Содержание к диссертации
Введение
Состав сред, используемых для культивирования микобактерий 34
Выделение тотальных нуклеиновых кислот (НК) 34
Выделение тотальных рибонуклеиновых кислот (РНК) 35
Конструирование внутреннего калибровочного стандарта (ВКС) для определения количества мишени с использованием реакции обратной транскрипции (ОТ) и полимеразной цепной реакции (ПЦР) 35
Применение внутреннего калибровочного стандарта для
определения количества мишени в ПЦР и ОТ-ПЦР реакциях 37
Подбор прайм еров для количественных ПЦР и ОТ-ПЦР систем 37
Условия проведения реакции обратной транскрипции 38
Условия проведения ПЦР реакции 39
Характеристика количественных ПЦР и ОТ-ПЦР систем 39
Детекция продуктов амплификации 40
Програмное обеспечение экспериментальной работы 40
Результаты и обсуждение 41
Исследование генов М. tuberculosis в качестве маркеров жизне способности и персистенции 41
Разработка количественных ПЦР и ОТ-ПЦР систем для изучения экспрессии генов М. tuberculosis 42
Тестирование специфичности ПЦР и ОТ-ПЦР систем 42
Внутренние калибровочные стандарты (ВКС) 43
Определение чувствительности количественных ПЦР и ОТ-ПЦР систем 45
Определение чувствительности количественных ПЦР систем 45
Определение чувствительности количественных ОТ-ПЦР систем 47
Многопраймерная реакция обратной транскрипции 48
Использование ВКС для количественного определения исследуе мой мишени в ПЦР и ОТ-ПЦР системах 50
2.5.1. Определение оптимального количества внутреннего калибровочного стандарта (ДНК-ВКС) для количественных ПЦР систем
2.5.2. Определение оптимального количества внутреннего калибровоч- ^ ного стандарта (РНК-ВКС) для количественных ОТ-ПЦР систем
2 5 Определение исходного количества числа копий ДНК (мРНК) ми
шени в препарате 52
2.7. Тестирование образцов на отсутствие деградации РНК 54
2.8. Выбор нормировочного маркера для сравнительного исследования количества специфических мРНК 54
Исследование генетических маркеров жизнеспособности М. Ш- 55 berculosis на моделях in vitro
3. Подбор системы ген - индуктор, позволяющей увеличить количество специфических мРНК М tuberculosis в исследуемом образце в пересчете на количество геном - эквивалента 55
4. Исследование генов dnaK, sigH \\JbpB в качестве маркеров жизнеспособности М. tuberculosis 58
5. Исследование гена dnaK в качестве маркера жизнеспособности как показателя действия рифампицина и изониазида на референс -штаммы М. tuberculosis 66 Исследование генетических маркеров персистенгцин М. tuberculosis на моделях in vitro
6. Использование молекулярно - генетических маркеров для нормирования состояния клеточной популяции М. bovis BCG в условиях моделей персистенции in vitro 73
7. Исследование динамики изменения экспрессии генов М. bovis BCG на разных стадиях персистенции на моделях in vitro
Исследование корреляции между уровнем экспрессии генов sigF, dosR, acr, Rv2623 и уровнем толерантности перс патентной культу ры М. bovis BCG к рифампиципу и метронидазолу 84
VI. Выводы 89
VII. Список литературы
- Выделение тотальных нуклеиновых кислот (НК)
- Исследование генов М. tuberculosis в качестве маркеров жизне способности и персистенции
- Многопраймерная реакция обратной транскрипции
- Исследование генов dnaK, sigH \\JbpB в качестве маркеров жизнеспособности М. tuberculosis
Введение к работе
По данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) ежегодно в мире туберкулезом заболевают более 10 млн. человек и умирают около 3 млн. человек, при этом ежегодно в России от туберкулеза умирают 30 тысяч человек (Покровский В.В., 2003). По разным оценкам треть населения нашей планеты инфицирована микобактериями туберкулеза и подвержена опасности развития острой формы этого заболевания (Wayne LG. et al, 2001). В этой связи актуальность изучения всех аспектов этой опасной инфекции очевидна.
