Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Особенности клеточного иммунитета при туберкулезной инфекции 16
1.1.1. Макрофаги - первичное звено иммунной системы в туберкулезном процессе 17
1.1.2. Т-лимфоциты - основные эффекторные клетки в противотуберкулезном иммунитете 22
1.1.3. Радикальные окислительные процессы в фагоцитах. Роль N0 в патогенезе туберкулеза 25
1.1.4. ФНОа и его роль в воспалительном процессе при туберкулезной инфекции 30
1.2. Иммуносупрессирующие факторы, влияющие на течение
инфекционного процесса 34
1.2.1. Факторы, влияющие на индуцибельную NO-синтазу 34
1.2.2. Иммуносупрессирующее действие анти-ФНОа антител 36
1.2.3. Иммуносупрессирующее действие ЛПС 37
1.3. Моделирование туберкулезного инфекционного процесса 40
1.3.1. Особенности течения туберкулезной инфекции у мышей 43
1.3.2. Латентное и хроническое течение туберкулезного процесса у мышей 45
1.3.3. Молекулярные механизмы, отвечающие за переход микобактерий в активное состояние 48
1.4. Использование живых вакцин для иммунопрофилактики туберкулеза 50
Собственные исследования и их обсуждение 56
Глава 2. Материалы и методы 57
Глава 3. Сравнительная характеристика внутрибрюшинной и аэрозольной модели в инфицировании мышей с целью получения хронического течения туберкулезной инфекции 66
Глава 4. Развитие туберкулезной инфекции, вызванной штаммом М. tuberculosis H37Rv и его мутантами, без воздействия иммунодепрессантов 72
Глава 5. Закономерности развития туберкулезной инфекции у мышей под действием иммунодепрессантов 75
5.1. Активация инфекционного процесса под действием аминогуанидина 75
5.2. Иммуномодуляция мышей, больных хроническим туберкулезом, моноклональными антителами, специфичными к ФНОа 76
5.3. Воздействие ЛПС на течение туберкулезной инфекции 77
5.4. Изучение влияния иммунодепрессантов на формирование клеточного иммунного ответа в мышиной модели хронической туберкулезной инфекции 79
Глава 6. Закономерности развития у мышей туберкулезной инфекции, вызванной нокаутными вариантами штамма М. tuberculosis H37Rv, имеющими делеции rpf генов, под действием иммунодепрессантов 83
6.1. Изучение действия иммунодепрессантов на процесс хронической туберкулезной инфекции, вызванной мутантами штамма М. tuberculosis H37Rv по разным rpf генам 83
6.1.1. Активация инфекционного процесса аминогуанидином 83
6.1.2. Активация инфекционного процесса анти-ФНОа моноклональными антителами 87
6.1.3. Активация инфекционного процесса липополисахаридом 89
Глава 7. Изучение течения острого туберкулезного процесса у мышей, иммунизированных мутантными по генам rpf штаммами М. tuberculosis H37Rv 91
Заключение 96
Выводы 97
Список использованных источников 98
- Т-лимфоциты - основные эффекторные клетки в противотуберкулезном иммунитете
- Развитие туберкулезной инфекции, вызванной штаммом М. tuberculosis H37Rv и его мутантами, без воздействия иммунодепрессантов
- Иммуномодуляция мышей, больных хроническим туберкулезом, моноклональными антителами, специфичными к ФНОа
- Активация инфекционного процесса анти-ФНОа моноклональными антителами
Введение к работе
Актуальность темы
Туберкулез продолжает оставаться серьезной причиной заболеваемости и смертности во всем мире. Ежегодно приблизительно 1 млрд. человек контактируют с носителями данной инфекции и подвергаются риску быть инфицированными туберкулезом, 8-10 млн. заболевают, и до 3 млн. человек умирают от туберкулеза. В ряде случаев заболевание и смерть являются результатом реактивации латентных форм туберкулезной инфекции. Реактивация латентного туберкулеза может произойти под воздействием неблагоприятных факторов, таких как хронический стресс, голод и другие состояния, а также заболеваний, приводящих к иммуносупрессивному эффекту, например, СПИД, системные гематологические и онкологические заболевания. Также известны случаи активации туберкулезной инфекции после применения иммунодепрессантов.
