Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1. Туберкулез: древнее и современное заболевание человечества 14
1.2. Структура генома М. tuberculosis 17
1.3. Эволюция М. tuberculosis complex 21
1.4. Реконструкция ранней эволюции М. tuberculosis complex 27
1.5. Популяционная структура М tuberculosis и филогенетические построения 32
1.6. Молекулярно-эпидемиологические маркеры М. tuberculosis 37
1.7. Генетическое семейство Beijing вида М. tuberculosis 42
1.8. Развитие лекарственной устойчивости М. tuberculosis как форма микроэволюции 44
Глава 2. Материалы и методы 53
2.1. Штаммы М. tuberculosis и определение лекарственной устойчивости 53
2.2. Определение мутаций устойчивости к ПТП 54
2.2.1. Определение мутаций в katG315 54
2.2.1.1. Определение мутаций в katG315 методом ПЦР-ПДРФ 54
2.2.1.2. Определение мутаций в katG315 методом МАС-ПЦР 56
2.2.2. Определение мутаций в гроВ методом МАС-ПЦР 57
2.2.2.1. Вариант простой МАС-ПЦР 57
2.2.2.2. Вариант двушаговой гнездной аллель-специфической ПЦР 59
2.2.3. Определение мутаций в етЬВЗОб 60
2.2.3.1. Определение мутаций в етЬВЗОб методом ІЩР-ПДРФ 60
2.2.3.2. Определение мутаций в етЬВЗОб методом МАС-ПЦР 62
2.3. Геномная дактилоскопия штаммов М. tuberculosis 62
2.3.1. Сполиготипирование 62
2.3.2. IS6770-RFLP типирование 64
2.3.3. VNTR типирование 65
2.3.4. Типирование с использованием инвертированной IS61J0-TQjp 67
2.4. Анализ IS1547 68
2.5. Анализ длины гена Rv3135 69
2.6. Анализ структуры локуса NTF 70
2.7. Сбор данных по VNTR локусам и создание глобальной базы данных VNTR штаммов Beijing 70
2.8. Статистический анализ 72
2.9. Расчет генетического расстояния между географическими популяциями 72
2.10. Анализ исторических связей между географическими регионами 74
Глава 3. Анализ филогенетически значимых IS- и РРЕ-элементов генома штаммов Mycobacterium tuberculosis 75
3.1. Филогенетический анализ штаммов Beijing на основе IS6110 75
3.2. Анализ полиморфизма IS1547/IS6110 78
3.3. Анализ полиморфизма генаRv3135-PT>E 82
3.4. Анализ локуса NTF 83
3.5. Генотипирование штаммов М. tuberculosis, выделенных в Китае 83
3.6. Применение инвертированной 6110-ПНР для генотипирования М. tuberculosis и детекции генотипа Beijing 87
3.7. «Право-левое» сполиготипирование 90
Глава 4. Молекулярные механизмы и генотипическая детекция лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis 95
4.1. Анализ мутаций в katG315 96
4.2. Анализ мутаций в «горячем участке» гроВ (кодоны 516,526,531) 97
4.3. Анализ мутаций в етЪВЗОб 100
4.4. Анализ распределения основных мутаций устойчивости 103
Глава 5. Применение локусов VNTR для оценки генетического разнообразия и эволюции М. tuberculosis 105
5.1. Оценка нового поколения VNTR маркеров для высокоразрешающего генотипирования 105
5.1.1. Анализ штаммов с различными профилями 1S6110-RFLP (выборка 1) 105
5.1.2. VNTR генотипирование штаммов Beijing двух преобладающих IS6110-KFLV кластеров 112
5.2. Глобальная база данных MIRU-VNTR и филогеографический анализ генотипа Beij ing 116
Глава 6. Обсуждение 126
6.1. Древние и современные штаммы Beijing: концепция, эволюция и диагностика 126
6.2. Изменения в генах резистентности как форма микроэволюции генома М. tuberculosis и генотипическое определение лекарственной устойчивости 134
6.3. Редуцированная схема VNTR-типирования российских штаммов Beijing и анализ кластера Beijing/BO 142
6.4. Филогеография генотипа Beijing в контексте коэволюции Н. sapiens и М. tuberculosis 148
Выводы 161
Список использованной литературы 163
Приложения 209
- Эволюция М. tuberculosis complex
- Применение инвертированной 6110-ПНР для генотипирования М. tuberculosis и детекции генотипа Beijing
- Анализ штаммов с различными профилями 1S6110-RFLP (выборка 1)
- Изменения в генах резистентности как форма микроэволюции генома М. tuberculosis и генотипическое определение лекарственной устойчивости
Введение к работе
Актуальность проблемы
В настоящее время, туберкулез (ТБ), эпидемически распространенный во многих регионах мира, относят к «вновь вернувшимся заболеваниям». По оценке ВОЗ, треть населения Земли инфицирована Mycobacterium tuberculosis; общее количество заболевших и умерших от туберкулеза в 2006 г. составило 9,2 млн и 1,7 млн человек, соответственно (WHO, 2008). M. tuberculosis может адаптироваться к воздействию факторов иммунного ответа организма хозяина и селективному давлению антибиотиков посредством точечных мутаций. Последнее десятилетие прошлого века было отмечено появлением и началом широкого распространения лекарственно-устойчивых штаммов возбудителя туберкулеза во многих странах мира, включая Россию.
