Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 6
1.1. Таксономическая структура подрода Nymphaea в Северной Евразии 6
1.2. Основные диагностические признаки 11
1.2.1. Макроморфологические признаки //
1.2.2. Палгшоморфологические признаки 13
1.3. Генетическая изменчивость североазиатских кувшинок и основные методы ее изучения 15
Глава II Материал и методика работы 18
II..1. Происхождение исследованного материала 18
II.2. Оценка степени сапробности водоема ...20
II.З. Геометрическая морфометрия 21
II.4. Морфология пыльцевых зерен 23
II.5. Статистический анализ морфологических данных 24
II.6. Выделение ДНК и анализ полиморфизма длин амплифицированных фрагментов 25
II.7. Сиквенирование участков хлоропластной ДНК и рибосомального транскрибируемого спейсера .28
II.8. Проточная цитометрия 30
Глава III . Изменчивость представителей рода Nymphaea в Северной Евразии 31
III. 1 . Деформация листовой пластинки при гербаризации 31
III.2. Внутрипопуляционная изменчивость формы листовой пластинки 32
III.3. Зависимость размерных характеристик кувшинки от степени сапробности водоема 32
III.4. Изменчивость макроморфологических признаков 35
III.5. Палиноморфология 42
ПІ.6. Анализ полиморфизма длин амплифицированных фрагментов 46
III.7. Хлоропластная ДНК 49
III.8. Рибосомальныи транскрибируемый спейсер 51
III.9. Относительное содержание ДНК 52
Глава IV . Систематика представителей рода Nymphaea в Северной Евразии 53
IV. 1. Учет изменений морфологии кувшинки при традиционных способах обработки живого
материала 53
IV.2. Зависимость размерных характеристик кувшинки от степени трофности водоема 54
IV.3. Внутрипопуляционная изменчивость морфологических признаков и их диагностическая ценность
55
IV.4. Систематика кувшинок на территории Северной Евразии 56
IV.5. Возможный сценарий эволюции евроазиатских видов кувшинки 59
Выводы 62
Список литературы 63
- Таксономическая структура подрода Nymphaea в Северной Евразии
- Происхождение исследованного материала
- . Деформация листовой пластинки при гербаризации
- Хлоропластная ДНК
Введение к работе
Кувшинки — одни из наиболее широко распространенных растений Северной Евразии, типичнейшие обитатели разнообразных водоемов и водотоков с замедленным течением, в которых они являются доминантами и содоминантами в сообществах макрофитов. Род Nymphaea традиционно относят к трудным в таксономическом отношении группам. Его систематика до сих пор вызывает серьезные разногласия (см. Borsch et al., 2007). На территории Северной Евразии разные авторы насчитывают от одного до 12 видов кувшинки (Коржинский, 1892; Комаров, 1937; Heslop-Harisson, 1955; Uotila, 2000). Такая неопределенность обусловлена высоким полиморфизмом кувшинок (Комаров, 1937; Heslop-Harrison, 1955), характер которого остается слабо исследованным. Отмечаемая многими исследователями интенсивная межвидовая гибридизация (Комаров, 1937; Федченко, 1940; Heslop-Harrison, 1955; Куприянова, 1976; Uotila, 2000; Папченков, 2003) до сих пор убедительно не доказана. В силу этого необходимо дополнительное исследование полиморфизма и изменчивости североевроазийских кувшинок как по всему комплексу используемых в их систематике морфологических признаков, так и по молекулярно-генетическим признакам, которым в настоящее время придают все большее значение при решении вопросов не только макро-, но и микросистематики высших растений (Антонов, 2006). Полученные результаты позволят уточнить таксономическую структуру комплекса форм Nymphaea, обитающих в Северной Евразии, и лучше понять специфику видообразования в этом роде. Четкое понимание таксономической структуры североевроазийских кувшинок и особенностей ее формирования в свою очередь позволит лучше уяснить особенности микроэволюции гидрофитов, характеризующихся дисперсными ареалами, и тем самым полнее представить закономерности становления современного биоразнообразия.