Вакцина БЦЖ, применяемая для профилактики туберкулеза во всем мире, может быть небезопасна при действии иммунодепрессирующих факторов. В ряде исследований показано, что заболевание СПИДом может провоцировать активацию вакцинного штамма и приводить даже к смертельному исходу.
Известно, что туберкулезная инфекция может протекать не только в активной форме, но и в латентной, когда возбудитель присутствует в организме в виде дормантных (спящих) форм. В последние годы были накоплены данные о молекулярных процессах перехода микобактерий из дормантных форм в состояние активного размножения, в частности, о роли лизоцимо-подобных белков Rpf микобактерий. В лаборатории молекулярной микобактериологии Национального Центра Здравоохранения ЮАР были получены мутанты штамма Mycobacterium tuberculosis H37Rv, в разной степени утратившие способность к продукции одного или нескольких белков Rpf (Downing et al, 2004). В экспериментах in vitro показано, что белки Rpf связаны с активацией хронической туберкулезной инфекции: выделяясь клетками микобактерий в окружающую среду, они воздействуют на клеточную стенку дормантных форм и вызывают их переход в активное состояние (Kaprelyants et al., 1994, Mukamolova et al., 1998; Kell and Young, 2000, Shleeva et al., 2004).
В настоящий момент представляет интерес изучение показанного in vitro активирующего эффекта белков Rpf на более сложном уровне - в организме теплокровных животных. Поэтому актуальной является задача создания модели туберкулезной инфекции на лабораторных животных, которая позволит охарактеризовать делеционные мутанты туберкулезного микроба по генам rpf, оценить их вирулентность для животных, а также особенность активации вызванной ими хронической инфекции под действием иммунодепрессантов. Представляет интерес также селекция вариантов микобактерий, не способных к активации в условиях иммунодепрессии, поскольку они могут быть использованы для создания рекомбинантных противотуберкулезных вакцин нового поколения.
Цель исследования – разработка мышиной модели хронической туберкулезной инфекции и изучение особенностей течения заболевания, вызванного делеционными мутантами M. tuberculosis по генам rpf, в условиях иммуномодуляции.
Задачи исследования:
-
Разработать мышиную модель хронической туберкулезной инфекции.
-
Исследовать вирулентные свойства нокаутных по rpf генам мутантов штамма M. tuberculosis H37Rv.
-
Изучить процессы активации туберкулезной инфекции под воздействием веществ, модулирующих иммунный ответ, на мышиной модели.
-
Разработать методические рекомендации по использованию мышиной внутрибрюшинной модели хронического туберкулеза для изучения иммуномодулирующих веществ.
-
Отобрать мутантные штаммы M. tuberculosis H37Rv, не способные к активации под воздействием иммуномодуляторов, и охарактеризовать их иммунногенные и протективные свойства.
Научная новизна
Исследованы особенности процессов течения туберкулезной инфекции, вызванной мутантными по rpf генам штаммами M. tuberculosis, на мышах с использованием двух моделей заражения: аэрогенной и внутрибрюшинной. Изучена активация туберкулезной инфекции, вызванной этими штаммами, обусловленная действием трех иммуномодуляторов (аминогуанидина, моноклональных анти-ФНО антител и ЛПС Escherichia coli). Обнаружен протективный эффект против туберкулеза после иммунизации мышей клетками мутантного штамма M. tuberculosis H37Rv, лишенного генов rpfA, rpfB, rpfC и rpfD.