Несмотря на проводимую в ряде стран массовую иммунизацию против туберкулеза, заболеваемость туберкулезом продолжает расти. Разрастающаяся эпидемия туберкулеза в мире обусловлена несколькими факторами:
- ненадежность протекции, обеспечиваемой вакцинацией BCG (bacillus Cal-mette Guerin) (Bloom В. R., 2002);
- демографические сдвиги;
- интенсивная миграция населения;
- распространение штаммов микобактсрий с лекарственной устойчивостью и множественной лекарственной устойчивостью (Бастиан И. и Порталь Ф., 2003);
- нарушение функций иммунной системы у людей, инфицированных вирусом иммунодефицита человека (Покровский В.В., 2003);
- переход латентных форм туберкулеза в клинически манифестное заболевание (Voskuil M.I. et al., 2003).
Обращаясь к проблеме латентного туберкулеза, важно отметить, что латентное состояние туберкулезной инфекции обусловлено существованием М. tuberculosis в персистентном состоянии в организме человека или животного. Термином персистенция в литературе обозначают состояние М. tuberculosis in vivo, характеризующееся образованием морфологически и функционально измененных форм микобактерий, практически не чувствительных к противотуберкулезным препаратам и обладающих низким уровнем метаболической активности. В этом состоянии микобактерий не дают роста на твердых питательных средах. Показано, что при поглощении макрофагами, клетки микобактерий трансформируются в зернистые и L - формы, спороподобные (вегетативные) формы (Герасимов В.Н. и соавторы, 2003). В зарубежной литературе для обозначения видоизмененных форм микобак терий используют термин «dormant» (спящий), означающий нахождение микобак терий в метаболически неактивном нерепликативном состоянии (Wayne L.G. et al., 1998).
Для изучения феномена персистепции М. tuberculosis были разработаны модели персистепции in vitro, простые в исполнении и использовании, а таюке исключающие действие стресс - факторов, характерных для имунного ответа организма на присутствие микобактерий (Wayne L.G. et al., 2001). Одной из основных причин создания таких моделей in vitro являлось отсутствие методов, позволяющих исследовать генетические аспекты проблемы персистепции in vivo.
Персистенция микобактерий представляет собой серьезную проблему, так как персистентные Ы. tuberculosis способны к реактивации в активную форму, что может обеспечивать рецидивы инфекции. В связи с этим, существует необходимость в создании быстрых и надежных методов выявления латентных форм туберкулеза. Процесс создания диагностических реагентов для определения латентных форм туберкулеза долгий и многостадийный. В результате должен быть определен белковый продукт, обладающий высоким уровнем специфичности (в отношении персистентных форм микобактерий) и иммуногенности. Для этого в первую очередь необходимо определить адекватные генетические маркеры персистепции - гены М. tuberculosis. Представленные в данной работе исследования, проведенные на моделях in vitro являются первым шагом на пути к решению этой задачи.
Необходимо отметить, что к началу дайной работы о проблеме персистепции М. tuberculosis было опубликовано много работ, но основные исследования проводились с использованием микробиологических методов, а генетические механизмы, детерминирующие основные процессы перехода популяции микобактерий в состояние персистепции, были мало исследованы (Герасимов В.Н. и соавт., 2003; Дорожкова И.Р. и соавт., 1995; Прозоровский СВ. и соавт., 1985). Существовали лишь отрывочные данные, позволяющие предполагать, что изменение физиологического состояния микобактерий связано с изменением уровней экспрессии определенной группы специфических генов (Boon C.et al., 2001; Wayne L.G. et al., 2000). Задача быстрого определения жизнеспособности популяции М. tuberculosis поставлена в мировой науке давно и продолжает оставаться актуальной (Hellyer T.J., 1999). Определение жизнеспособности популяции микобактерий является основой для создания методов определения лекарственной устойчивости, а таюке методов, позволяющих в короткие сроки тестировать эффективность действия новых лекарственных препаратов с использованием референс - штаммов Ы. tuberculosis.
