Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 20
1.1 Современные молекулярно-биологические методы диагностики инфекционных заболеваний 20
1.1.1. Молекулярное зондирование 21
1.1.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 23
1.1.3. Сложности, возникающие при использовании ПЦР в практической диагностике 28
1.2. Современная лабораторная диагностика ряда актуальных бактериальных и вирусных инфекций 29
1.2.1. Диагностика бактериальных ОКИ 29
1.2.2. Диагностика хеликобактерной инфекции 34
1.2.3. Диагностика парентеральных вирусных гепатитов 43
1.2.4. Диагностика НУГИ 54
1.3. Внедрение и использование ПЦР в практическом здравоохранении Российской Федерации 73
2. Собственные исследования 77
2.1. Материалы и методы 77
2.1.1. Материалы 79
2.1.2. Методы 80
2.2. Результаты собственных исследований 91
2.2.1. Формирование материальной базы для проведения исследований 91
2.2.1.1. Выбор приборов для проведения ПЦР и фиксирования результатов 91
2.2.1.2. Сравнение вариантов выделения нуклеиновых кислот из клинического материала 92
2.2.1.3. Разработка ПЦР тест-систем для выявления генов факторов патогенности Enterobacteriaceae 93
2.2.1.4. Разработка ПЦР тест-системы для экспресс-детекции шигелл и энтероинвазивных эшерихий 94
2.2.1.5. Адаптация отечественных ПЦР тест-систем для выявления бактерий рода Salmonella к практическим исследованиям 105
2.2.1.6. Адаптация ПЦР тест-системы для выявления генов токсина и адгезинов V.cholerae 109
2.2.1.7. Адаптация ПЦР тест-систем для выявления H.pylori 110
2.2.1.8. Разработка полуколичественного варианта ПЦР детекции H.pylori для контроля эффективности антихеликобактерной терапии 116
2.2.1.9. Адаптация ПЦР тест-системы для выявления гена вакуолизирующего цитотоксина H.pylori VacA 116
2.2.1.10. Выбор и адаптация ПЦР тест систем для выявления возбудителей вирусных гепатитов и НУГИ 118
2.2.1.11. Разработка полу количественно го варианта ПЦР для детекции ВГВ иВГС 119
2.2.2. Значимые направления использования молекулярно-биологических методов в диагностике бактериальных ОКИ 122
2.2.2.1. Изучение распространенности генов факторов патогенности бактериальных возбудителей ОКИ с использованием молекулярно- биологических методов 122
2.2.2.2. Использование ПЦР тест-систем для детекции бактерий родов Shigella и Salmonella в санитарно-эпидемиологической и клинической практике 127
2.2.2.3. Изучение эффективности панели отечественных ПНР тест систем для выявления наиболее значимых бактериальных возбудителей ОКИ в Нижегородском регионе 137
2.2.2.4. Алгоритм использования метода ПЦР в диагностике бактериальных ОКИ 143
2.2.3. ПЦР в диагностике хеликобактерной инфекции и изучении ее возбудителя 146
2.2.3 Л. Выявление H.pylori в различных типах клинического материала 146
2.2.3.2. Сравнительный анализ результатов детекции Н. pylori, полученных традиционными и молекулярно-биологическими методами 149
2.2.3.3 Изучение распространенности H.pylori у больных с различными формами гастродуоденальной патологии 154
2.2.3.4. Использование полуколичественного варианта ПЦР-детекции H.pylori для оценки эффективности антихеликобактерной терапии 157
2.2.3.5 Использование ПЦР для определения резистентности H.pylori к атибиотикам-макролидам 160
2.2.3.6. Изучение возможности использования метода ПЦР для выявления факторов патогенности H.pylori 160
2.2.3.7. Изучение гетерогенности нуклеотидных последовательностей фрагментов гена CagA H.pylori методом гетеродуплексного анализа 164
2.2.3.8. Разработка алгоритма обследования больных с гастродуоденальной патологией на инфицированность H.pylori методом ПЦР 168
2.2.4. Возможные направления использования ПЦР в диагностике парентеральных вирусных гепатитов 171
2.2.4.1.Сопоставление результатов диагностики ВГВ и ВГС, полученных методами ПЦР и ИФА 171