Практическая значимость
Создана мышиная внутрибрюшинная модель туберкулезной инфекции, которая позволяет изучать влияние различных факторов на течение хронического туберкулеза. Разработаны и внедрены на учрежденческом уровне методические рекомендации «Использование модели внутрибрюшинного заражения мышей для получения хронической туберкулезной инфекции», 2010 г. Депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур ГКПМКК-Оболенск мутантный штамм M. tuberculosis H37Rv, лишенный генов rpfA, rpfB, rpfC и rpfD, в качестве перспективного для создания противотуберкулезной вакцины нового поколения.
Положения, выносимые на защиту
-
Разработана модель внутрибрюшинного заражения мышей, приводящая к устойчивой хронической туберкулезной инфекции.
-
Мутантные штаммы М. tuberculosis H37Rv, лишенные двух-пяти генов rpf, обладают пониженной вирулентностью по сравнению с исходным штаммом.
-
Хроническая туберкулезная инфекция, вызванная лабораторным штаммом М. tuberculosis H37Rv и его производными, лишенными двух генов rpf, может быть активирована под действием иммуномодуляторов, чего не наблюдается в случае инфекции, вызванной мутантными штаммами, лишенными трех-четырех генов rpf.
-
Мутантный штамм М. tuberculosis H37Rv, лишенный четырех генов rpf, обладает протективными свойствами для мышей против туберкулезной инфекции, и может быть использован в качестве перспективного для создания противотуберкулезной вакцины нового поколения.
Личный вклад соискателя
Все эксперименты по низкодозовому аэрозольному заражению мышей, ПЦР-идентификация штаммов и измерение уровня ФНО в препаратах органов, выполнены автором лично. Кроме того, автор принимал участие в планировании экспериментов, разработке внутрибрюшинной модели заражения и в определении вирулентности штаммов микобактерий при этом типе введения возбудителя, совместно с сотрудниками ФГУН «ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии» (Оболенск) и института биохимии им. А.Н. Баха РАН (Москва). Статистическая обработка, анализ и интерпретация экспериментальных данных проведены автором лично.
Апробация работы
Результаты работы представлены на семи международных и российских научных конференциях: научно-практической конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном мире», Оболенск, 2009; 13-ой международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 2009; Современные проблемы инфекционной патологии - Минск, 2009; 14-ой международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 2010; III Ежегодном всероссийском конгрессе по инфекционным болезням, Москва, 2011; 15-ой международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века». Пущино, 2011; 12-ом международном форуме и выставке «Высокие технологии XXI века», Москва, 2011.
Диссертация апробирована на межлабораторном научном семинаре ФГУН ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии – протокол № 18 от 21 ноября 2011 г.
Публикации
По материалам диссертационной работы опубликовано 9 печатных работ, в том числе одна статья в рецензируемом журнале из перечня ВАК и 8 публикаций в сборниках, трудах и материалах конференций.
Структура диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, изложения результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 118 страницах. Список цитируемой литературы включает 169 наименований. Иллюстративный материал содержит 28 рисунков и две таблицы.
Т-лимфоциты - основные эффекторные клетки в противотуберкулезном иммунитете
В последние годы появилось множество исследований, направленных на изучение иммунного ответа организма человека или лабораторных животных на заражение микобактериями. Было показано, что туберкулез является хроническим инфекционным заболеванием, протекающим с внутриклеточным (в макрофагах) паразитированием микобактерий [165; 154].
Лечение туберкулеза, как правило, бывает длительным и не всегда эффективным. Одной из причин многочисленных случаев безуспешного лечения данного заболевания является недостаточная эффективность защитных механизмов макроорганизма, в значительной мере обусловленная генетически [3; 23; 20].
Экспериментально показано, что введение мышам живых клеток М. tuberculosis вызывает четко воспроизводимую последовательность событий патогенеза, начинающихся с возникновения активированных состояний макрофагального звена и завершающихся ответной реакцией субпопуляций Т-клеток. В иммунном ответе макроорганизма главная роль принадлежит двум видам клеток: макрофагам, которые фагоцитируют микобактерии, и Т-лимфоцитам, продуцирующим цитокины [103; ПО; 165; 157].