Консолидация новейших исследований в области генетики М. tuberculosis и многолетних наработок в области микробиологии возбудителя туберкулеза позволила составить представление о вариабельности функциональных состояний, характерных для клеточной популяции микобактерий. На сегодняшний день известно, что популяция микобактерий, находясь в физиологически и морфологически измененном состоянии (персистенция) отличается устойчивостью к разного рода стрессовым воздействиям, в том числе к действию аптимикобактериальиых препаратов. В данном случае устойчивость не обусловлена мутациями (Хоменко А.Г., 1996; Wayne L.G. et al., 2001). Для изучения этого феномена важно использовать лабораторные методы, позволяющие в короткие сроки определять жизнеспособность микобактериалыюй популяции in vitro, работающие независимо от механизма, детерминирующего устойчивость к лекарственному препарату. По критерию универсальности перспективными являются фенотипические методы, основанные на определении изменений метаболического статуса популяции микобактерий, где определение жизнеспособности М. tuberculosis, как показателя действия лекарственных препаратов можно проводить для всего спектра аитимикобактериальных препаратов и независимо от физиологического состояния, в котором находится популяция микобактерий. Одним из быстрых способов определения роста микобактерий в присутствие антибиотика является определение содержания рибонуклеиновых кислот в исследуемой культуре микобактерий (Jou N.T., 1997). Необходимо отметить, что данная методика требует наличия адекватного генетического маркера (гена) и быстрого способа регистрации количества данной мишени.
Существенным недостатком практического применения данного подхода является низкое содержание специфических мРНК в культуре микобактерий. В связи с этим цель данной работы состояла в исследовании индуцибельных генов в качестве маркеров жизнеспособности М. tuberculosis и подборе такой системы ген - индуктор, использование которой позволит увеличить исходное количество специфической мРНК в клетке и тем самым сделает детекцию лабильной мишени более точной.
Выделение тотальных нуклеиновых кислот (НК)
На основании сравнительного изучения организации геномов М. bovis BCG и М. tuberculosis было сделано заключение о высокой степени гомологии геномов этих микроорганизмов (S.Cole et al., 1998). С учетом морфологических, гистопато-логических особенностей, особенностей клинического течения заболевания, М. bovis (BCG) отнесена к комплексу М. tuberculosis. Эти факты позволили исследователям использовать М. bovis BCG в качестве безопасной лабораторной модели. В частности, некоторые авторы использовали М. bovis BCG для изучения экспрессии генов и продукции белков, ассоциированных с персистенцией микобактерий на моделях in vitro (С.Boon et al.„ 2001; Lim A. et al., 1999). Анализ работ и выводы авторов позволяют сделать заключение о том, что некоторые вопросы, касающиеся генетических механизмов длительного выживания микобактерий в модельных условиях in vitro могут быть изучены с использованием штамма М. bovis BCG в качестве модельного, с последующей экстраполяцией результатов для М. tuberculosis. Это особенно актуально в том случае, если постановка эксперимента включает необходимость получения больших объемов культуры М. tuberculosis (более 5-10 мл.), но при этом должна соответствовать нормам безопасности, соблюдение которых является обязательным при работе с патогенными микроорганизмами. Выбор М. bovis BCG в качестве модельного штамма был обусловлен необходимостью работать с большими объемами культуры микобактерий (200 мл.) при изучении динамики экспрессии генов микобактерий на поздних стадиях персистенции в моделях in vitro, где низкий уровень метаболической активности популяции микобактерий не позволяет получить достаточное количество мишени для проведения количественной ОТ-ПЦР с использованием малого количества клеточного материала.
Очевидно, что при изучении некоторых иммунологических, эпидемиологических и биохимических аспектов жизнедеятельности М. tuberculosis, нельзя использовать М. bovis BCG в качестве модельного штамма. Причина этого заключается в существовании ряда генетических различий между этими микроорганизмами, определяющих разницу в антигенных свойствах и некоторых стадиях биохимических процессов.
В этой связи, в своей работе мы использовали только те гены, идентичность которых доказана как для М. tuberculosis, так и М. bovis BCG (C.Boon et al.„ 2001; LimA.etal., 1999).
Выращивание культур M. tuberculosis и M. bovis BCG проводили в жидкой питательной среде Middlebrook 7НВ Broth («Difco», №0713-17) в различных модельных условиях, определенных целями данной работы: Аэробные условия роста М. tuberculosis и М. bovis BCG
Выращивание культур М. tuberculosis и М. bovis BCG проводили в колбах объемом 200 мл с объемом среды 100 мл. Культуру микобактерий выращивали до логарифмической фазы роста (OD5go- 0,5) и разводили до OD58o= 0,005 в конечном объеме свежей ростовой среды. Модель Wayne «без перемешивания» («Wayne dormancy model without stir ring»).