Таксономическое изучение кувшинок связано и с их хозяйственным значением. С одной стороны, кувшинки активно заселяют не только естественные, но и искусственно создаваемые водоемы (пруды, водохранилища), способствуя их заилению и провоцируя последующее заболачивание (Кудряшов, Садчиков, 2002). С другой стороны, многие популяции кувшинок находятся в депрессивном состоянии из-за разрушения их местообитаний и интенсивного сбора населением как декоративных и в меньшей степени — лекарственных растений, что стало причиной включения кувшинок во многие Красные книги (например, Красная книга Мурманской области, 2003; Красная книга Ростовской области, 2004). Для осуществления эффективных мероприятий по устойчивому сохранению кувшинок и рациональному использованию ресурсного и интродукционного
потенциала имеющихся их природных зарослей немаловажное значение имеет разработка методов надежной диагностики видов и уточнение их географического распространения.
На основании вышесказанного целью настоящей диссертации является изучение изменчивости и систематика представителей рода Nymphaea L. в Северной Евразии. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
Исследовать внутри- и межпопуляционную изменчивость таксономически значимых морфологических признаков;
Изучить генетическую изменчивость евроазиатских кувшинок;
Проанализировать характер изменения формы и размера листовых пластинок кувшинки при гербаризации;
Исследовать характер изменения формы и размера пыльцевых зерен кувшинки при ацетолизной обработке и в условиях высокого вакуума при сканирующей электронной микроскопии;
Выявить характер зависимости количественных морфологических признаков кувшинки от сапробности воды;
Уточнить таксономический статус форм Nymphaea, описанных с территории Северной Евразии;
Выявить диагностические макроморфологические и палиноморфологические признаки; '
Уточнить распространение видов кувшинки на территории Северной Евразии.
Объем и структура диссертации
Диссертация состоит из введения, четырех глав, списка литературы (152 названия, в том числе 103 на иностранных языках) и шести приложений. Работа изложена на 73 страницах машинописного текста, включая восемь таблиц и 15 рисунков. В приложениях общим объемом 23 страницы приводятся используемые в литературе диагностические признаки, перечень использованных для исследований пыльцы гербарных образцов и перечень исследованных популяций, значения исследованных признаков, а также определительный ключ для разграничения евроазиатских видов кувшинки.
Мы выражаем глубокую благодарность своему научному руководителю д.б.н. А.К. Тимонину. Мы искренне благодарны всем, кто оказывал нам всестороннее содействие при сборе материала в полевых условиях: участникам летних практик Московской Гимназии на Юго-Западе (№1543), проходивших под руководством СМ. Глаголева; зам. директора по НИР природно-исторического заповедника «Аркаим» Е. Чибилеву; зам. директора по НИР Кандалакшского государственного природного заповедника (ГПЗ) А.С Корякину, доценту Липецкого университета К.И. Александровой, директору Байкальского ГПЗ В.И. Сутуле, директору Костомукшского ГПЗ СВ. Тархову, сотруднице Ильменского ГПЗ Е.И. Вейсберг, сотруднику Хинганского ГПЗ СГ. Кудрину, директору Дальневосточного Морского ГПЗ А.Н. Малютину, сотруднице ГПЗ Северная Сосьва А.Л. Васиной и зам. директора по НИР Астраханского ГПЗ А.К. Горбунову, а также М. Кожину, Р. А. Муртозалиеву, G. Larsson, J.A. Dragon, международному обществу водных растений (International Waterlily and Water Gardening Society) и лично его члену СВ. Hellquist. Мы также благодарны сотруднице биологического факультета МГУ СВ. Полевовой за консультации в области палинологии, сотруднице биологического факультета МГУ О.В. Анисимовой за помощь в обработке гидробиологических проб и консультации по определению степени сапробности водоемов, сотруднику зоологического музея И.Я. Павлинову за консультации в области геометрической морфометрии, сотрудницам национального центра биосистематики г. Осло D. Enrich и Г.Л. Гусаровой за консультации по обработке молекулярных данных, сотрудникам Пражского ботанического института J. Suda, P. Travnicek и J. Rauchova за помощь в оценке относительного содержания ДНК, сотруднице центра биосистематики г. Осло V. Mirre за помощь в получении молекулярно-генетических данных, сотруднице ботанического института в Йене С. Ritz за консультации по оптимизации лабораторных протоколов, С. Brochmann (национальный центр биосистематики, Осло), А.Б. Шипунову (Морская лаборатория, Массачусетс), а также Т.Е. Краминой, СР. Майорову и Д.Д. Соколову (биологический факультет МГУ) за конструктивное обсуждение работы. Финансовая поддержка для выполнения лабораторных исследований была предоставлена исследовательским консульством Норвегии, национальным центром биосистематики Норвегии, академией наук Чехии и министерством образования, молодежи и спорта Чехии.