Межклеточное взаимодействие Т-лимфоцитов и макрофагов играет важную роль в формировании специфичной для туберкулеза гранулемы (туберкулемы) играющей роль противоинфекционной защиты при распространении М. tuberculosis на позднейших стадиях развития инфекционного процесса [151; 152]. Формирование эффективной иммунологической защиты зависит именно от взаимодействия между собой иммунокомпетентных клеток (клеточного иммунитета). Следует подчеркнуть, что роль Т-лимфоцитов и макрофагов в формировании клеточного иммунитета остается в фокусе современных исследований и постоянно пополняется новыми научными фактами [165; ПО; 157].
Взаимодействие возбудителя и макроорганизма при туберкулезе -это классический пример внутриклеточной инфекции. Ее характерной чертой является недостаточность бактерицидных систем макрофагов для элиминации микобактерии, что влечет за собой необходимость иммунологического усиления бактерицидной активности макрофагов с помощью медиаторов, синтезируемых Т-лимфоцитами. Гуморальный иммунитет макроорганизма неэффективен против туберкулезной палочки, ввиду отсутствия прямого или опосредованного (через разные тины клеток) бактерицидного действия антител [134; 135]. На определенных стадиях заболевания микобактерии вместе с макрофагами попадают в регионарные лимфоузлы, а оттуда разносятся в различные органы. В любом из этих органов могут образоваться очаги, претерпевающие такие же последовательные изменения, как и очаги в легких. Этот начальный этап взаимодействия микобактерии с макроорганизмом, как правило, протекает бессимптомно. При этом локальные изменения в месте внедрения микобактерии обусловлены, прежде всего, реакцией полиморфоядерных лейкоцитов, которая сменяется более совершенной формой защитной реакции с участием макрофагов, осуществляющих фагоцитоз и разрушение микобактерии. Процесс взаимодействия макрофагов с различными микроорганизмами, в том числе микобактериями туберкулеза, сложен и до конца не изучен [134; 135]. Результат взаимодействия макрофагов и микобактерии определяется состоянием иммунитета, уровнем ПЧЗТ, развивающейся в процессе туберкулезной инфекции, а также рядом других факторов, в том числе обусловливающих переваривающую способность макрофагов [67; 72; 70; 77].
Фагоцитоз состоит из трех фаз: фазы соприкосновения, когда макрофаги с помощью рецепторов на клеточной мембране фиксируют микобактерии; фазы проникновения микобактерии внутрь макрофага путем инвагинации стенки макрофага и обволакивания микобактерии; фазы переваривания, когда лизосомы макрофагов сливаются с фагосомами, содержащими микобактерии. Выделяющиеся в фаголизосомы ферменты, катионные белки и радикалы кислорода разрушают микобактерии. Таким образом, в процессе фагоцитоза важная роль принадлежит механизмам «окислительного взрыва» [156]. Микобактерий туберкулеза, как и некоторые другие микроорганизмы, попадая в макрофаги, могут сохраняться и даже продолжать размножение. В тех случаях, когда процесс переваривания микобактерий блокируется, происходит разрушение макрофагов и выход микобактерий из поглотивших их клеток [36; 32].
Макрофаги, фагоцитировавшие микобактерий и осуществляющие их переваривание, выделяют во внеклеточное пространство фрагменты разрушенных микобактерий, протеолитические ферменты и медиаторы клеточного иммунитета (в том числе интерлейкин-1), которые активируют Т-лимфоциты, в частности Т-хелперы [38; 40; 49; 47]. Активированные Т-хелперы выделяют другой класс медиаторов — лимфокины (в том числе интерлейкин-2), под влиянием которых происходит усиление миграции новых макрофагов к месту локализации микобактерий. Одновременно возрастает ферментативная активность макрофагов под влиянием фактора активации макрофагов. Активированные лимфоциты выделяют также кожно-реактивный фактор, который обусловливает воспалительную реакцию и повышение сосудистой проницаемости. С этим фактором связывают подавление ПЧЗТ и положительной туберкулиновой реакции [14]. Кроме Т-хелперов, на состояние иммунитета значительно влияют Т-супрессоры и супрессорные моноциты, которые угнетают иммунный ответ [31; 14].