Применение методов сполиготипирования, IS6110-RFLP- и MIRU-VNTR-анализа для эпидемиологического типирования штаммов M. tuberculosis позволило определить семейства родственных штаммов и создать компьютерные базы данных, содержащие информацию о генотипических профилях штаммов (Brudey et al., 2006). Наличие доступных, обновляющихся и представительных баз данных имеет также исключительное значение и для разработки стандартизованной терминологии для обозначения циркулирующих вариантов (генотипов) возбудителя туберкулеза.
Среди генетических линий/семейств, выделяемых внутри вида M. tuberculosis, генотип Beijing характеризуется в целом генетической однородностью и широким географическим распространением (Bifani et al., 2002; Glynn et al., 2002), что может свидетельствовать о его недавней глобальной диссеминации. В настоящее время, этот генотип привлекает внимание и с клинической точки зрения, поскольку штаммы Beijing демонстрируют повышенную вирулентность (Вишневский и др., 2003; Lopez et al., 2003), ассоциацию с лекарственной устойчивостью (Нарвская, 2003) и высокую трансмиссивность (Caminero et al., 2001; Narvskaya et al., 2002). Клональная популяционная структура и однонаправленность эволюции M. tuberculosis как вида в целом делают возможным частный анализ его отдельных филогенетических линий как редуцированной модели вида.
В этой связи, изучение особенностей генетического разнообразия и эволюционного процесса M. tuberculosis генотипа Beijing, генетических механизмов развития лекарственной устойчивости M. tuberculosis и поиск новых информативных маркеров для молекулярной эпидемиологии туберкулеза, является чрезвычайно актуальным и своевременным.
Цель исследования: Изучить микро- и макроэволюционные изменения в геноме и разработать методологические подходы для мониторинга циркулирующих штаммов M. tuberculosis.
Задачи работы:
1. Провести анализ филогенетически значимых фрагментов генома M. tuberculosis генотипа Beijing.
2. Осуществить филогеографический анализ, провести реконструкцию происхождения и путей распространения циркулирующих вариантов M. tuberculosis генотипа Beijing
3. Изучить генетические основы развития лекарственной устойчивости как формы микроэволюции M. tuberculosis.
4. Разработать методологические подходы на основе информативных молекулярных маркеров для эффективного мониторинга и диагностики лекарственной устойчивости циркулирующих штаммов M. tuberculosis.
Научная новизна
Впервые в мире проведена компьютерная реконструкция происхождения и исторических путей глобальной диссеминации штаммов M. tuberculosis генотипа Beijing.
Разработана концепция существования древних и современных линий генотипа Beijing.
Впервые на основе компьютерного моделирования эволюции локусов VNTR показан ускоренный характер роста субпопуляции клонального варианта В0/Beijing в России.
Предложена переоценка роли мутаций в embB306 как маркера устойчивости к этамбутолу. Выдвинута гипотеза о дополнительном механизме устойчивости к этамбутолу M. tuberculosis, не связанном с изменениями в гене арбинозилтрансферазы embB.
Практическая значимость исследования
Созданная и обновляемая глобальная база данных по 11 локусам VNTR штаммов M. tuberculosis Beijing (1853 штамма на 30.06.2009) эффективно применяется для филогенетических исследований и эпидемиологического мониторинга циркуляции штаммов этого генотипа.
Разработан способ быстрой детекции штаммов M. tuberculosis генотипа Beijing, его основных филогенетических линий и клонального варианта В0/Beijing на основе использования инвертированной IS6110-ПЦР и VNTR типирования.
Разработана минимальная схема на основе семи локусов VNTR для первичного скринингового типирования штаммов M. tuberculosis генотипа Beijing, циркулирующих в России.
Показана высокая информативность сочетанного применения методов IS6110-RFLP и VNTR типирования для дифференциации штаммов M. tuberculosis при эпидемиологических исследованиях.
Предложен способ определения генетического расстояния между географическими популяциями клональных видов бактерий.