Таксономическая структура подрода Nymphaea в Северной Евразии
Существенная изменчивость диагностических признаков, характерная для евроазиатских кувшинок, и ее непрерывный характер затрудняют таксономическую обработку рода. Видовой состав северо-евразийских кувшинок почти два века остается предметом нескончаемых дискуссий. К. Линней (Linnaeus, 1753) все белоцветковые кувшинки северной Евразии относил к одному виду, Nymphaea alba L. Но уже Георги (Georgi, 1775) из низовий Ангары описал N. tetragona Georgi, отличающуюся выражено четырехгранной чашечкой и более мелкими размерами. Несколько позднее среди европейских кувшинок наряду cN. alba была описана TV. Candida Presl (Presl, Presl, 1822), которая отличалась от N. alba в основном отсутствием тычинок на верхней части завязи и восьмилучевым рыльцем цветка. Этот вид признавали также Engler и Diels (1891). Позднее был описан еще ряд видов, которые обсуждаются ниже. При анализе самостоятельности этих видов мы не обращались к типовым образцам, а изучали протологи, поскольку известно, что основные диагностические макроморфологические признаки в роде Nymphaea существенно изменяются при гербаризации (Лисицына, 2003).
В рамках «дробительского» подхода в Северной Евразии к настоящему времени выделено более 10 видов кувшинок. Встречающиеся в водоемах с неблагоприятными гидрологическими и эдафическими условиями формы, близкие к N. alba, но отличающиеся мелкими цветками и мелкими листьями, нередко трактовали как самостоятельные виды JV. minorijlora (Borb.) Wissjul. (Висюлина, 1950) и N. occidenialis (Ostenf.) Moss (Ostenfeld, 1912; Moss, 1920; Heslop-Harrison, 1975). Однако в прямых опытах с изменением гидрологических условий было показано, что варьирование размерных признаков у кувшинки является результатом фенотипической пластичности (Дубына, 1982), и, следовательно, правомерность выделения таких видов вызывает серьезные сомнения. Из N. Candida на основании окраски рыльца было выделено два вида: N. biradiata Sommer. с кроваво-красным с фиолетовым оттенком рыльцем (Sommerauer, 1833, цит. по: Крупкина, 2001) и N. punctata Kar. et Kir. с желтым рыльцем с красными точками на концах лучей (Karelin, Kirilow, 1841). В то же время еще СИ. Коржинским (1892) внутри одной популяции были отмечены все переходы между окраской рыльца, характерной для N. biradiata, и оранжевой окраской, присущей типичной N. Candida. Описанная А.А. Гроссгеймом (1930) на территории Абхазии и Грузии N. colchica (G. Wor.) A. Grossh., судя по оригинальному описанию, ничем не отличается от типичной N. Candida. Два сибирских вида были выделены из N. Candida на основании формы и размеров листовых пластинок и числа лучей рыльца цветка: N. pauciradiata Bunge отличается от типичной N. Candida меньшими размерами листьев и меньшим числом лучей рыльца: 8-9 штук (Meyer, Bunge, 1829), a TV. basniniana Turcz. описана на основании овальной (а не округлой) формы листа и также малого числа лучей рыльца: 9 шт (Turczaninow, 1842). Выделяемая из N. tetragona N. acutiloba DC (De Candolle, 1824) отличается от типичной N. tetragona лишь на основании выемчатозубчатого (а не цельного) края листовой пластинки. В то же время были описаны все переходные формы между растениями с цельным и выемчатым краем листа (Регель, 1862; Коржинский, 1892). Название Nfennica Mela (Mela, 1897, цит. по: Крупкина, 2001), ошибочно употребляемое некоторыми авторами для обозначения форм, близких к N. tetragona (см., например, Куприянова, 1976), относится к типичной форме N. tetragona (Колесниченко, 1977).
Большой интерес представляет описанная с юга Дальнего Востока N. wenzelii Maack, похожая на крупнолистную (22-27см х 13-16 см) и крупноцветковую (до 9 см в диаметре) форму N. tetragona (Маак, 1859). Ее также рассматривали как подвид N. Candida (Conard, 1905), как подвид (Регель, 1862) или форму (Коржинский, 1892) N. tetragona или даже как возможный межродовбй гибрид Nymphaea х Nuphar (Комаров, 1937).