2.2.4.2. Активность вирусов при хронических ВГВ и ВГС, возрастные особенности хронических гепатитов В и С, репликация вирусных НК при гепатитах смешанной этиологии 173
2.2.4.3. Изучение распространения ВГС ведущих генотипов в Нижегородском регионе 180
2.2.4.4. Изучение вероятности вертикального пути передачи ВГС и ВГВ 183
2.2.4.5. Оценка эффективности метода минипулов при обследовании доноров 188
2.2.4.6. Разработка алгоритмов использования ПЦР для обследования больных ВГС и ВГВ 190
2.2.5. ПЦР в диагностике негонококковых урогенитальных инфекций 195
2.2.5.1. Место ПЦР в общей системе методов диагностики НУГИ 195
2.2.5.2 Сезонная динамика выявления возбудрттелей НУГИ у женщин репродуктивного возраста 200
2.2.5.3. Особенности распространения возбудителей НУГИ у женщин и мужчин репродуктивного возраста 204
2.2.5.4. Особенности распространения возбудителей НУГИ у женщин и мужчин с воспалительными процессами в органах мочеполовой системы и у женщин с отягощенным акушерско-гинекологическим анамнезом 209
2.2.5.5. ПЦР-детекция вирусов папилломы человека, M.genitalium, L.monocitogenes, T.gondii 218
2.2.5.6. Изучение распространенности и особенностей циркуляции возбудителей НУГИ среди новорожденных, детей разных возрастов и детей с различными типами патологии 223
2.2.5.7. Оптимизация метода ПЦР с целью информативного и экономичного выявления возбудителей НУГИ. Разработка алгоритмов использования ПЦР в диагностике НУГИ 231
Заключение 23 8
Выводы 260
Список источников литературы 262
Приложения 307
- Диагностика парентеральных вирусных гепатитов
- Разработка ПЦР тест-системы для экспресс-детекции шигелл и энтероинвазивных эшерихий
- Изучение распространенности генов факторов патогенности бактериальных возбудителей ОКИ с использованием молекулярно- биологических методов
- Активность вирусов при хронических ВГВ и ВГС, возрастные особенности хронических гепатитов В и С, репликация вирусных НК при гепатитах смешанной этиологии
Диагностика парентеральных вирусных гепатитов
Выявление вируса гепатита В базируется в основном на иммунологических методах. Наиболее значимым и часто применяемым в практике является исследование на наличие HBs антигена вируса гепатита В, который является главным маркером этого инфекционного агента. Тест на HBs антиген используется при выявлении первично инфицированных, бессимптомных носителей, оценки эффективности лечения, проверки доноров и пулов донорской крови. Впервые HBs антиген был выявлен в реакции преципитации в геле [122]. Следующим этапом совершенствования диагностики гепатита В стало внедрение методов встречного иммуноэлектрофореза и реакции обратной пассивной гемагглютинации, чувствительность которых достигала 400 и 20 нг/мл соответственно [90].
В настоящее время в качестве метода выявления HBs антигена используются различные модификации твердофазного ИФА. В большинстве тест-систем применяется схема одностадийного «сэндвича». Современные планшетные тест-системы позволяют выявить ad и ау субтипы HBs антигена в концентрации до 0,05 нг/мл [90].
Разработаны экспрессные, безинструментальные тесты на HBs антиген, основанные на твердофазном ИФА - «Flow through», «Lateral flow», «Immunocomb HBsAg», которые позволяют получить результат за несколько минут без использования сложного оборудования. Однако их чувствительность составляет 0,5-5 нг/мл. Несмотря на низкую чувствительность, они нашли свою область применения. Экспресс тесты используют, когда применение высокочувствительных методов невозможно из-за ограничений по времени, например при необходимости экстренного переливания крови [57]. Радиоиммуный метод выявления HBs антигена используется достаточно редко, хотя и имеет высокую чувствительность — 0,05 нг/мл. Ограничения обусловлены использованием радиоактивной метки [90].