Культуру M, bovis BCG выращивали в 10 мл среды в плотно закрытом пластиковом матраце (объемом 25 мл фирмы "Linbro") при 37С без перемешивания. Получаемая таким образом анаэробная культура соответствовала описанной в литературе модели персистенции «Wayne dormancy model without string» (Wayne L.G. etal,2001): Модель «поздней стационарной фазы» («Wayne old stationary phase model») Культуру M. bovis BCG выращивали в 100 мл среды в колбе объемом 200мл. при 37С без перемешивания в течение 240 дней. Модель Wayne «с перемешиванием» («Wayne dormancy model with stirring») Культуру M. tuberculosis выращивали в 10 мл среды в плотно закрытом мат раце (объемом 25 мл) с медленным перемешиванием (40 об./мин.). Получаемая та ким образом анаэробная культура микобактерий соответствовала описанной в ли 34 тературе модели персистенции «Wayne dormancy model with string») (Wayne LG. et al., 2001).
(Выращивание культуры M. tuberculosis в условиях модели «Wayne dormancy model with stirring» проводилось в National Jewish Center, Денвер, Колорадо, США).
Выращенную микобактерпальную культуру разливали по 1 мл в пробирки (1,5 мл типа Эппендорф), центрифугировали при 5000 об./мин. в течение 5 минут при комнатной температуре, супернатант удаляли.
Осадок микобактерий хранили при - 70 С до момента использования.
2. Состав сред, используемых для культивирования микобактерий.
Middlebrook-бульон (1 литр): Н20 - 900 мл, сухая среда Middlebrook - 47 г, глицерин - 2 мл, Tween 20 - 0,5 г, добавка ADC - 20 мл. Middlebrook - агар (1 литр): Н20 - 900 мл, сухая среда Middlebrook - 47 г, глицерин - 2 мл, Tween 20 - 0,5 г, добавка ADC - 20 мл, агар -3,75 г.
3. Выделение тотальных нуклеиновых кислот (НК).
Центрифугировали 1 мл пробы при 5 000 об./мин. в течение 5 мин, К осадку клеток добавляли 1 мл 0,5 % раствора Tween 80. Встряхивали на вортексе до получения гомогенной взвеси. Центрифугировали при 10 000 об./мин. - 30 сек. Супернатант удаляли. К осадку клеток добавляли 100 мкл стеклянной дроби (Glass Beads 0,1 мм диаметром, обработанных НС1 - рН = 2), Добавляли 100 мкл холодного ли-зирующего буфера (100 мМ Li СІ; 10 мМ трис рН = 7,8; 10 тМ ЭДТА; додецил -сульфат Na - 1% ), Встряхивали на вортексе при максимальной скорости в течение 4 мин. Однократно заморозили (- 70С) в течение 20 мин. Добавляли еще 200 мкл того же буфера, встряхнули на вортексе 10 сек. Добавляли 750 мкл смеси - фенол: хлороформ: изоамиловый спирт-25: 24:1 (ICN Biomedical Inc.) перемешали переворачиванием 5-6 раз. Инкубировали в ледяной бане 15 мин. Центрифугировали при 12 000 об./мин. - 20 мин при + 4 С. Переносили водную фазу в чистую пробирку и добавили равный объем изопропанола. Выдерживали при - 70С в течение 2 часов. Центрифугировали при 12 000 об./мин. - 20 мин при + 4С. Осторожно удаляли супернатант. Добавляли 1 мл 75% этанола. Перемешивали переворачиванием 5 - 6 раз. Центрифугировали при 12 000 об./мин. - 5 мин. Добавляли 1 мл 75% этанола. Перемешивали переворачиванием 5-6 раз. Центрифугировали при 12 000 об./мин. - 5 мин. Максимально удаляли супернатант, не затрагивая осадка.
Подсушивали открытые пробирки на столе 15 мин. при комнатной температуре. Элгаировали осадок в 100 мкл деионизированной воды.