Согласно единственной охватывающей большую часть территории Северной Евразии обработке (Комаров, 1937), на этой территории произрастают три вида кувшинки: N. alba s. str., N. Candida Presl и N. tetragona Georgi. N. alba распространена в Европе, N. Candida -в Европе и Сибири, N. tetragona — в Сибири, на Дальнем Востоке и в Фенноскандии (Комаров, 1937; Heslop-Harisson, 1955; Masters, 1974; Muntendam et al., 1996). Значения наиболее важных диагностических признаков для этих трех видов, содержащиеся в основных определителях и обработках, обобщены в табл. 1 (более подробно см. прил. 1). Легко видеть, что многие из них перекрываются. Кроме того, всем трем формам присуща высокая вариабельность морфологических признаков, по-разному проявляющаяся в разных частях ареала. Это отмечал еще R. Caspary (1865), описавший ряд морфологических форм внутри каждого из трех видов. Дубына (1982) отмечает чрезвычайно изменчивую морфологию N. alba, в особенности по размеру листовой пластинки. N. Candida в Липецкой области характеризуется как весьма изменчивый вид с сильно варьирующим размером всех частей растения (Флора Липецкой области, 1996), тогда как на Украине морфологические признаки этого вида колеблются в незначительной мере (Дубына, 1982). Отмечена высокая морфологическая изменчивость N. Candida и N. tetragona на Среднем Урале (Мамаев, Васфилова, 1983). Наряду с типичной формой N. tetragona на протяжении всего ареала этого вида встречается форма с более узкими чашелистиками и лепестками, более многолепестным венчиком (10-15 лепестков) и более узким основанием чашечки (Колесниченко, 1977). Это не только затрудняет диагностику конкретных растений, но и порождает определенные сомнения в правомерности различения TV. alba,N. Candida а N. tetragona (Коржинский, 1892).
Еще В.Л. Комаров (1937) отмечал крайне слабую изученность полиморфизма кувшинок и подчеркивал необходимость исследований живого материала, позволяющих выявить еще неизвестные внутривидовые подразделения кувшинки. Такие исследования, насколько нам известно, до сих пор не проведены в полной мере, и причины отмечаемого многими ботаниками высокого полиморфизма Nymphaea во многом остаются непонятыми.
Вероятно, существенную роль в возникновении наблюдаемого полиморфизма кувшинок играет выщепление локальных форм со своеобразными сочетаниями признаков. Это происходит из-за пространственной обособленности водоемов, заселенных кувшинкой, что, как правило, ограничивает скрещивание между особями пределами одной лишь заросли (Комаров, 1937; Heslop-Harrison, 1955). Выделять такие формы в V отдельные таксоны любого уровня, очевидно, неправомерно (Heslop-Harrison, 1955).
Принято считать, что морфологические признаки кувшинки зависят и от характеристик водоема, в котором они произрастают (Pearsall, 1917; Pearsall, 1920; Heslop-Harisson, 1952; Heslop-Harrison, 1955; Куприянова, 1976; Колесниченко, 1977). Указывают, что в старицах и мелких лесных озерах, в кислых олиготрофных водах с неблагоприятными гидрологическими (особенно температурными) и эдафическими условиями можно встретить кувшинки с мелкими цветками и листьями, меньшим числом лучей рыльца и более темной его окраской. В больших озерах мезотрофного типа, в старицах вдоль больших рек обычно обитают растения с более крупными цветками и листьями, большим числом лучей рыльца и более светлой его окраской (Pearsall, 1917; Pearsall, 1920; Heslop-Harisson, 1953; Heslop-Harrison, 1955; Куприянова, 1976; Колесниченко, 1977). Однако нам не известны количественные исследования влияния эдафических условий на морфологию кувшинок. В связи с этим изучение зависимости количественных морфологических характеристик признаков кувшинки от сапробности водоемов, в которых она произрастает, представляется нам актуальной задачей. _
Происхождение исследованного материала
В июне-сентябре 2004-2007 годов мы исследовали 91 популяцию кувшинки из следующих регионов России и Украины (рис. 1, номера регионов соответствуют обозначенным на схеме): 1 - окрестности г. Киев, Украина; 2 - Кизилюртинский район республики Дагестан; 3 — Володаровский и Наримановский районы Астраханской области; 4 — Новоусманский район Воронежской области; 5 — Грязинский район Липецкой области; 6 — Можайский и Одинцовский районы Московской области и Мосальский район Калужской области; 7 — Вышневолоцкий и Удомельский районы Тверской области; 8 - Костомукшский район республики Карелия; 9 - Лоухский район республики Карелия; 10 - Терский район Мурманской области; 11 - Кизильский район Челябинской области; 12 - Миассовский район Челябинской области; 13 - Советский район Ханты-Мансийского автономного округа; 14 - Кабанский район республики Бурятия и Слюдянский район Иркутской области; 15 - Архаринский район Амурской области; 16 - Хасанский район Приморского края. Мы считали отдельной популяцией кувшинки пространственно обособленную группу растений в соответствии с определением популяции, сформулированным Р. Перлем (Pearl, 1937). Таким образом, мы рассматривали как отдельные популяции не только группы кувшинок, произрастающих в различных небольших озерах, но и в разных плесах одного обширного озера.
