогенетической) близости большинства видов рода Avena.
Кариосистематическое (с привлечением методов дифференциального окрашивания хромосом) и молекулярно-филогенетическое исследование дикорастущих представителей рода Avena L. представлялось нам актуальной темой исследований так как , это один из таксонов, некоторые представители которого имеют практическое значение как зерновые культуры, а другие как сорные травы, таким образом исследование дикорастущих «родственников» Avena актуально для селекционеров-практиков (Лоскутов, 2003). Изучение филогенетических взаимоотношений дикорастущих и культурных видов овса, может иметь значение для селекции, так как дикорастущие виды являются донорами хозяйственно-ценных признаков.
Важное обстоятельство, оказавшее влияние на выбор объекта настоящего исследования - доступность для кариологического и молекулярно-филогенетического исследования всех или почти всех видов этого рода, имеющего самое разнообразное географическое распространение, благодаря наличию богатой коллекции Всероссийского института растениеводства им. Н.И. Вавилова РАСХН, начало которой положили А.И. Мальцев и Н.И. Вавилов (Мальцев, 1930; Вавилов, 1965; Лоскутов, Мережко, 1997).
Цель и задачи работы. Цель нашего исследования сравнительно-кариологическое (с использованием нуклеотид-специфичных флуорохромов) и молекулярно-филогенетическое исследование видов рода Avena. В задачи исследования входило:
Изучить дифференциальную исчерченность хромосомных наборов диплоидных видов рода Avena, выявляемую с помощью нуклеотид-специфичных флуорохромов хромомицин Аз (СМА) и DAPI, и определить степень сходства кариотипов исследуемых видов по рисункам Q(DAPI)- и СМА-исчерченности хромосом.
Провести сравнительное исследование межвидовой дивергенции дикорастущих и культивируемых видов в роде Avena путем секвенирования и сравнительного анализа внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2 и генов 5.8S рРНК.
Определить геномный состав кариотипов недавно открытых видов Л. agadiriana B.R.Baum et Fedak и A. insularis Ladiz., а также геномный состав кариотипа и родство с остальными видами рода Avena единственного среди овсов многолетнего перекрестноопыляемого вида A. macrostachya Balansa ex Coss. et Dur., многими своими чертами напоминающего Helictotrichon.
4. Изучить частоты транзиций и трансверсий и определить пути изменений
последовательностей ITS1 и ITS2 и генов 5.8S рРНК в ходе дивергенции геномов Avena
типа А (подтипы Ad, Ас, Ар, As, А1) и типа С (подтипы Ср и Cv).
5. Картировать нуклеотидные замены, инсерции и делеции относительно элементов
вторичной структуры 5.8S рРНК и спейсерных районов пре-рРНК, с целью идентификации
и изучения природы эволюционно-лабильных и эволюционно-стабильных участков в пре-
рРНК и молекуле 5.8S рРНК, а также выявления случаев возможных синапоморфий и
гомоплазий.
6. Определить с помощью методов геносистематики филогенетические связи
между исследуемыми видами Avena и место рода Avena в трибе Aveneae и подсемействе
Pooideae.
Дифференциальное окрашивание нуклеотид-специфичными флуорохромами было . выбрано нами как инструмент для сравнительного кариологического исследования хромосом Avena так как этот метод позволяет не только выявлять рисунок гетерохроматиновых районов хромосом, но и дает информацию о их нуклеотидном составе (Schweizer, 1981). Выбор участка для секвенирования определялся тем, что исследуемый район включает как эволюциошю лабильные последовательности ITS1 и ITS2, так и эволюционно консервативный ген 5.8S рРНК и потому информативен в геносистематических исследованиях как на межвидовом уровне, так и при анализе взаимоотношений таксонов на уровне родов, семейств и таксономических единиц более высокого порядка. Именно этот район рекомендован в качестве одной из основных "мишеней" для сравнительного исследования всех видов растений по программе "ДНК-штихкодирование флоры" (Kress et at., 2005).
Научная новизна. Впервые с помощью нуклеотид-специфичных флуорохромов хромомицина Аз и DAPI проведено сравнительное исследование дифференциальной исчерченности хромосом диплоидных видов Avena longiglumis (геном Al), A. prostrata (Ар), A. strigosa (As), A. wiestii (As), A. hirtula (As), A. atlantica (As), A. damascena (Ad) и A. pilosa (Cp) и показана гетерогенность гетерохроматиновых районов хромосом Avena L. по нуклеотидному составу. На основании сравнения рисунка и композиции гетерохроматиновых районов, исследуемые виды могут быть систематизированы следующим образом: (((((A. strigosa, A. wiestii, A. hirtula, A. atlantica) A. prostrata) A. longiglumis) A. damascena) A. pilosa).
Впервые амплифицированы и секвенированы районы внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2 и гены 5.8S рРНК 25 видов рода Avena и с помощью методов геносистематики изучены филогенетические связи между всеми видами Avena.
Впервые исследована частота транзиции и трансверсии и путей изменения последовательностей ITS1 и ITS2 и генов 5.8S рРНК в разных филогенетических ветвях рода Avena.
Впервые показано, что все виды Avena имеют идентичные последовательности 5.8S рРНК, в которых идентифицированы эволюциционно консервативные и относительно вариабельные районы; впервые показано, что в эволюционно консервативных районах молекулы 5.8S рРНК всех Pooideae сохранились предковые для злаков последовательности, сохранившиеся кроме Pooideae у Bambusoideae и Ehrhartoideae, в то время как все виды арундиноидных триб, то есть, все Panicoideae, Aristidoideae, Centothecoideae, Chloridoideae, Arundinoideae (включая Molinid) и Danthonioideae, несут здесь две синапоморфные замены.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Шестой и Седьмой Санкт-Петербургских Ассамблеях молодых ученых и специалистов (Санкт-Петербург, 2001, 2002), 6-ой и 7-ой Путинских школах-конференциях молодых ученых "Биология - наука 21-го века" (Пущино, 2002, 2003), 14-ом Всероссийском совещании "Структура и функции клеточного ядра" (Санкт-Петербург, 2002), XI съезде Русского ботанического общества. (Новосибирск - Барнаул, 2003), на совместном заседании ВБО секции кариологии и кариосистематики и молекулярной систематики БИН РАН и секции Культурные растения ВИР (Санкт-Петербург, 2003), на семинарах лаборатории Биосистематики и цитологии БИН РАН (2003, 2005), VIII Молодежной конференции ботаников (Санкт-Петербург, 2004), III съезде ВОГиС (Москва, 2004), XVII International Botanical Congress (Вена, 2005), V Международном совещании по кариологии, кариосистематике и молекулярной филогении (Санкт-Петербург, 2005).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ.