4. Выделение тотальных рибонуклеиновых кислот (РНК). Препараты тотальных РНК получали так же, как и тотальных НК до этапа элю-ции. Затем в каждую пробирку добавляли 30 мкл смеси: из расчета 2 ед. фермента ДНК-азы I («Fermentas») - 2 мкл, 40 ед. ингибитора РНК - аз (Rnasin, Ribonuclease Ingibitor «Fermentas») - 1 мкл, 10 x реакционный буфер - 3 мкл, 24 мкл деионизо-ванной НгО. Перемешивали на вортексе 10 сек, центрифугировали 2500 об./мин. -10 сек. Инкубировали при 37 С - 15 мин. Потом добавляли 20 мкл 0,5 мМ раствора ЭДТА. Перемешивали пипетированием и ставили в термостат для инактивации ДНК-азы при 65С в течение 10 мин. Полученные пробы хранили при - 70С.
В опытах по выделению тотальной РНК использовали осадки содержащие от 10б до 109 клеток. Использованный протокол выделения позволял получать в среднем 5 - 8 нг тотальной РНК в расчете на 106 клеток. 5. Конструирование внутреннего калибровочного стандарта (ВКС) для определения количества мишени с использованием ПЦР и ОТ-ПЦР. Принцип конструирования ДНК-ВКС заключается в получении вектора со встроенной генетической последовательностью специфического гена, содержащего неспецифическую вставку размером 80 - 120 н.п. (Рис. 3).
Исследование генов М. tuberculosis в качестве маркеров жизне способности и персистенции
Путем анализа литературных данных мы отобрали гены М. tuberculosis для их исследования в качестве потенциальных маркеров жизнеспособности и персистенции. Для выбора потенциальных генетических маркеров жизнеспособности М. tuberculosis были определены следующие критерии: - гены должны обладать высоким уровнем конститутивного синтеза или являться стресс - индуцибельными.
Этим критериям в частности соответствовал высоко экспрессивный ген fbpB, кодирующий 85В белок (а-антиген) - один из наиболее экспрессивных белков) (Heller et. al., 1998). Использование в наших экспериментах хорошо изученного ге-па/bpB позволило провести сравнительное исследование новых генетических маркеров жизнеспособности относительно уже исследованного гена М. tuberculosis. Для выбора потенциальных генетических маркеров персистенции М. tuberculosis были определены следующие критерии: - отсутствие или сравнительно низкий уровень экспрессии в активно-растущей культуре микобактерий; - высокий уровень экспрессии при переходе микобактерий из стадии активного роста в стадию персистенции in vitro, позволяющий достоверно детектировать специфические мРНК (Таб.5). 2. Создание количественных ПЦР и ОТ-ПЦР систем для изучения экспрессии генов М. tuberculosis.
Анализ литературных данных по дифференциальной экспрессии генов микроорганизмов позволил нам сделать предположение, что профиль специфических мРНК может служить показателем любого физиологического состояния популяции мико-бактерий: вегетативные формы - персистентные (покоящиеся) формы - мертвые клетки.
Методическим принципом нашей работы было исследование дифференциальной экспрессии генов M.tuberculosis путем сравнительного определения количества специфических мРНК.
Исследуемые в работе образцы мРНК были нормированы на количество геном -эквивалента.
С целью нормирования образцов и количественной оценки экспрессии генов М. tuberculosis разработаны количественные ПЦР и ОТ-ПЦР системы на каждый исследуемый ген: dnaK, sigH, recA, sigA, sigB, sigF, dosR, acr, JbpB, Rv3133c, Rv2623,J6S, IS6110 (Таблица 4 и 5, Материалы и Методы).
Принцип определения количества исследуемой генетической мишени в реакции ПЦР и ОТ-ПЦР подробно описан в Материалах и Методах.
Анализ специфичности ПЦР и ОТ-ПЦР систем проводили с помощью ДНК Homo sapience и ДНК сопутствующей микрофлоры легких человека. Для проведения анализа на специфичность использовали минимальные детектируемые количества (НПЧ) М. tuberculosisH37Rv и препараты ДНК других микроорганизмов, количество ДНК которых превышало в 1000 - 10 000 раз исследуемое количество ДНК М. tuberculosis H37Rv. Результаты тестирования праймерных пар на специфичность представлены в Таб. 6. добрано 2-3 пары праймеров. В результате последующего тестирования ПЦР и ОТ-ПЦР систем на чувствительность были отобраны пары праймеров, оптимальные для использования в количественных ПЦР и ОТ-ПЦР системах (Таб.2, Материалы и Методы).