Озерам, не имеющим названий на картах Генштаба масштаба 1:50 000, были присвоены условные названия, указанные далее в тексте в кавычках (прил. 2). Мы старались включить в программу исследований те популяции кувшинки, о таксономической принадлежности которых были ранее сделаны заключения специалистами по этой группе (В.Г. Папченков, Л.И. Лисицына - ИБВВ АН РАН). Мы также исследовали образцы кувшинки из Амурской области, которые соответствовали оригинальному описанию N. wenzelii и были собраны недалеко от locus classicus.
Число исследованных образцов в каждой популяции колебалось от одного до 15 и в среднем было равно семи. Образцы выбирали из популяции так, чтобы максимально полно охватить морфологическую изменчивость, наблюдаемую в популяции. Всего исследовано 664 образца. У каждого исследованного образца в полевых условиях регистрировали 6 качественных (цвет и форму рыльцевого диска, форму апекса цветка, форму крайних жилок листа, форму нитей внутренних тычинок, форму основания чашечки) и 5 количественных морфологических признаков (число лучей рыльца, длину и ширину листовой пластинки, длину наружного лепестка и диаметр круга, образованного наружными тычинками), приводимых как диагностические в большинстве определителей и таксономических обработок рода Nymphaea (табл. 1, рис. 2, прил. 1). Мы гербаризировали измеренные цветок и лист от одного образца из каждой популяции, сборы помещены в гербарий Московского университета им. Д.П. Сырейщикова (MW). Рисунок 2. Использованные нами промеры листовых пластинок кувшинки АС - ширина; DE - длина; BD - положение наибольшей ширины.
Оценка степени сапробности водоема Интегральным показателем эдафических условий водного биотопа является количество растворенной в воде органики, которое отражает количество органических веществ, возникших в процессе жизнедеятельности организмов на всех трофических уровнях, а также внесенных с водосбора в результате природных и антропогенных процессов. Количество растворенной в воде органики принято оценивать косвенно по набору видов-индикаторов и их обилию в пробе и выражать через индекс сапробности (Сладечек, 1967). В нашей работе был использован наиболее распространенный в странах Восточной Европы и СНГ метод расчета индекса сапробности Пантле-Бука в модификации В. Сладечека (1967). Индекс сапробности S, имеющий значение от 0 до 4, вычисляют по формуле: S=sxh/h, где s - сапробное значение организма-сапробионта в пробе, h - частота встречаемости сапробионта в пробе (Сладечек, 1967). В качестве сапробионтов-индикаторов, как показала С.С. Баринова (1992), наиболее перспективны водоросли, поскольку они встречаются практически во всех водоемах, что позволяет сравнивать водные объекты разного типа и расположенные в разных регионах. При изменении содержания органических веществ в воде изменяется видовой состав индикаторных видов водорослей и их обилие. Из огромного разнообразия пресноводных водорослей наиболее информативны диатомовые, видовой состав которых закономерно изменяется соответственно содержанию в воде органических веществ. Для оценки степени сапробности водоемов в местах сбора материала в 2004 г. мы помещали в пенициллиновый пузырек немного разнообразного донного материала (ил, песок, грунт, камни, обрастания, растительные остатки), доливали пузырек примерно на 2/3 его объема водой из исследуемого водоема и добавляли 4-6 капель 40% формалина для консервации. Дальнейшую обработку пробы вели на каф. микологии и альгологии биологического факультета МГУ под руководством и при участии О.В. Анисимовой. Несколько капель пробы наносили на покровное стекло, смешивали с несколькими каплями 33% перекиси водорода и нагревали на асбестовом столике до полного выгорания органики, добавляя перекись водорода по мере ее испарения. Далее на предметное стекло помещали небольшое количество твердого канадского бальзама, расплавляли его на горелке и накрывали образовавшуюся на предметном стекле каплю канадского бальзама покровным стеклом с прокаленной пробой. На полученных препаратах видны практически одни кремнеземные створки диатомовых водорослей, что существенно облегчило их определение. Расчет индекса сапробности производили по данным о видовом составе и по частоте встречаемости водорослей-индикаторов в пробе.