Развитие туберкулезной инфекции, вызванной штаммом М. tuberculosis H37Rv и его мутантами, без воздействия иммунодепрессантов
Как известно, в нашей стране и мире основная роль в предупреждении заболевания туберкулезом принадлежит иммунопрофилактике вакциной БЦЖ. Среди привитого населения заболеваемость туберкулезом снижается в 7-10 и более раз, по сравнению с данным показателем для непривитого населения. У привитых людей существенно реже возникают прогрессирующие формы туберкулеза и такие грозные осложнения, как туберкулезный менингит или казеозная пневмония [1; 23; 32; 33; 34]. Вакцинация БЦЖ снижает не только заболеваемость туберкулезом, но влияет также на вероятность заражения (инфицирования) человека микобактериями туберкулеза, т.е. в целом уменьшает инфицированность населения. Показано, что частота возникновения первичного туберкулезного инфицирования у детей в течение 4 лет после прививки в 3 раза меньше (24,1 %), чем в свыше 4 лет (75,9 %) [33; 143].
Таким образом, вакцинация БЦЖ не только снижает риск заболевания, но уменьшает риск заражения микобактериями туберкулеза в 3 раза и более. Отмеченный защитный эффект вакцинации БЦЖ, к сожалению, более выражен только в первые годы после прививки, снижаясь после 4-7 лет после вакцинации. Некоторые авторы отмечают, что инфицированность детей как невакцинированных, так и вакцинированных через четыре и более года после вакцинации в очагах туберкулезной инфекции не отличается [34].
Несмотря на указанные недостатки вакцины БЦЖ, данная противотуберкулезная вакцина на сегодняшний день остается единственным апробированным средством профилактики туберкулеза. Ее использование пока не имеет альтернативы и сохраняет актуальность, учитывая эпидемическую ситуацию по туберкулезу в России и во всем мире. Об этом же свидетельствует и опыт некоторых стран Европы. В конце 1980-х гг. Чехия отказалась от массовой вакцинации новорожденных, что вскоре привело к повышению заболеваемости туберкулезом детей раннего возраста в 2-4 раза, были отмечены случаи туберкулезного менингита у детей, в 3-4 раза чаще стало наблюдаться первичное инфицирование, по сравнению с периодом массовой вакцинации. В связи с этим Чехия вынуждена была снова вернуться к практике вакцинации новорожденных вакциной БЦЖ [23].
По данным ВОЗ, в настоящее время уровень инфицированности населения земного шара туберкулезом составляет 1/3 [161].
Несмотря на эпидемию туберкулеза, в нашей стране также сохраняется значительная прослойка неинфицированного туберкулезом населения. Среди детей до 4 лет она составляет 90 %, среди подростков и юношей - 80 %, среди лиц молодого (призывного) возраста и военнослужащих срочной службы - 70 %. Почти половина неинфицированного населения относится к возрастной категории 25-30 лет, все они нуждаются в иммунопрофилактике вакциной БЦЖ, поскольку даже в условиях семейного контакта вакцинация (ревакцинация) вакциной БЦЖ позволяет защитить человека (заболеваемость снижается более чем в 4 раза) [33; 82; 150].
В нашей стране массовая вакцинация против туберкулеза новорожденных проводится двумя препаратами: вакциной БЦЖ, а при наличии противопоказаний к прививке этой вакциной — препаратом для щадящей иммунизации вакциной БЦЖ-М. Вакцина БЦЖ-М используется также для вакцинации новорожденных в районах с благоприятной ситуацией по туберкулезу. Обе эти вакцины готовят из одного и того же посевного материала М. bovis штамма BCG-1 Russia [23; 24; 35]. Более 30 лет в разных странах мира используются штаммы-отвивки БЦЖ, пассированные на нативных питательных средах, различающихся между собой, что привело к появлению значительных различий между дочерними штаммами (субштаммами) БЦЖ [32; 82; 83]. В 1960 г. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) рекомендовала стабилизировать биологические свойства субштаммов путем лиофилизации и хранения образцов при низких температурах.