Разработан способ экспрессного определения основных мутаций, ассоциированных с устойчивостью к рифампицину и изониазиду, в генах rpoB (кодоны 516, 526, 531) и katG315 на основе методологии мультиплексной аллель-специфической ПЦР.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
1. Генетическое разнообразие M. tuberculosis сформировалось в результате миграций населения. Генотип Beijing M. tuberculosis возник на территории северного Китая более 2000 лет назад; его проникновение в другие регионы мира было опосредовано миграциями из Юго-Восточной Азии.
2. Генотип Beijing M. tuberculosis включает две крупные филогенетические линии – «древнюю» и «современную» – с различной структурой генома и эволюционным потенциалом. Быстрая детекция этих линий возможна на основе инвертированной IS6110-ПЦР.
3. Вариант Beijing/В0, выявляемый в 25% российских штаммов генотипа Beijing, является «успешным» вариантом, для которого характерен существенно более быстрый популяционный рост в сравнении с общей популяцией Beijing в России.
4. Первичное скрининговое типирование штаммов Beijing в России возможно на основе анализа семи локусов VNTR. Использование методов IS6110-RFLP и VNTR необходимо для детального генотипирования M. tuberculosis.
5. Разработанный метод мультиплексной аллель-специфической ПЦР для анализа основных мутаций резистентности в генах rpoB и katG эффективен для выявления большинства штаммов M. tuberculosis, устойчивых к рифампицину и изониазиду. Наличие мутации в embB306 недостаточно для развития устойчивости M. tuberculosis к этамбутолу.
Апробация работы
Основные результаты исследований были доложены и обсуждены на российских и международных семинарах, конгрессах и конференциях в 2001-2009 гг.: 3rd International Conference “Infectious diseases in the Barents region” (Архангельск, Россия, 09.2001); Meeting of IAEA Multicenter Project (Дели, Индия, 03.2001); Meeting of Mycobacteria and Tuberculosis Study Group of Pasteur Institutes (Алжир, Алжир, 02.2001); International Conference “Tuberculosis: old problem in new millennium” (Новосибирск, Россия, 07.2002); 4th Nordic Baltic Congress on Infectious Diseases (С.-Петербург, Россия, 05.2002); 12th European Congress on Clinical Microbiology and Infectious Diseases (Милан, Италия, 04.2002); 4th International Conference “Infectious diseases in the Barents region” (Петрозаводск, Россия, 2003); 24th Congress of European Society of Mycobacteriology (Тарту, Эстония, 07.2003); Annual Scientific Symposium of the International Network of Pasteur Institutes (Тегеран, Иран, 17-19.11.2004); 10th International Workshop on virus evolution and molecular epidemiology (Хельсинки, Финляндия, 30.08.-05.09.2004); 25th Congress of European Society of Mycobacteriology (Альгеро, Италия, 27-30.06.2004); Meeting of Mycobacteria and Tuberculosis Study Group of Pasteur Institutes (Париж, Франция, 16-18.02.2004); VI Всероссийский конгресс по молекулярной диагностике (Москва, 28-30.11.2007). 30th Congress of European Society of Mycobacteriology (Порту, Португалия, 5-8.07.2009).
По теме диссертации опубликовано 54 статьи в рекомендованных ВАК РФ журналах и 5 глав в трех монографиях.
Внедрение результатов исследования в практику
На основе результатов работы подготовлены следующие документы:
1. Патент на изобретение №2287586 (Мокроусов И.В., Оттен Т.Ф., Нарвская О.В., Вишневский Б.И., Способ экспрессного определения устойчивости к рифампицину у микобактерий туберкулеза). Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений РФ 20.11.2006. Приоритет: 27.05.2003.
2. Патент на изобретение №2339040 (Мокроусов И.В., Оттен Т.Ф., Нарвская О.В., Вишневский Б.И., Способ экспрессного определения устойчивости к изониазиду у микобактерий туберкулеза). Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений РФ 20.11.2008. Приоритет: 08.02.2006.
3. Заявка на патент (Мокроусов И.В., Оттен Т.Ф., Вязовая А.А., Вишневский Б.И., Нарвская О.В. Способ выявления микобактерий туберкулеза генотипа Beijing). Рег. №2008118836, приоритет от 12.05.2008
Результаты исследований внедрены в практическую деятельность ФГУ «Санкт-Петербургский НИИ фтизиопульмонологии Росмедтехнологий».
Личное участие автора в получении результатов
Основные результаты получены лично автором. Выделение штаммов и определение их чувствительности к противотуберкулезным препаратам было проведено в ФГУ «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи» в лаборатории микробиологии туберкулеза при участии д.м.н. профессора Б.И. Вишневского, д.м.н. Т.Ф. Оттен и к.б.н. О.А. Маничевой. Молекулярно-генетические исследования, компьютерный и статистический анализ данных были проведены автором в лаборатории молекулярной микробиологии ФГУН «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 228 страницах машинописного текста и состоит из введения, 6 глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, 3 главы результатов собственных исследований, обсуждение результатов), выводов и приложения. Иллюстративный материал включает 14 таблиц и 48 рисунков. Список литературы содержит 349 наименований, из них 31 отечественный и 318 иностранных источников.