. Деформация листовой пластинки при гербаризации
Методом главных компонент не удается разграничить исследуемые таксоны кувшинок по форме листовой пластинки. В пространстве двух первых главных компонент все исследованные образцы составляют единое «облако» (рис. 3). Образцы, предварительно определенные нами как N. alba и N. tetragona (inch N. wenzelii), располагаются у противоположных краев этого «облака» (зона А и зона В соответственно), а образцы, предварительно определенные как N. Candida, находятся в его центральной части (рис. 4). Плотность точек в «облаке» неравномерна, но ни одно их скопление не приходится на имеющиеся у нас «эталонные образцы» N. Candida и N Крестиками обозначены «эталонные образцы». Листья до гербаризации показаны заполненными кругами, листья после гербаризации — пустыми. Стрелки соединяют одни и те же листья до и после гербаризации. Зона А — область образцов, определенных предварительно как N. alba, зона В - область образцов, определенных предварительно как N. tetragona. При гербаризации форма листовых пластинок заметно изменяется. Они становятся более продолговатыми, более заостренными на конце, выемка между лопастями листа сужается и углубляется (рис. 3, 4). Длина и ширина одной и той же листовой пластинки до и после гербаризации различаются с высокой степенью достоверности (одновыборочный тест Стьюдента: N = 32, t = 2.9; р = 0.005 и t = 3.9; р = 0.0003 соответственно). При гербаризации длина листовой пластинки уменьшается в 1.05-1.4 раза (среднее арифметическое±стандартное отклонение 1.3±0.2). Ширина листовой пластинки уменьшается в 1.15-1.5 раза (в среднем 1.35±0.2). Степень деформации листовой пластинки в продольном направлении достоверно не связана (г = 0.3;р = 0.1)со степенью ее деформации в поперечном направлении. Коэффициент деформации листовой пластинки (отношение степени ее деформации в продольном направлении к степени ее деформации в поперечном направлении) колеблется от 0.75 до 1.1 (в среднем 0,9±0,1).
Форма листовой пластинки у разных популяций кувшинки и ее изменение при гербаризации - популяция 217 (предварительно определенная как N. alba), свежий лист; 2 - тот же лист из популяции 217 после гербаризации; 3 - популяция 711 (предварительно определенная как N. tetragona); 4 - популяция 708 (предварительно определенная как N. Candida), свежий лист; 5 - популяция 737 (предварительно определенная как N. wenzelii), свежий лист.
Мы не обнаружили статистически значимых корреляций размерных характеристик кувшинки со значением индекса сапробности (рис. 5) или достоверных различий в размерах кувшинок, произрастающих в водоемах второго и третьего классов чистоты воды (табл. 5). Таблица 5. Зависимость размерных характеристик кувшинки от класса чистоты воды
Уровень внутрипопуляционной изменчивости отдельных макроморфологических признаков довольно высок (прил. 5). Это не относится только к форме основания чашечки цветка (рис. 6, А-С), всегда постоянной в пределах одной популяции. Для популяций, предварительно отнесенных нами к N. alba, было характерно округлое основание чашечки, к N. Candida - округло-четырехгранное, а к TV. tetragona (incl. N. wenzelii) - четко четырехгранное (табл. 6). Единственным исключением была популяция из Челябинской области (121), отнесенная нами к N. Candida. Два из четырех образцов, исследованных из этой популяции, имели округлую форму основания чашечки (прил. 5).