Внутренние калибровочные стандарты.
Для количественных ПЦР и ОТ-ПЦР систем на гены М. tuberculosis (Таблица 5) методами генетической инженерии были получены молекулярные ДНК и РНК-стандарты.
ДНК - стандарт (ДНК-С) представляет собой клонированный специфичный ам-пликон, размер которого соответствует размеру ампликона мишени (Рис.3) ДНК - внутренний калибровочный стандарт (ДНК-ВКС) - клонированный ам-пликон имеющий дополнительный фрагмент ДНК, увеличивающий результирующий размер ампликона на 100-150 нуклеотидов относительно размера ампликона мишени. (Рис.3)
РНК - стандарт (РНК-С) представляет собой транскрипт, соответствующий ам-пликону обычных размеров. РНК внутренний калибровочный стандарт (РНК-ВКС) представляет собой транскрипт, соответствующий ампликону увеличенного размера за счет неспецифической вставки (Рис.3)
РНК - стандарты имеют фланкированные последовательности для тех же прай-меров, что и ДНК - стандарты.
Для практического использования ДНК и РНК - стандартов необходимо было провести пересчет известных концентраций препаратов ДНК-С, ДНК-ВКС, РНК-С и РНК-ВКС (мкг/мл) в число копий ДНК или РНК на 1мкл. препарата. Пересчет концентраций препаратов ДНК-С, ДНК-ВКС (мкг/мл) в число копий на 1мкл. препарата проводили по следующей формуле: N = А х 6,022 х 1023 х В / Б х 666, где
N - количество копий РНК мишени (ед. /мкл); Л - концентрация мишени в препарате (гр. /мкл); Б - число нуклеотидных пар РНК мишени; В - число копий РНК мишени, приходящееся на геном микроорганизма (количество геном - эквивалента). В качестве примера представлен пересчет концентрации препарата ДНК-С для гена dnaK из мкг/мл в количество копий ДНК мишени в Імл: А =12 мкг/мкг, Б=247н.п. N= 12 х10"6х 6.022 х!023х1 / 247х 666 - 4.5х1013 копий /мкл
Пересчет концентраций препаратов РНК-С, РНК-ВКС (мкг/мл) в число копий на 1мкл. препарата проводили по следующей формуле: N = А х 6,022 х 102J х В / Б х 333, где N - количество копий РНК мишени (ед. /мкл); А - концентрация мишени в препарате (гр. /мкл); Б - число пуклеотидпых пар РНК мишени; В - число копий РНК мишени, приходящееся на геном микроорганизма (количество геном - эквивалента).
В качестве примера представлен пересчет концентрации препарата РНК-С для гена dnaK из мкг/мл в количество копий РНК мишени в 1 мл: А =10 мкг/мкг, Б=367 н.п. N= 10 xlO 6 х 6.022 xl023xl / 367х 333 = 5x10і3 копий / мкл.
Многопраймерная реакция обратной транскрипции
Аналогичным образом (путем относительного титрования известных количеств РНК-ВКС и РНК-С) были определены максимально чувствительные количества РНК-ВКС для каждой количественной ОТ-ПЦР системы.
За максимально чувствительное количество РНК-ВКС принимали то количество РНК-ВКС, при котором наименьшие изменения в количестве мишени (РНК-С) приводили к изменению в соотношении силы сигналов на электрофорезе от продуктов амплификации в результате проведения реакции количественной ОТ-ПЦР.
Было установлено, что максимально чувствительное количество РНК-ВКС соответствует 2-4-х кратному количеству НПЧ или, соответственно, примерно 800-1600 копиям мРНК мишени для количественных ОТ-ПЦР систем. Использование таких количеств РНК-ВКС позволило нам улавливать двукратное изменение количества мишени при проведении количественных ОТ - ПЦР реакций.