В последние годы разработаны тест системы и оборудование для выявления HBs антигена хемилюминисцентным методом (разработки фирм «Рош диагностик», «ОМБ». Чувствительность метода составляет 0,05 нг/мл.
Несмотря на высокую специфичность современных тест-систем, не исключается получение ложно-положительных результатов. Это может быть связано с неспецифическим взаимодействием компонентов реакционной смеси и сывороток крови, с бактериальным загрязнением и другими факторами. С целью подтверждения правильности выявления HBs антигена используют тест нейтрализации. Для этого антиген пробы нейтрализуют аттестованной анти- HBs сывороткой. После чего проводят повторный тест, который в случае правильного определения HBs -антигена должен быть отрицательным. Проведение теста нейтрализации обязательно в диагностическом исследовании.
Определение анти — HBs антител. Выявление анти — HBs антител является важным тестом, поскольку позволяет проверять эффективность вакцинации против гепатита В. По международному стандарту, выраженному в мили (международных единицах на миллилитр- mIU/ml), протективный уровень анти — HBs антител должен быть не ниже 10 mIU/ml. Для количественного определения анти — HBs антител применяют тест-систем на основе твердофазного ИФА, где в качестве конъюгата используется меченый высокоочищенный HBs -антиген [90]. Имеются тест-системы для выявления анти — HBs антител, основанные на хемилюминисцентном методе [203].
Определение HBcorAg и антител HBcorAg не часто проводят в практической диагностике вирусного гепатита В. Соответствующие ИФА тест-системы производятся и используются в основном в научно-исследовательских работах. Наибольшее значение имеет выявление антител класса IgM к НВс антигену. Наличие таких антител свидетельствует об имеющейся или прошедшей активной репликации вируса [90].
Выявление HBeAg и антител к HBeAg представляется важным, поскольку это связано с существованием мутантных форм ВГВ. HBeAg и анти HbeAg рассматриваются как суррогатные серологические маркеры Рге-соге - мутантов ВГВ [69]. Для выявления используется «сэндвич» ИФА. Исследования на присутствие HbeAg проводят при наличии HBs антигена. В сыворотках крови, содержащих HBs антиген, в большинстве случаев удается выявить HBeAg и антитела к нему. В качестве подтверждающего теста используется тест нейтрализации HbeAg.
Для выявления ДНК вируса гепатита В исходно использовались методы ДНК-зондов: гибридизация «Дот-блот»; жидкостная гибридизация с выделением образовавшегося комплекса на колонке (тест-система фирмы «ABBOTT») [230, 393]. Чувствительность этих методов - 6х106 частиц вируса/мл.
Более совершенным является метод, получивший наименование гибридизация с использованием разветвленных зондов (branch assay). В процессе реакции происходит многократное присоединение друг к другу зондов, меченных ферментом, окисляющим субстрат и запускающим хемилюминисценцию. С присоединением каждого зонда происходит амплификация сигнала люменисценции. Чувствительность разветвленной гибридизации 7x105 частиц/мл [192]. Метод гибридного захвата (hybrid capture) для выявления ДНК ВГВ основан на связывании продукта гибридизации вирусной ДНК и РНК - зонда с моноклональными антителами. Использование флуоресцентной метки позволило повысить чувствительность метода до 4,7х103- 5,6х107 частиц/мл [193, 298].
На современном этапе ДНК вируса гепатита В выявляется, как правило, тест-системами, использующими принцип ПНР. Промышленный диагностикум «Amplicor HBV monitor» фирмы «Roche diagnostics», где используются меченые праймеры, позволяет выявлять продукт амплификации при помощи ИФА. Он имеет чувствительность 4x10" частиц/мл [244]. Использование технологии «PCR real time» (варианты: TaqMan, molecular becons, интеркалирующие агенты) позволяет более точно проводить оценку концентрации вируса и повысить чувтвительность до 50-100 частиц/мл. [64,68,69,73]. Для этих методов характерен также широкий линейный диапазон выявления вирусной ДНК (от 100 до 1010 копий) и успешная детекция вирусов, относящихся к различным генотипам [239, 372]. Ряд тест-систем, основанных на технологии «PCR real time», сопряжены с различными типами автоматизированных систем выделения нуклеиновых кислот из сыворотки и плазмы крови [117, 195, 398].