Эволюция М. tuberculosis complex
Интенсивные генетические исследования последнего десятилетия привели к пересмотру или существенному уточнению ряда традиционных и новых взглядов относительно эволюции и особенностей структуры генома М. tuberculosis. Было показано, что родственные виды микобактерий претерпели эволюцию путем делеций крупных фрагментов генома, что привело к возникновению М. tuberculosis, М. bovis и других родственных видов (М. canettii, М. microti, М. pinnipedii, М. саргаё) из единого предшественника М. tuberculosis complex. При этом делеций оказывают влияние и на патогенный потенциал различных линий внутри М. tuberculosis наиболее ярким примером является вышеупомянутый регион RD1, который содержит гены высокоимунногенного семейства антигенов ESAT-6, обнаруживаемого у представителей М. tuberculosis complex и других микобактерий, но не М. microti или М. bovis (Marmiesse et al., 2004; Brodin et al., 2004).
Вариабельность в этой группе антигенов, вовлеченных в экспорт протеинов, может иметь значение для проявления различных клинических характеристик этих видов и их способности к выживанию в различных нишах. В то же время, в течение более коротких периодов генетическая вариабельность достигается изменениями в минисателлитной ДНК и перемещениями коротких инсерционных последовательностей 1S6110. Некоторые генетические линии (семейства), например, генотип Beijing, широко распространены в различных регионах мира, вероятно, по причине их генетического преимущества хотя его механизм остается неоднозначным. М. tuberculosis может адаптироваться к воздействию факторов иммунного ответа организма хозяина и к селективному давлению антибиотиков путем точечных мутаций. Почти всегда лекарственная устойчивость у М. tuberculosis возникает подобным образом, и данные клинических и in vitro исследований свидетельствуют, что популяция штамма М. tuberculosis содержит небольшое, из-за недостаточной жизнеспособности, количество мутантов. Однако при возникновении давления антибиотиков эти редкие мутанты получают преимущество и начинают доминировать в микробной популяции.
Следует отметить, что большинство бактериальных видов состоит из широкого спектра отдельных клонов или клональных комплексов которые различаются по однонуклеотидным полиморфизмам (SNP) более, чем на 1% (Achtman et al., 1999; Spratt, 2004; Maiden, 2000; Feil, Spratt, 2001; Palys et al., 1997). Внутривидовое генетическое разнообразие обычно генерируется как мутациями (напр. Staphylococcus aureus (Enright et al., 2002), Corynebacterium diphtheriae (Cerdenoarraga et al., 2003; Nakamura et al., 2003), так и горизонтальным переносом генов {Helicobacter pylori (Falush et al., 2003), Escherichia coli (Dykhuizen, Green, 1991). Однако некоторые эпидемически опасные для человека микроорганизмы, например, Salmonella enterica Typhi (Kidgell et al., 2002) и Yersinia pestis (Achtman et al., 1999) представлены, в основном, одним специализированным клоном, который недавно эволюционировал из известного и диверсифицированного вида-предшественника.
М. tuberculosis complex включает виды как исключительно возбудителей болезней человека (М tuberculosis, Mycobacterium africanum и Mycobacterium canetti), грызунов {Mycobacterium microti), так и Mycobacterium bovis, с широким кругом хозяев и близкие ему виды М. саргае, а также М. pinnipedii. Несмотря на различия фенотипических характеристик и вариабельность круга хозяев среди млекопитающих, они представляют один из наиболее ярких и крайних примеров генетической гомогенности на уровне лишь 0.01%-0.03% SNP (Sreevatsan et al., 1997а; Gutacker et al., 2002; Cole et al., 1998; Fleischmann et al., 2002) и крайне незначительного генетического обмена между штаммами (Gutacker et al., 2002; Smith et al., 2003; Supply et al., 2003; Hirsch et al., 2004) (Рис. 1.3).
Ранее полагали, что члены М. tuberculosis complex являются клональным потомством единого успешного предка как результат недавнего эволюционного эффекта «бутылочного горлышка» 20000 - 35000 лет назад (Sreevatsan et al., 1997а; Gutacker et al., 2002; Hughes et al., 2002). Однако природа и географические рамки предшествовавшего бактериального пула, равно как и время перехода к проявлению патогенности в организме млекопитающего хозяина оставались неопределенными. Предварительные исследования позволили предположить, что М. canettii, редкий вид с необычным фенотипом (гладкие колонии) (van Soolingen et al., 1997), может представлять наиболее древнюю линию внутри М. tuberculosis complex (Fabre et al., 2004).