С использованием оптимальных (максимально чувствительных) количеств ДНК-ВКС и РНК-ВКС нами были разработаны и апробированы количественные ПЦР и ОТ-ПЦР системы для определения количества ДНК и РНК (рРНК и мРНК) генов М. tuberculosis: sigH, recA, sigA, sigB, sigF, dosR, acr, fbpB, Rv3133c, Rv2623,16S, IS6110, позволяющие детектировать не менее чем 2-х кратные изменения в количестве определяемых мишеней (Таблицы 3 и 4, Материалы и Методы). 2.6. Определение исходного числа копий ДНК (мРНК) мишени в препарате. Для сравнительного изучения экспрессии генов M.tuberculosis необходимо определить исходное число копий исследуемой мишени по результатам количественных ПЦР и ОТ-ПЦР реакций. Определение исходного числа копий исследуемой мишени в 1 мл образца по результатам количественной ПЦР реакции проводили по следующим этапам:
1) Определение исходного количества копий исследуемой ДНК мишени в ПЦР -пробирке.
С целью определения разведения препарата, которое соответствует совпадению интенсивности сигналов на электрофорезе от продуктов амплификации ВКС и исследуемой мишени проводили количественную ПЦР реакцию последовательно с десятикратным и двукратным шагом разведения исследуемой ДНК мишени. Определение исходного количества копий ДНК мишени в ПЦР - пробирке проводили по следующей формуле: N = НПЧ х п, где
N - исходное количество копий ДНК мишени в ПЦР - пробирке; НПЧ - нижний порог чувствительности для количественной ПЦР - системы на исследуемый ген; п - кратность разведения препарата при которой наблюдается совпадение интенсивности сигналов на электрофорезе от продуктов амплификации ВКС и мишени.
2) Определение исходного количества копий исследуемой ДНК мишени в 1мл препарата.
При выделении тотальных нуклеиновых кислот препарат концентрировали в 20 раз, получая из объема 1 мл - 50 мкл препарата. В ПЦР - пробирку для проведения количественной ПЦР - реакции помещали 10 мкл препарата. Для определения исходного количества копий исследуемой ДНК мишени в 1мл препарата необходимо исходное количество копий ДНК мишени в ПЦР - пробирке (N) умножить на ко-эфицент, соответствующий кратности концентрирования препарата - 100.
В качестве примера приводим определение исходного количества копий ДНК гена sigA по результату количественной ПЦР - реакции. В результате титрования препарата ДНК гена sigA относительно ВКС для гена sigA совпадение интенсивности сигналов от ВКС и мишени наблюдалось в треке №2, что соответствует 2х103 кратному разведению препарата ДНК гена sigA (Рис.8). НПЧ для количественной ПЦР системы на ген sigA соответствует 40±4 копии ДНК мишени (Таб.7). Таким образом, исходное количество копий ДНК гена sigA в ПЦР пробирке соответствует: N = 40 х 2х103 = 4х104 копий ДНК гена sigA.
При умножении 4x10 на 100 получаем значение исходного количества копий гена sigA в 1мл препарата = 4x10 .
2.7. Тестирование образцов на отсутствие деградации РНК.
При длительном хранении препаратов тотальных нуклеиновых кислот (НК) возможна частичная деградация РНК и, в первую очередь, мРНК. Поэтому перед проведением количественного определения мРНК, необходимо тестирование препаратов на отсутствие деградации РНК.
Тестирование образцов на отсутствие деградации РНК проводили электрофоре-тически путем последовательного двукратного титрования препарата. При отсутствии деградации РНК отношение 16S и 23S рРНК на электрофореграмме должно быть примерно 1 к 1,8 (Рис. 11). Изменение этого соотношения указывает на деградацию РНК.
Исследование генов dnaK, sigH \JbpB в качестве маркеров жизнеспособности М. tuberculosis
При действии на изониазид - устойчивый штамм M.tuberculosis RU192-96 разными концентрациями изониазид а не отмечено снижения уровня мРНК гена dnaK относительно контрольного значения, несмотря на то, что максимальная используемая концентрация изониазида соответствовала 1 мкг/мл среды, что в 2,5 раза превышает значение МИК (0,4 мкг/мл), определенное для данного штамма.