Разработка ПЦР тест-системы для экспресс-детекции шигелл и энтероинвазивных эшерихий
К моменту начала нашей работы (середина, вторая половина 90-х годов 20 века) в развитых зарубежных странах уже сложилась индустрия, связанная с ПЦР диагностикой. Спустя 10 лет после опубликования первых работ о ПЦР за рубежом уже имелись лаборатории и диагностические центры, использующие указанный метод. Фирмами, специализирующимися на биологическом и медицинском приборостроении («Bio-rad», «Perkin aimer», «Thermo», «Eppendorf», «Roshe» и др.), производились амлификаторы, микроцентрифуги, микротермостаты, гель-документирующие системы, ПЦР -диагностикумы и комплектующие для них. Изданы книги с протоколами ПЦР детекции обширного круга возбудителей [152, 281, 300, 347]: 1) вирусных агентов: вирусов иммунодефицита человека: лимфотропных вирусов первого типа; вирусов гепатитов В и С; вирусов герпеса простого; Эпштейн-Барр вирусов; цитомегаловирусов; варицелла-зостер вирусов; Jc-вирусов; парвовирусов; вирусов гриппа А, В, С типов; ротавирусов; аденовирусов человека; вирусов краснухи; энтеровирусов человека; генитальных папилломавирусов человека; 2) бактериальных агентов: M.tuberculosis; B.burgdoferi; Y.pestis; T.pallidum; C.trachomatis; C.pneumoniae; M.pneumoniae; Mycoplasma spp., L.pneumophila; L.dumoffii; V.cholerae; энтеротоксигенных, энтероинвазивных E.coli; бактерий рода Shigella; H.pylori; C.difficile; генов токсинов S.aureus: 3) грибков: С.albicans; C.neoformans; P.carinii. 4) одноклеточных napa3HTOB:T.gondii, T.vaginalis, E.histolitica, G.lamblia . В Российской Федерации на середину 90-х годов 20 века пришелся начальный период становления развития системы отечественной ПЦР диагностики. Исходно ПЦР была доступна крупным научно-исследовательским центрам и институтам молекулярно-биологического профиля, оснащенным современным зарубежным оборудованием, и использовалась для решения теоретических проблем.
В 90-х годах в Российской Федерации появились первые фирмы, специализирующиеся на производстве диагностических препаратов и оборудования для ПЦР («Литех»; «ДНК-Технология», «БиоКом», «Внедрение систем в медицину», «Интерлабсервис» и др.)» лаборатории, использующие метод ПЦР для выявления патогенных микроорганизмов и наследственных заболеваний. Начато производство отечественных моделей ДНК-амплификаторов - Amply-250 («БиоКом»); Терцик МС2 («ДНК-технология»), имеющих рабочие характеристики, близкие зарубежным аналогам, и пригодных для проведения практических диагностических исследований. Были разработаны коммерческие ПЦР тест-системы первого поколения. Подавляющее большинство этих систем было представлено диагностикумами для выявления возбудителей негонококковых урогенитальных инфекций и парентеральных вирусных гепатитов. Они представляли собой улучшенные варианты «in hause» тест-систем. Каждый компонент реакционной смеси был помещен в отдельную пробирку, что усложняло этап подготовки к исследованию.
За прошедшие десять лет ситуация существенно изменилась. Количество ПЦР лабораторий в стране, которых в середине 90-х не насчитывалось и ста, превысило тысячу. Наряду с разнообразными моделями традиционных зарубежных и отечественных ДНК амплификаторов, имеется широкий выбор моделей, предназначенных для проведения «Real time» ПЦР, причем четыре из них являются отечественными разработками (модели «ДНК-технологии», Российской Академии Наук, «Биомедицина Сибири»). Созданы флюориметры, адаптированные под микропробирки для ПЦР, что позволило использовать тест-системы с детекцией по конечной точке флюоресценции («end point»).