Филогенетический анализ на основе делеций и SNP (Brosch et al., 2002; Marmiesse et al., 2004 [Рис. 1.4]) а также недавнее исследование на основе VNTR и CRISPR маркеров (Wirth et al., 2008 [Рис. 1.5]) показали ошибочность классической теории о происхождении возбудителя человеческого туберкулеза (М. tuberculosis) непосредственно от М. bovis вследствие одомашнивания крупного рогатого скота (Stead, 1997). Напротив, геном М. bovis претерпел серию крупных однонаправленных делеций локусов, которые присутствуют в геноме М. tuberculosis (Brosch et al., 2002), и обособился независимо от него от общего предка (Рис. 1.4). Серия делеций последовательно дифференцирует М. africanum, М. microti и другие варианты (экотипы [Smith et al., 2006, 2009]) внутри М. bovis (Brsoch et al, 2002; Marmiesse et al., 2004) (Рис. 1.3, Табл. 2).
Применение инвертированной 6110-ПНР для генотипирования М. tuberculosis и детекции генотипа Beijing
Предварительное генотипирование ограниченного числа штаммов микобактерий туберкулеза (п=120), из которых 55 принадлежали генотипу Beijing, с использованием метода инвертированной IS6JJ0-HUP (Рис. 2.9), имея целью дифференцировать штаммы, тем не менее, выявило, что штаммы Beijing имеют одинаковый профиль из трех (типичные штаммы) или двух (атипичные штаммы) фрагментов. В этой связи, мы оценили этот метод не для дифференциации штаммов, а в качестве альтернативного сполиготипированию метода для простой ПНР-детекции генотипа Beijing.
Анализ 865 проб ДНК штаммов микобактерий туберкулеза, выделенных в 1997-2007 гг. в России (N=575), Китае (N=117), Вьетнаме (N=122), Болгарии (N=51) был проведен методами сполиготипирования в качестве «золотого» стандарта идентификации генотипа Beijing и методом инвертированной IS6110-ПЦР (Рис. 3.10). В результате, 408 штаммов было определено как относящиеся к генотипу Beijing. Дополнительно, 61 штамм Beijing был определен как относящийся к атипичным штаммам («древнему» варианту этого генотипа), при этом результаты анализа локуса NTF и инвертированной IS6110UJP совпали.
При наличии в образце ДНК штамма Beijing амплифицируются яркие фрагменты размером 290 пн и 490 пн и, в случае типичных штаммов (современного варианта) Beijing, дополнительный фрагмент 260 пн (Рис. 3.10). Определение длин фрагментов проводят путем сравнения с маркером молекулярных весов или непосредственно с профилем контрольного штамма генотипа Beijing. Наличие слабых дополнительных полос в профилях оценивается как неспецифическое и не учитывается.
Специфичность амплификации межгенных участков расположенных между соседними копиями IS6110 была подтверждена применением жестких условий амплификации, в т.ч., увеличением температуры отжига, использованием различных концентраций MgCl2 (до 1,5 тМ), а также различных марок полимераз и термоцикл еров. Во всех случаях специфичный и характерный профиль из двух или трех полос был получен для штаммов генотипа Beijing (Рис. ЗЛО).
Для оценки пригодности предлагаемого метода для быстрого анализа клеточных лизатов с низкой концентрацией ДНК был проведен анализ выборки из 144 клеточных лизатов штаммов микобактерий туберкулеза, выделенных в Казахстане, и 56 образцов ДНК, выделенных из мокроты больных туберкулезом легких в Киргизии. Для большинства (125 из 144) лизатов и всех 56 проб ДНК из мокроты были получены интерпретабельные ПЦР-профили, из которых 112 было определено как соответствующие генотипу Beijing. Сравнение с последующими результатами сполиготипирования подтвердило результат инвертированной І86І70-ПЦР. Отсутствие амплификации для некоторых лизатов может быть связано с ингибированием ПЦР и/или недостаточным количеством ДНК, поэтому эффективность метода применительно к клеточным лизатам составила 90,8%.
Анализ штаммов с различными профилями 1S6110-RFLP (выборка 1)
Всего в анализ было включено 48 штаммов Beijing, чьи профили IS61I0-RFLP (Рис. 5.1) отражали разнообразие профилей, выявленных в нашей лаборатории и составляющих базу данных профилей IS6770-RFLP микобактерий туберкулеза лаборатории молекулярной микробиологии СПб НИИЭМ им. Пастера. Эти штаммы (до 30% различия профилей) послужили для оценки дискриминирующей способности VNTR типирования, основанного на анализе отдельных локусов VNTR и их различных комбинаций (Табл. 5.1, Приложение В), при этом метод IS6770-RFLP рассматривали в качестве «золотого стандарта» (наиболее дискриминирующего метода). Всего было оценено 27 локусов VNTR, в том числе 24 локуса недавно предложенного нового формата VNTR типирования М. tuberculosis (Supply et al., 2006) и 3 т.н. гипервариабельных локуса, ранее показавших хорошую дискриминацию японских штаммов Beijing (Iwamoto et al., 2007). Примеры гель-электрофореза различных аллелей некоторых локусов приведены на Рис. 5.2.