В настоящее время зарегистрировано 16 субштаммов БЦЖ, общее число их составляе более 30. Субштаммы различаются по морфологии клеток и колоний, остаточной вирулентности, иммуногенности, антигенному составу и др. [123; 143; 83]. Так, японский субштамм 172 характеризуется очень мелкими клетками, низкой остаточной вирулентностью и сниженной иммуногенностью, а также меньшей реактогенностью. Такие субштаммы принято называть «слабыми». «Сильные» субштаммы (французский и датский) отличаются большей остаточной вирулентностью, их защитная способность выше, однако они и более реактогенны [115; 122; 83].
Использование в течение многих лет вакцин на основе «слабых» субштаммов не приводит к снижению заболеваемости туберкулезом, поэтому в настоящее время ряд стран пытается применять «сильные» вакцины, несмотря на неизбежность осложнений. Для уменьшения последних необходимо строгое соблюдение техники прививки, что особенно важно при использовании «сильных» вакцин [35; 115; 123].
Отечественный субштамм БЦЖ («BCG-I Russia» или «Москва») занимает, при высокой иммуногенности, среднее положение по остаточной вирулентности среди других субштаммов. Это означает, что при высоких защитных свойствах вакцина, приготовленная из отечественного субштамма, обладает невысокой реактогенностью [35].
Иммуномодуляция мы, специфичными к шей, больных хроническим туберкулезом, моноклональными антителамиФНОа
Динамика ФНОа в плазме крови мышей, больных хроническим туберкулезом, после введения липополисахарида бактерий значительно отличается от таковой, описанной для других иммунодепрессантов (рис. 13). После введения ЛПС уровень ФНОа не снижался, а наоборот, несколько возрастал и достигал максимума на 10-й день (29,9 пг/мл). В дальнейшем наблюдали снижение уровня ФНОа в плазме крови мышей до значений, отмеченных до активации туберкулезной инфекции липополисахаридом. Такая динамика может быть объяснена тем, что, по-видимому, ЛПС вызывает сильную неспецифическую активацию иммунного ответа, за счет чего ослабляется специфическая защита организма животного против туберкулезной инфекции. 50 т 40 фон
Таким образом, использованные нами иммунодепрессанты оказывали существенное влияние на уровень активации клеточного иммунитета мышей, больных хроническим туберкулезом, что выражалось в изменениях уровня цитокина ФНОа в плазме крови исследуемых животных. Известно, что уровень ФНОа в плазме крови теплокровных животных отражает состояние цитокинового каскада, участвующего в развитии клеточного иммунитета к туберкулезной инфекции.
Выявлены различия в характере активирующего воздействия изучаемых иммунодепрессантов на клеточный иммунитет мышей, имеющих хроническую туберкулезную инфекцию. Моноклональные анти-ФНОа антитела вызывают резкое снижение активности клеточного иммунитета, аминуагуанидин вызывает постепенное снижение активности клеточного иммунитета, а ЛПС, возможно, вызывает гиперстимуляцию данного звена иммунитета. Глава 6. Закономерности развития у мышей туберкулезной инфекции, вызванной нокаутными вариантами штамма М. tuberculosis H37Rv, имеющими делеции rpf генов, под действием иммунодепрессантов
Как было показано в главе 4, изучаемые нами нокаутные мутанты штамма М. tuberculosis H37Rv, несущие делеции двух, трех и четырех rpf генов, являются в разной степени аттенуированными по сравнению с исходным штаммом. «Двойной» делеционный мутант М. tuberculosis H37RvAAC вызывает у животных несколько ослабленную туберкулезную инфекцию, «тройные» и «четверные» мутанты - более ослабленную инфекцию даже при увеличении исходной дозы заражения. Мутант, несущий делеции всех пяти генов rpf лишен возможности вызвать туберкулезную инфекцию у мышей.