Значительные изменения претерпели отечественные ПЦР тест -системы. В настоящее время коммерческие диагностикумы представлены смесью лиофильно высушенных реактивов и универсальным буфером-дилюэнтом. Такая комплектация упрощает постановку ПЦР, для этого достаточно добавить к высушенным реактивам дилюэнт и исследуемый образец. Второй вариант тест-систем представлен двухкомпонентными диагностику мами. Нижняя реакционная смесь (праймеры и дезоксинуклеотидтрифосфаты) разлиты по пробиркам и запечатаны пробкой из легкоплавкого воска. Для приготовления полной реакционной смеси добавляется верхняя реакционная смесь (буфер, фермент, краситель) и исследуемая проба. Во время горячего старта пробка плавится и все компоненты смешиваются. Новые технологичные тест-системы сделали метод ПЦР более доступным для практической медицины.
Существенно расширился и спектр выявляемых ПЦР инфекционных агентов. Отечественными диагностикумами в настоящее время возможно обнаруживать более 90 инфекционных агентов вирусной, бактериальной, грибковой и протозойной природы. Проводятся исследования по таким актуальным направлениям, как диагностика ОКИ, гнойных и серозных менингитов, воспалительных заболеваний органов дыхания, хеликобактерной инфекции и ряда других патологий. Но среди ПЦР анализов по-прежнему подавляющее большинство составляют исследования на НУГИ и вирусные гепатиты. Такое узконаправленное развитие определяется тем, что большинство ПЦР лабораторий являются коммерческими организациями и выполняют только экономически целесообразные работы.
Сдерживающим фактором развития ПЦР является то, что эти исследования не включены в официальные стандарты диагностики и не финансируются фондом обязательного медицинского страхования. Метод ПЦР рекомендован для диагностики целого ряда инфекционных заболеваний, но его результаты имеют консультативный характер. Несмотря на значительное количество работ, посвященных ПЦР-детекции как отдельных инфекционных агентов, так и нескольких патогентов одновременно, достаточно редко рассматриваются вопросы рационального применения метода, разработки оптимальных алгоритмов ПЦР-диагностики. Как правило, работы по этому направлению подчеркивают актуальность проблемы, но не содержат конкретных предложений [52, 75, 81].
Изучение распространенности генов факторов патогенности бактериальных возбудителей ОКИ с использованием молекулярно- биологических методов
На момент начала наших исследований практическая ПНР диагностика в Российской Федерации находилась на стадии становления, достаточного опыта работ не имелось, поэтому на исходном этапе значительное внимание было уделено решению ряда методических проблем - выбору приборной базы, методов подготовки клинического материала к исследованию, подбору и адаптации ПЦР тест-систем. 2.2.1.1. Выбор приборов для проведения ПНР и фиксирования результатов.
Для проведении ПЦР-детекции использовались три модели отечественных ДНК-амшшфикаторов: 1-Института биофизики РАН, г. Пущино-на-Оке; 2-«Ампли-250» фирмы «Biokom» г. Москва; «Терцик МС2» фирмы «ДНК-технология» г. Москва.
На наш взгляд наименее удачным был прибор института биофизики РАН. Его термоэлемент, вместимостью 24 пробирки на 0,5 мл или 12 пробирок на 1,5 мл, не поддерживал установленный температурный режим нагрева пробирок с реакционными смесями, что снижало эффективность амплификации. На этом амплификаторе удалось проверить работоспособность диагностикумов с помощью положительных и отрицательных контролей, входящих в его комплект.