В тоже время было отмечено снижение количества мРНК гена dnaK (до 10% от исходного) при обработке штамма M.tuberculosis АТСС3583В рифампицином в концентрации 5 мкг/мл среды, несмотря на то, что значение МИК рифампицина, определенное для данного штамма соответствовало более чем 8,0 мкг/мл среды. В противоположность падению уровня мРНК гена dnaK значение КОЕ оставалось постоянным (не изменяется относительно контрольного значения). Этот важный момент, возможно является результатом разницы в механизмах действия рифампицина и изониазида.
Возможно, что микроорганизм элиминирует разрушающее действие рифампицина при удалении антибиотика путем разведением культуры микобактерий в свежей питательной среде,
Анализ данных, полученных в данной работе, позволяет сделать вывод о наличии корреляции между падением жизнеспособности популяции микобактерий и снижением уровня мРНК гена dnaK (Mitchison D.A. et al., 1992), Эффект падения уровня мРНК гена dnaK (относительно контрольного значения) наиболее выражен в результате обработки стандартных штаммов M.tuberculosis рифампицином.
При кратковременном (48 часов) воздействии антибиотика на стандартные штаммы M.tuberculosis с известным уровнем устойчивости к данному антибиотику (МИК) наблюдается падение уровня мРНК гена dnaK, если концентрация антибиотика соответствует или превышает значение МИК. Уровень мРНК гена dnaK остается постоянным (не изменяется относительно контрольного) при кратковременном воздействии антибиотика на стандартные штаммы M.tuberculosis с известным уровнем устойчивости к данному антибиотику (МИК) если концентрация данного антибиотика ниже значения МИК. В результате,
установлено, что уменьшение уровня мРНК гена dnaK коррелирует с уменьшением выживаемости (КОЕ) всех исследуемых референс - штаммов M.tuberculosis. Исключение составляет устойчивый к рифампицину штамм М. tuberculosis АТСС 35838, для которого показано 10 - кратное уменьшение уровня мРНК после 48 часового экспонирования с рифампицином в концентрации, не превышающей МИК, в то время как значение КОЕ остается постоянным. Этот факт может свидетельствовать о способности микроорганизма «восстанавливаться» после экспозиции с рифампицином (при высеве на твердую ростовую среду, не содержащую антибиотика).
при 48 часовом инкубировании референс - штаммов М. tuberculosis с разными концентрациями рифампицина и изониазида показано снижение уровня мРНК гена dnaK, если концентрация антибиотика соответствует или превышает значение МИК. Уровень специфической мРНК оставался постоянным (не изменялся относительно контрольного), если используемая концентрация антибиотика была ниже, чем значение МИК (за единственным исключением для штамма М. tuberculosis АТСС 35838).
Таким образом, количественное измерение уровня мРНК термо индуцибелыюго гена dnaK позволяет: сделать вывод об общем состоянии клеточной популяции микобактерий (жизнеспособности), то есть определить (отличить) устойчивые и чувстви тельные к антибиотикам (рифампицину и изониазиду) штаммы М. tuberculo sis; определить концентрацию антибиотика (рифампицина и изониазида), при действии которой происходит снижение числа жизнеспособных клеток ми кобактерий.
Исследование генетических маркеров персистенции М. tuberculosis па моделях in vitro. 6. Использование молекулярно - генетических маркеров для нормирования состояния клеточной популяции М. bovis BCG в условиях моделей персистенции in vitro.
Принцип исследования молекулярно - генетических маркеров, которые в перспективе могут быть использованы для разработки диагностической системы для определения латентного туберкулеза, состоял в сравнительном измерении уровней экспрессии генов М. tuberculosis в физиологических условиях и условиях персистенции in vitro и выборе наиболее экспрессивных генов.
Оригинальность нашего исследования состояла в изучении динамики изменения экспрессии генов М. tuberculosis в условиях нормированной клеточной популяции персистирующих микобактерий на разных стадиях персистенции in vitro.
Под стадиями персистенции мы понимаем этапы перехода М. tuberculosis в состояние «глубокой» персистенции, соответствующие разной продолжительности инкубации микобактерий в моделях персистенции in vitro.
Состояние «глубокой» персистенции микобактерий, по нашим представлениям, характеризуется минимальным уровнем метаболической активности, позволяющей микобактериям поддерживать жизнеспособность в течение длительного времени и способность к реактивации.