Аллельное разнообразие локусов в нашей выборке различалось значительно (Табл. 5.2). Десять локусов были мономорфными, что сделало различие 15- и 24-локусных схем практически ничтожным (HGI=0,905 против 0,906) (Табл. 5.1). Использование трех гипервариабельных локусов существенно улучшило дискриминацию (0,974 для схемы 15+3). Сравнение отдельных локусов показало, что только один из гипервариабельных локусов, QUB-3232, был достаточно полиморфным, в то время как два других, VNTR-3820 и VNTR-4120, были умеренно полиморфными (Табл. 5.2). Наибольшая гетерогенность гипервариабельных локусов также отражена большим количеством аллельных вариантов (Табл. 5.2).
Следует отметить отсутствие результата ПЦР для некоторых локусов и отдельных штаммов, например, локусов QUB-26 и Mtub29 у штамма 73913 и локуса QUB-llb у штамма 7315 (Приложения В и С). Этот отрицательный результат ПЦР был подтвержден путем повторения эксперимента при использовании других термоциклеров и других марок полимераз. С одной стороны, такой результат может свидетельствовать о деградации конкретного локуса в отдельных препаратах ДНК. В то же время, Ивамото и соавт. (Iwamoto et al., 2007) полагают, что такой результат является объективным отражением реального состояния локуса у конкретного штамма и также должен быть учтен при филогенетическом анализе полученных данных, в частности, при расчете матрицы расстояний между штаммами.
Далее мы проанализировали дискриминирующие способности различных комбинаций VNTR локусов с целью найти комбинацию, наиболее дискриминирующую штаммы Beijing, но основанную на ограниченном количестве локусов. Критериями составления комбинаций служили количество аллелей и аллельное разнообразие локусов. Некоторые из комбинаций и правила включения/исключения локусов приведены в Табл. 5.1. В результате, представляется, что комбинация В, состоящая из семи локусов, обеспечивает разумный баланс между ограниченным количеством локусов и достаточно высоким индексом дискриминации, близким к таковому у VNTR-схемы 15+3. Следует отметить, что при всех комбинациях включение трех гипервариабельных локусов играло критическую роль для достижения достаточно высокой степени дискриминации, хотя и более низкой, чем для IS6J J0-RFLP, но более высокой, чем у 15- и 24-локусных форматов (Табл. 5.1).
Сравнение дискриминирующих возможностей 27-VNTR и IS6110-KFLP методов (Рис. 5.1, Табл. 5.1) показало, что IS61JO-KFLP метод лучше дифференцировал штаммы, дополнительно разделяя VNTR-кластеры, например, крупный VNTR-кластер из 7 штаммов (Рис. 5.1). Этот кластер включал семь сходных штаммов с характерным двойным фрагментом в верхней части профиля; один из этих штаммов имел профиль ВО (27% в нашей базе данных (Нарвская, 2003)) и в данном исследовании мы определили этот кластер штамма ВО и родственных штаммов как ВО-кластер (показано серым фоном на Рис. 5.1). Более подробный анализ штаммов ВО-кластера представлен ниже.
Три других VNTR-кластера (два штамма в каждом) соответствовали IS6110-RFLP кластерам, в то время как 4 других VNTR-кластера (два штамма в каждом) включали штаммы с очень сходными профилями IS6J10-RFLP (Рис. 5.1), что может свидетельствовать о конгруэнтности в целом результатов генотипирования двумя методами и, в то же время, о большей дискриминирующей способности метода IS6JJ0-KFLP. В то же время, следует отметить, что два штамма с идентичным RFLP профилем АО были дифференцированы по трем VNTR-локусам, гипервариабельными QUB-3232, VNTR-3820 и низкополиморфным MIRU20 (Рис. 5.1, приложение В); более подробный анализ расширенной коллекции штаммов с профилем АО приведен ниже.
Изменения в генах резистентности как форма микроэволюции генома М. tuberculosis и генотипическое определение лекарственной устойчивости
Разработка методологии МАС-ПЦР для детекции мутаций устойчивости к основным противотуберкулезным препаратом и анализ распределения этих мутаций в основных филогенетических линиях М. tuberculosis стали еще одним из практических приложений этого исследования.