Приборы «Ампли-250» и «Терцик МС2» могут быть рекомендованы для исследования клинического материала. По сравнению с прибором фирмы «Biokom» «Терцик МС2» имеет ряд преимуществ: у него большая вместимость нагревательного элемента (40 пробирок вместо 36); нагревательный элемент представлен четырьмя независимо программируемыми блоками емкостью по 10 пробирок, что позволяет одновременно проводить амплификации при четырех разных режимах; наряду с автономным режимом работы имеется возможность подключения к компьютеру, что позволяет отслеживать процесс в графическом и в цифровом режимах; имеется возможность проведения ПЦР в условиях активного регулирования процесса, что уменьшает продолжительность исследования. В нашей работе подавляющая часть экспериментов проведена с использованием амплификаторов «Терцик МС2». С середины 90-х годов по настоящее время этот прибор является базовым для большинства ПЦР-лабораторий Российской Федерации. Для выявления продуктов амплификации использован метод электрофореза в агарозном геле. Изображения электрофореграмм фиксировали отечественной компьютерной системой «Биотест» (фирмы «Биоком», Москва). Такой вариант проще и информативней традиционной фотосъемки. Стоимость системы «Биотест» в 3 раза меньше зарубежных аналогов (систем «Bio-Rad», США и др.). Одной из задач данного исследования являлся выбор варианта обработки проб биологического материала: слюны, мочи, крови, биоптатов, желудочного сока, фекалий и др. Простой и быстрый вариант обработки кипячением, описанный Roosendaal R. с соавторами [315] результатов не дал. Во всех пробах, подвергнутых нагреванию, амплификация ДНК не происходила. Очевидно, имело место ингибирование Taq-полимеразы не удаленными макромолекулами (белками, липидами, полисахаридами). Экспресс-метод обработки клинического материала, предложенный фирмой «Литех» (г. Москва),, также оказался непригодным для подготовки проб крови, слюны, биоптатов к проведению ПЦР.
В дальнейшем использовались более сложные способы, позволяющие получить очищенный раствор нуклеиновых кислот из любого типа клинического материала. Традиционный метод выделения ДНК, состоящий из этапов разрушения клеток ферментами (протеиназой К, проназой), фенольно-хлороформной депротеинизации ДНК с последующим осаждением ее спиртами [47], позволил получить материал, пригодный для проведения ПЦР. Вместе с тем, этот метод имел недостатки, мешающие рекомендовать его для практического применения. Он сложен, состоит из большого количества этапов, продолжительность около 5 часов; требуется применение дорогостоящих ферментных препаратов с ограниченным сроком годности и высокотоксичных веществ (фенол, хлороформ).
Среди способов подготовки проб оптимальными оказались варианты, состоящие из стадий лизиса клеток детергентом (гуанидинизотиоцианатом), сорбции ДНК на носителе (макропористое стекло, силикагель), отмывки сорбированной ДНК от других макромолекул и элюирования ДНК с носителя ТЕ-буфером. Апробированы комплекты реактивов для сорбционного выделения ДНК фирмы «Литех» - «Набор для выделения ДНК из биопроб» и ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора - «ДНК-сорб А», «ДНК-сорб Б». Сорбционные технологии несколько уступают фенольному методу. Он позволяет получить более чистый препарат ДНК при меньших потерях основного вещества. Однако сорбционные методы более технологичны, менее затратны, не требуют использования токсичных веществ, выделение ДНК занимает в 2-2,5 раза меньше времени. Получаемый препарат нуклеиновых кислот пригоден для проведения ПЦР. В дальнейшем для практических исследований нами использовались наборы для подготовки проб производства ЦНИИЭ, которые обладали лучшими рабочими характеристиками.