Данная глава поспящена изучению динамики хронической туберкулезной инфекции у мышей, вызванной мутантными по генам rpf штаммами туберкулезного микроба, в условиях подавления иммунитета макроорганизма.
Данные по активации хронической туберкулезной инфекции, вызванной «двойным» делеционным по генам rpf мутантом штамма М. tuberculosis H37Rv, аминогуанидином представлены на рис. 14. Показано, что аминогуанидин активирует хронический туберкулезный процесс, что выражается в увеличении уровня КОЕ данного штамма туберкулезного микроба в органах больных животных. Несмотря на большую степень аттенуации, штамм, несущий делеции генов rpf К и rpf В, вызывает туберкулезный процесс, более чувствительный к воздействию аминогуанидина (рис. 14). Ь ; 5 ; б jr -f f\ т
Результаты экспериментов по активации туберкулезной инфекции, вызванной штаммами, имеющими делециям трех и четырех генов rpf представлены на рис. 15-17.
Аминогунидин не оказывает заметного влияния на течение туберкулезной инфекции, вызванной штаммами, несущими с делеции трех генов rpf. Медленное падение уровня КОЕ туберкулезного микроба в легких больных животных, по-видимому, связано с постепенной адаптацией организма животного к вялотекущей инфекции, вызванной штаммом М. tuberculosis H37Rv ДАВС (рис. 15а). М. tuberculosis H37Rv AACD при дозе заражения 4,1 хЮ4 КОЕ/мышь, показало показало полное отсутствие данного иммунодепрессанта на интенсивность течения инфекции (рис. 16).
Активация аминогунидином туберкулезной инфекции, вызванной штаммами, имеющими делеции четырех генов rpf показала, что аминогуанидин не способен активировать туберкулезную инфекцию, вызванную такими штаммами туберкулезного микроба. Полученные данные подтверждают предположение о существенной роли генов rpf в активации хронической туберкулезной инфекции (рис. 17).
Активация инфекционного процесса анти-ФНОа моноклональными антителами
Эвтаназию животных осуществляли при помощи углекислого газа в эксикаторе в течение 10 мин. с визуальным контролем. Патологоанатомическое вскрытие для изъятия легких проводили в отдельном изолированном, специально оборудованном помещении, соблюдая правила асептики. Труп животного на специальном лотке переносили на стол, закрепляли на фиксирующей доске брюшком кверху, растягивая пинцетом все четыре лапы, и в таком положении фиксировали иглами к поверхности доски. Пинцетом с ватным тампоном протирали дезинфицирующим раствором волосяной покров брюшка и грудки животного. Хирургическим пинцетом брали кожную складку над лобком животного и подсекали ножницами, в полученный поперечный разрез вводили тупую браншу ножниц и проводили срединный продольный разрез до нижней челюсти. Затем от срединного разреза проводили четыре боковых надреза до конечностей. Затем отсекали кожные лоскуты (от задних конечностей к передним) от подкожной клетчатки, распределяя их в противоположные стороны от туловища, прикалывая булавками к доске.
Обрабатывали использованные для вскрытия кожных покровов инструменты, погружая в раствор 96 %-ного спирта и обжигая над горелкой, приступали к вскрытию брюшной и грудной полости. Брюшную мышцу над лобком захватывали пинцетом, слегка приподнимали, делали небольшой надрез, вводили в него тупую браншу ножниц и прорезали до ребер, затем перерезали ребра - это делали вначале с левой, а затем с правой стороны, потом разрезали диафрагму. Костномышечный лоскут (фартук) заворачивали на голову животного.