Можно отметить ряд полезных особенностей разработанных нами методов для анализа генов katG и гроВ. МАС-ПЦР katG позволяет определить две наиболее важные мутации устойчивости в этом гене, связанные с устойчивостью к изониазиду. Вариант katG 315-АСС является наиболее частым в мире, особенно в регионах с высоким уровнем циркуляции резистентных штаммов, а вариант 315-АСА характерен для штамма W, вызвавшего эпидемию мультирезистентного туберкулеза в штате Нью-Йорк в 1990-е годы и распространенного в США (Bifani et al., 1999). Аналогично, МАС-ПЦР гроВ обеспечивает расширенный мутационный анализ кодонов 516 и 526, поскольку мы установили, что метод выявляет мутации не только во второй позиции этих кодонов (которая точно соответствуют 3 -концу праймеров), но и мутации в первой позиции кодонов, которые находятся в -1 позиции по отношению к 3 -концу аллель-специфических праймеров.
Следует отметить, что отсутствие амплификации аллель-специфического индикаторного фрагмента теоретически может быть результатом разрушения ДНК или ингибирования реакции ПЦР. Такой ложно-отрицательный результат может критически влиять на интерпретацию результатов, поэтому дизайн метода был специально разработан для обеспечения соответствующего контроля качества вследствие амплификации постоянных специфических фрагментов. С другой стороны, для более простой и однозначной интерпретации ПЦР-профилей штаммов, каждый эксперимент должен включать ДНК штамма H37Rv и штамма с известной мутацией в анализируемом кодоне. Таким образом, тестируемый штамм сравнивают в агарозном геле с положительным и отрицательным контролем и отсутствие фрагмента «дикого типа» указывает на наличие мутации и, следовательно, на резистентный фенотип.
В различных регионах мира отмечена географическая вариабельность распределения специфических мутаций. Это определяет необходимость предварительного анализа молекулярной основы лекарственной устойчивости локально циркулирующих штаммов до внедрения молекулярных методов в широкую практику. Метод МАС-ПЦР позволяет осуществить быстрый, эффективный, в т.ч., ретроспективный, анализ больших коллекций ДНК, полученных в предшествующие годы, для оценки мутационных профилей katG315, етЬВЗОб, гроВ и применимости метода в конкретном регионе. Неизбежным ограничением предлагаемого метода, как и любого другого молекулярного метода определения резистентности, является разнообразие механизмов развития устойчивости. В результате, некоторые из устойчивых микроорганизмов не выявляются конкретным молекулярным методом, направленным на детекцию только определенного спектра, но не всех мутаций. Например, до 10-15% RIF-устойчивых штаммов не имеют мутаций в "горячем участке" гроВ (Bartfai et al., 2001; Qian et al., 2002; Martin, Portaels, 2007). Метод МАС-ПЦР для анализа мутаций в гроВ и katG315 может быть использован для выявления большой доли рифампицин- (и, следовательно, MDR) и изониазид-устойчивых штаммов М. tuberculosis, циркулирующих в России и других регионах с высоким уровнем заболеваемости резистентным туберкулезом. Метод требует базового оборудования для стандартной ПЦР и агарозного гель-электрофоерза, он прост в применении, результаты легко интерпретируемы, поэтому он может служить ценным дополнением к имеющимся культуральным методам для быстрого скрининга мутаций устойчивости к основным ПТП.
Анализ распределения наиболее часто встречающихся мутаций устойчивости в katG315 и гроВЗЗІ среди основных генотипов М. tuberculosis выявил их высокую частоту у штаммов генотипа Beijing в сравнении со штаммами других генотипов (для краткости называемых «не-Beijing»). Мутация S315T в гене katG была выявлена у 96,7% INH-устойчивых штаммов Beijing против 89,0%, INH-устойчивых штаммов не-Beijing за весь период исследования (OR 3,6; 95% СІ 1,0-14,6). Наши данные по генотипированию показали, что большинство изученных резистентных штаммов, выделенных от впервые выявленных больных принадлежали к генотипу Beijing (Рис. 6.1). Эти данные согласуются с результатами более ранних исследований, которые показали, что эпидемическое распространение мультирезистентного туберкулеза на северо-западе России в значительной степени определяется клональной диссеминацией мультирезистентных штаммов Beijing (Нарвская и соавт., 1999; Нарвская, 2003), что, очевидно, в свою очередь объясняет высокую долю мутации katG S315Т среди российских штаммов в целом.
Глобальное преобладание мутации katG S315T у INH-устойчивых штаммах подчеркивает селективное преимущество, придаваемое этой мутацией, обеспечивающей оптимально соотношение между пониженной каталазной и достаточно высокой пероксидазной активностью протеина KatG. Доля этой мутации в мире варьирует, но остается высокой, например, 47% в Финляндии (Marttila et al., 2008), 61% в Китае (Jiao et al., 2007), 71% во Вьетнаме (Caws et al., 2006), 64% в Южной Африке и Индии (van Rie et al., 2001; Nusrath Unissa et al., 2007). Частота этой мутации у INH-устойчивых штаммов в нашем исследовании была выше, чем в мире и сходна с таковой в других российских регионах - 92-94% (Воронина и др., 2004; Afanas ev et al., 2007). Представляется, что выявление только мутации katG S315T позволяет выявить высокую долю INH-устойчивых штаммов, циркулирующих в России.