Форма нитей внутренних тычинок (рис. 6, D-F) варьирует от линейной до обратно-ланцетной в ряде популяций, предварительно отнесенных нами к N. Candida, из республики Карелия, Ханты-Мансийского АО, Иркутской, Челябинской и Воронежской областей. Для ряда популяций, предварительно определенных нами как N. Candida, из Ханты-Мансийского АО, Тверской, Челябинской, Калужской и Иркутской областей характерна только линейная форма нитей внутренних тычинок. Для всех остальных популяций, предварительно определенных нами как N Candida, характерны внутренние тычинки с обратно-ланцетными нитями (прил. 5). Во всех популяциях, предварительно определенных нами как N. alba, отмечены линейные нити внутренних тычинок, а во всех популяциях, определенных как N. tetragona s. str. (исключая N. wenzelii) - овальные (табл. 6). Только в популяции 734, отнесенной нами предварительно к N. tetragona, нити внутренних тычинок у двух из семи исследованных образцов были обратно-ланцетным и (прил. 5). Для образцов двух (из трех исследованных) популяций, предварительно отнесенных нами к N. wenzelii, была характерна обратно-ланцетная форма нитей внутренних тычинок (прил. 5).
Группы, выделенные на основании многомерного шкалирования морфологических данных: alba — группа эталонного образца N. alba, cand — группа эталонного образца N. Candida, tetr — группа эталонного образца , tetragona (не включены популяции 732, 737,738, определенные предварительно как N. wenzelii, см. прил. 5).
Значения признаков, в скобках указана доля образцов с данным значением признака (в процентах от общего числа образцов в данной группе): ST.SH — форма рыльцевого диска (1 - плоский, 2 — слабо вогнутый, 3 - сильно вогнутый); ST.COL — цвет рыльцевого диска (1 — желтый, 2 - розовый, 3 — оранжевый, 4 - красный); PROC - форма апекса цветоложа (1 - короткий полушаровидный, 2 -длинный конический); VEIN - форма первых главных жилок листа (1 - прямые, 2 - изогнуты в первой трети своей длины, 3 -изогнуты по всей длине); STAM - форма нитей внутренних тычинок (1 -линейная, 2 - обратно-ланцетная, 3 — овальная); CUP — форма основания чашечки цветка (1 — округлая, 2 — округло-четырехгранная, 3 — четырехгранная, 4 - четко четырехгранная с выступающими ребрами).
Типичные значения признаков (95% доверительный интервал): RAYS - число лучей рыльца; L.LEAF - длина наибольшей листовой пластинки (мм), D.LEAF - ширина наибольшей листовой пластинки (мм), PETAL - длина наружного лепестка (мм); ST.ROU - диаметр круга, образованного внешними тычинками на полностью раскрытом цветке (мм).
Изменчивость остальных исследованных качественных макроморфологических признаков (форма и цвет рыльца, форма апекса цветоложа и форма главных жилок) внутри популяций не уступала различиям между популяциями.
Форма рыльца цветка в трех популяциях из Астраханской области, предварительно отнесенных нами к N. alba, была плоской, в одной (217) - слабо вогнутой, еще в одной (214) — варьировала от плоской до слабовогнутой. Для трех популяций из окрестностей г. Киев, отнесенных нами предварительно к N. alba, бьшо характерно сильно вогнутое рыльце, а в одной популяции (701) форма рыльца варьировала от плоской до сильно вогнутой. Во всех популяциях, предварительно отнесенных нами к N. tetragona (incl. N. wenzelii), отмечено сильно вогнутое рыльце, за исключением популяции 711 (Ханты-Мансийский АО) со слабо вогнутым рыльцем и популяции 201 (республика Бурятия), в которой форма рыльца варьировала от плоской до сильно вогнутой. В некоторых популяциях, предварительно отнесенных нами к N. Candida, из республики Карелия, Тверской и Московской областей отмечено слабо вогнутое рыльце, в нескольких популяциях из республики Карелия, Московской, Челябинской и Воронежской областей форма рыльца варьирует от слабо до сильно вогнутого, для остальных популяций характерно сильно вогнутое рыльце.
Хлоропластная ДНК
Для проверки гипотезы о гибридном происхождении N. Candida был проведен тест назначения. Перед проведением теста образцы, определенные как N. tetragona, были разделены на две группы, согласно результатам анализа главных координат (Северный Урал и Дальний Восток). В тестах назначения AFLP-фенотип был отнесен к какой-либо группе, если вероятность его принадлежности к этой группе была в 100 раз выше, чем к какой-либо другой группе, в противном случае AFLP-фенотип не был отнесен ни к одной из групп. Подавляющее большинство образцов N. Candida (61 образец) были отнесены к симулированному гибриду первого поколения между N. alba и североуральскими N. tetragona, еще восемь образцов N. Candida не были отнесены ни к одной из групп.