Активность вирусов при хронических ВГВ и ВГС, возрастные особенности хронических гепатитов В и С, репликация вирусных НК при гепатитах смешанной этиологии
ПЦР детекция возбудителей вирусных гепатитов и НУГИ являются наиболее коммерчески выгодными и востребованными направлениями. Разработке ПЦР тест-систем на данные инфекционные агенты уделялось существенное внимание, поэтому среди отечественных диагностикумов эти тест-системы наиболее качественные и представлены большим количеством вариантов. По техническим характеристикам, простоте и удобству проведения исследования предпочтительнее других были тест-системы производства ФГУН «ЦНИИЭ Роспотребнадзора» и фирмы «Изоген» (Москва). Системы серии «Ампли-сенс» ФГУН «ЦНИИЭ Роспотребнадзора», представляют собой комплекс из двух реакционных смесей: нижней, состоящей из праймеров и нуклеотидтрифосфатов и верхней, состоящей из компонентов буфера для проведения ПЦР, Tag-полимеразы, красителя для электрофореза. Нижняя смесь внесена в пробирки 0,5 мл или 0,2 мл и запечатана пробкой из легкоплавкого воска. Для проведения исследования в пробирки добавляется ПЦР-смесь-2, сверху наслаивается минеральное масло, под которое вносится исследуемый образец, после чего проба готова к ПЦР. В тест-системах «Изоген» большая часть компонентов реакционной смеси лифилизирована в микропробирке. Подготовка к проведению ПЦР заключается в растворении осадка элюентом, входящим в состав диагностикума, наслаивании минерального масла и внесении под него пробы. Эти варианты подготовки минимизирует манипуляции с компонентами реакционной смеси, что уменьшает вероятность контаминации и позволяет избежать ложноположительных результатов. Достоинством тест-систем «АмплиСенс» и «Изоген» является также то, что для выявления M.hominis, U.urealyticum, C.trachomatis, Cytomegalovirus, Herpes simplex ІДІ используются единые универсальные программы амплификации. Кроме этого у систем «АмплиСенс» исключается возможность низкотемпературного неспецифического синтеза, поскольку реакция полимеризации ДНК начинается только после плавления восковой перегородки при 95 С.
Для проведения исследований возбудителей вирусных гепатитов и НУГИ нами были выбраны тест-системы «АмплиСенс». Это сделано по двум причинам: у них температура отжига праймеров выше, чем у систем «Изоген», что способствует более высокой специфичности исследования; продолжительность программы амплификации у диагностикумов «АмплиСенс» практически в 2 раза меньше, это сокращает продолжительность исследования и способствует более длительной эксплуатации амплификаторов. Адаптация к практическим исследованиям систем «АмплиСенс» особых проблем не вызвала. При работе на определенных амплификаторах была на 1 -2 С увеличена температура отжига праймеров. Разработка полуколичественного варианта ГЩР для детекции ВГВ и ВГС. Этот вариант был разработан для оценки вирусной нагрузки и эффективности противовирусной терапии. Основными критериями для метода являлись максимально низкая себестоимость, простота исполнения и максимально возможная информативность и достоверность. Предложенная схема базируется на использовании классического варианта ГЩР с элекрофоретической детекцией продукта амплификации. Для оценки концентрации вируса был использован метод десятикратных серийных разведений. Нами были изучены три варианта: -при первом варианте разводили плазму или сыворотку из каждого разведения выделяли нуклеиновые кислоты, для каждого проводили обратную транскрипцию и ГЩР; -при втором варианте из сыворотки или плазмы выделяли нуклеиновые кислоты, делали их десятикратные разведения, для каждого из них проводили обратную транскрипцию и ГЩР; -при третьем варианте из сыворотки или плазмы выделяли нуклеиновые кислоты, осуществляли одну реакцию обратной транскрипции, делали десятикратные серийные разведения полученной к-ДНК и для каждого из них проводили ПЦР. Анализировали разведения в 10, 100, и 1000 раз. Результаты, полученные при использовании любого из трех вариантов, оказались идентичными. Для определения вирусной нагрузки был выбран вариант 3 как самый экономичный и непродолжительный. В этом варианте проводится однократное выделение нуклеиновых кислот и одна обратная транскрипция, а на последней стадии осуществляется несколько ПЦР, соответствующих количеству разведений. Экспериментально было установлено, что минимально достаточно проанализировать для ДНК-содержащих вирусов (ВГВ, TTV) разведения в 10, 100 и 1000 раз; для РНК - содержащих (ВГА, ВГС, BFG, ВГО) -разведения в 10 и 100 раз. При оценке концентрации вируса использовали следующий подход. В информационных материалах на ПЦР тест-системы (паспорта, рекламные буклеты) указано, что в тестах на ДНК- содержащие объекты достигается чувствительность около 100 частиц/мл, а в тестах на РНК-содержащие объекты — 1000 частиц/мл. В соответствии с этими показателями чувствительности используемых тест-систем проводили расчет относительной концентрации вируса (таблицы 8, 9).