В нашем исследовании мутация в кодоне гроВ531 была выявлена существенно чаще у RIF-устойчивых штаммов Beijing, нежели не-Beijing: 77,3% против 28,0% (OR 8,78 (4,82, 16,00) СІ 95%). Следует отметить, что кодон гроВ531 является наиболее часто мутирующим в любом регионе мира (у 30-50% RIF-устойчивых штаммов) (Ramaswamy and Musser, 1998; van Rie et al., 2001; Qian et al., 2002; Исакова и др., 2007; Marttila et al., 2008).
Тем не менее, обращает на себя внимание столь высокий процент этой мутации среди штаммов Beijing в России, что было показано не только нами, но и большинством других российских исследователей (Генерозов и др., 2000; Toungoussova et al., 2002; Lipin et al., 2007). Этот результат отличается от недавно опубликованных Афанасьевым и соавт. (Afanas ev et al., 2007) результатов анализа выборки штаммов, собранных в центральном, уральском и сибирском регионах. Авторы выявили эту мутацию в высоком, но несколько меньшем проценте (64,8%) штаммов, в то время как другими наиболее часто мутировавшими кодонами были 526 и 516 (10,3% и 7,7%, соответственно) (Afanas ev et al., 2007). С другой стороны, в Самарской области 90% PJF-устойчивых штаммов имели мутацию в rpoB531 (Nikolayevsky et al., 2004). Подобная вариабельность может быть связана с локальными различиями в популяционной структуре, например большей или меньшей долей генотипа Beijing. Наши результаты сходны с результатами исследований в Южной Африке (van Rie et al., 2001) и в Казахстане (Hillemann et al., 2005), которые выявили связь генотипа Beijing с аллелем гроВ 531TG. Однако в других публикациях эта мутация была практически одинаково представлена среди штаммов Beijing и не-Beijing из юго-восточной Азии (Qian et al., 2002; Jou et al., 2005) и Латвии (Tracevska et al., 2003) или даже чаще встречалась у RIF-устойчивых штаммов не-Beijing в Корее (Park et al., 2005). Наблюдаемая вариабельность распространения мутации гроВ S531L среди субпопуляций Beijing в различных странах может отражать различия в способности различных вариантов этого генотипа развивать лекарственную устойчивость и, в частности, определенные мутации в гроВ. В тоже время, высокий процент штаммов с этой мутацией был выявлен в болгарской популяции М. tuberculosis, в которой, однако, не было обнаружено штаммов Beijing (Valcheva et al., 2008c). Таким образом, нельзя исключить корреляцию между преобладанием этой мутации и региональными особенностями реализации национальных программ борьбы с туберкулезом, например, качеством используемых для лечения препаратов. В целом, в глобальном контексте, штаммы Beijing не представляются неизбежно ассоциированными с мультирезистентностью (Beggs et al., 2000; Prodinger et al., 2001; Tuyen et al., 2000). В нашем исследовании 25.6% тотально чувствительных штаммов и 40% STR-монорезистентных штаммов принадлежали к генотипу Beijing. В то же время, наши данные показывают, что эти штаммы, циркулирующие в России, высокотрансмиссибельны и мультирезистентны, и чаще, чем другие генотипы, приобретает мутации в наиболее часто мутирующих кодонах генов резистентности katG315, етЬВЗОб (с оговоркой - см. ниже) и гроВ531.
Наш результат анализа мутаций в етЬВЗОб у ЕМВ-устойчивых штаммов в целом не отличался от опубликованных данных (Ramaswamy, Musser, 1998). Отсутствие мутаций в етЬВЗОб у —30-40% ЕМВ-устойчивых штаммов связывают с другими механизмами устойчивости, например мутациями в других участках гена етЬВ или в других генах (Ramaswamy et al., 2000). Неожиданным было выявление мутаций в етЬВЗОб в существенном проценте ЕМВ-чувствительных штаммов. Более того, это расхождение между результатами фенотипического и генотипического тестов было ограничено только штаммами, устойчивыми к другим препаратам, прежде всего, мультирезистентными штаммами (Табл. 4.1). Так, 35 из 64 ЕМВ-чувствительных штаммов, устойчивых к стрептомицину, рифампицину и изониазиду, имели мутацию в етЬВЗОб. Напротив, такие мутации не были выявлены ни в одном из 39 полностью чувствительных штаммов.