Среднее внутрипопуляционное генетическое разнообразие Nei было наивысшим для N. Candida (0.29±0.043, среднее арифметическое±стандартное отклонение), более низким, но все же достаточно большим для N. alba (0.21±0.043) и самым низким для N. tetragona — включая N. wenzelii — 0.12±0.030. Эти межвидовые различия были статистически значимыми (р 0.05, Tukey honest significant difference test). Мы не сравнивали значения генетического разнообразия для отдельных популяций, поскольку исследовали недостаточно образцов в каждой популяции, чтобы такие сравнения были корректными (Bonin et al., 2007).
Объединенная матрица двух участков хлоропластной ДНК (спейсеры/?еЛ-/«6Е и rpl32rriL) состояла из 1992 выравненных позиций, из которых 769 были информативными (из них 17 в подроде Nymphaed). В результате анализа матрицы получено единственное наиболее экономное филогенетическое дерево (после исключения деревьев с нулевой длиной ветвей) с 822 шагами (индекс постоянства: 0=0.93, индекс устойчивости: RI=0.98, исключая неинформативные позиции) (рис. 13). Все представители подрода Nymphaea образовали кладу с высоким уровнем бутстреп поддержки (100%), находящуюся в сестринской позиции по отношению ко всем тропическим видам Nymphaea. Внутри подрода Nymphaea выделяются две клады с высоким уровнем бутстреп поддержки: tetragona-группа и а/ба-группа (100% и 89% соответственно). Первая группа состояла из всех образцов N. tetragona (включая W. wenzehr), а также из карельских N. Candida. Вторая группа включала все образцы N. alba и оставшиеся N. Candida. Каждая из этих групп была представлена одним гаплотипом. Единственным исключением был гаплотип одного образца N tetragona (популяция 740) с побережья Японского моря, отличавшийся от типичного "tetragona-rannoTrnia" на один нуклеотид (Т вместо С в позиции 1295 спенсера petL-psbE). Эти две клады - tetragona-группа и alba-трутта - находились в сестринской позиции (бутстреп поддержка 73%) по отношению к североамериканским представителям подрода Nymphaea (N. odorata и N. mexicand).
Матрица последовательностей рибосомального транскрибируемого спейсера (ITS) состояла из 732 позиций, 381 из которых была информативной (из них 19 в подроде Nymphaed). В результате анализа матрицы получено шесть наиболее экономных филогенетических деревьев (после исключения деревьев с нулевой длиной ветвей) с 664 шагами (индекс постоянства: С1=0.83, индекс устойчивости: RI=0.95, исключая неинформативные позиции) (рис. 14). Топология филогенетических деревьев, основанных на последовательностях ITS, в общих чертах совпадает с топологией филогенетических деревьев, основанных на последовательностях хлоропластной ДНК. Все представители подрода Nymphaea образовали кладу с высокой бутстреп поддержкой (100%), находящуюся в сестринской позиции по отношению ко всем тропическим видам рода. Внутри подрода Nymphaea выделяются две клады: tetragona-труппа, состоящая из образцов N. tetragona (включая "N. wenzelii") и alba-группа, включающая все образцы N. alba и N. Candida (бутстреп поддержка 100% для обеих клад). Каждая из этих групп была представлена одним гаштотипом. Единственным исключением были два образца N. alba (популяции 217 и 805) с побережья Каспийского моря, отличавшиеся от типичного "alba-гаплотипа" на один нуклеотид (С вместо Т в позиции 618). Нуклеотидные последовательности образцов из восьми популяций имели от одной до пяти полиморфных позиций каждая. Нуклеотидная последовательность одного образца N. Candida (популяция 720) имела одну полиморфную позицию, сочетающую нуклеотидные основания, характерные для N. alba и N. tetragona. Интересно, что два образца N. alba с побережья Каспийского моря имели четыре одинаковых полиморфизма в нуклеотидных последовательностях. Образцы, определенные как "N. wenzelii" (популяции 732, 737, 738), имели одну идентичную полиморфную нуклеотидную позицию. Североамериканские представители подрода Nymphaea (N. odorata и N. mexicand) образовали кладу с низкой бутстреп поддержкой (63%) в сестринской позиции по отношению к alba-rpyrmc.