При вскрытии животного старались не повреждать желудка и кишечника, во избежание загрязнения посевов банальной микрофлорой. Легкие фиксировали пинцетом и отсекали одним движением скальпеля.
Органы помещали в полиэтиленовые мешки для измельчителя тканей «Stomacher». Мешок с органом помещали в перетирающее устройство прибора герметично закрывали. Конструкция измельчителя обеспечивает безопасное проведение этой операции, по сравнению с традиционным способом растирания в фарфоровых ступках или с другими видами механических гомогенизаторов. Растирание органа в измельчителе тканей «Stomacher» происходит в специальном герметично запакованном полиэтиленовом мешке, что исключает вероятность разбрызгивания заразного материала.
После завершения операции мешок с содержимым помещали на ветошь с дезинфицирующим раствором, протыкали разовой пипеткой и переносили из него в микропробирку вместимостью 1,5 мл гомогенат легких объемом 0,1-1 мл.
После завершения забора материала мешок опускали в емкость с дезинфицирующим раствором (3 %-ный аламинол или 6 %-ная перекись водорода), надрезали ножницами в погруженном состоянии и оставляли на 24 ч. По завершении работы прибор открывали и обрабатывали снаружи и внутри тампоном, смоченным 3 %-ным раствором аламинола.
Высев гомогената на чашки Петри с плотной питательной средой 7Н11 и подсчет колониеобразующих единиц
Приготовление плотной питательной среды Middelbrook 7Н11 Agar Base (HiMediaLaboratories Limited India) для культивирования МТБ. Приготовление и розлив питательной среды проводили в помещении для проведения подготовительных работ. Навеску сухой среды 10,25 г помещали в мерную посуду, добавляли 2,5 мл глицерина и 0,5 г L-аспарагина; доводили объем дистиллированной водой рН (5,5±0,1) до 450 мл и перемешивали. Проверяли рН среды, который должен быть (6,6±0,2), при несоответствии доводили до нормы. Приготовленную среду разливали в колбы объемом (1000±10) мл. Колбы закрывали ватно-марлевыми пробками и бумажными колпачками, стерилизовали при температуре (121±1) С, в течение 15 мин. Готовую среду охлаждали до температуры (50±1) С.
Внесение стерильной сыворотки КРС осуществляли в асептических условиях с предварительной обработкой рук и рабочих поверхностей 70 %-ным раствором спирта. Данную операцию проводили в рабочей одежде, халате и шапочке, в радиусе 15-20 см от горящей спиртовки, стерильной пипеткой. Сыворотку вносили из расчета 50 мл на 450 мл среды. Приготовленную среду разливали в стерильные чашки Петри по 25 мл в асептических условиях с предварительной обработкой рук и рабочих поверхностей 70 %-ным раствором спирта. Данную операцию проводили в рабочей одежде, халате и шапочке, в радиусе 15-20 см от горящей спиртовки, обжигая горлышко колбы. Готовую среду подсушивали в течение 24 ч при температуре (37±1) С. Высев на чашки Высев гомогената органов животных проводили методом 10-кратных разведений в ЗФР с 0,05 % Твин-80, на плотную питательную среду 7Н11, содержащую 10 % сыворотки КРС. На один образец гомогената использовали два разведения суспензии, каждое разведение высевали на пять чашек Петри. Для подавления посторонней микрофлоры в случае высева исходного разведения гомогената в суспензию добавляли соляную кислоту до концентрации 3 %.
На поверхность среды в чашке Петри наносили 0,1 мл суспензии соответствующего разведения и тщательно растирали шпателем. Засеянные чашки помещали в полиэтиленовые пакеты и герметизировали. Инкубацию проводили при температуре (37±1) С в течение 25 дней. Затем подсчитывали специфичные колонии, результат обрабатывали статистическими методами с указанием среднего и относительного отклонений.
Микобактерии идентифицировали с помощью микроскопии, а принадлежность микобактерии к штаммам, несущим делеции генов rpf, подтверждали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).
