Введение к работе
Актуальность темы исследования.
Микроскопические методы исследования явились условием для возникновения микробиологии [Antoni van Leeuwenhoek, 1673], а в дальнейшем продолжали играть важную роль в становлении и развитии данного раздела наук о жизни. Так использование световой микроскопии позволило получить представления о разнообразии микроорганизмов в организме человека и природных экосистемах, а также выделить среди них основные морфологические и тинкториальные варианты. Следующим существенным прорывом явилось создание электронного микроскопа [Ruska, 1932], с использованием которого было описано тонкое строение микробных клеток, обозначенное термином «ультраструктура». Последние же достижения в данной области связаны с созданием туннельного микроскопа [Binnig et al, 1982], ознаменовавшего возникновение принципиально нового метода микроскопических исследований - сканирующей зондовой микроскопии.
Среди широкого спектра вариантов сканирующей зондовой микроскопии наиболее привлекательным для проведения микробиологических исследований стала атомно-силовая микроскопия - ACM [Binnig et al., 1986], важным преимуществом которой является нетребовательность к электропроводности исследуемых образцов. При этом в основу АСМ положена регистрация силового взаимодействия между поверхностью исследуемого образца и наноразмерным острием, располагающемся на конце упругой консоли (кантилевера). Соответственно, отслеживание частоты и фазы колебаний кантилевера ведет к получению информации об изменении силы взаимодействия, а на ее основе - о трехмерной геометрии поверхности с нанометровым пространственным разрешением, а также о механических свойствах исследуемого объекта.
Указанные возможности позволили АСМ к началу XXI века занять существенную нишу в практике микробиологических исследований [Ignatov et al., 2004; Dorobantu, Gray, 2010; Dufrene, 2011]. В частности, с ее использованием стало возможным изучение морфофункциональных особенностей одиночных бактериальных клеток [Stukalov et al., 2008] как в физиологически активном состоянии [Bolshakova et al., 2000], так и при воздействии различных факторов [Eaton et al., 2008]. При этом в ряде случаев АСМ существенно дополняла иные методы микробиологического исследования, а в других - позволяла получать абсолютно уникальную информацию о свойствах анализируемых объектов. С другой стороны, накапливающийся массив данных по этому вопросу свидетельствует и о возможных ограничениях или искажениях результатов АСМ [Eaton,West, 2010].
Сказанное позволяет рассматривать использование АСМ для исследования механизмов и последствий воздействия различных факторов биогенной и абиогенной природы на микробные клетки как актуальное направление развития современных микробиологических методов исследования. Одновременно прогресс в данном направлении предполагает необходимость оптимизации методических подходов к проведению атомно-силовой микроскопии биологических объектов.
Цель работы - исследование морфо-функциональной реакции бактериальных клеток на различные абиогенные и биотические воздействия с использованием метода атомно-силовой микроскопии.
Задачи исследования:
Стандартизация методических подходов к исследованию морфологических и механических характеристик бактериальных клеток с использованием атомно-силовой микроскопии.
Использование атомно-силовой микроскопии для исследования характера и последствий контакта бактериальных клеток с углеродными наноматериалами.
Использование атомно-силовой микроскопии для оценки морфо-функциональной реакции бактериальных клеток на воздействие антибиотиков микробного и животного происхождения.
Научная новизна.
Установлена вариативность морфологических и механических свойств бактериальных клеток при изменении относительной влажности окружающей среды (о.в.), при которой осуществляется подготовка препаратов для атомно-силовой микроскопии. Продемонстрирована относительная стабильность регистрируемых параметров грамположительного микроорганизма Bacillus cereus в широком диапазоне значений о. в., в то время как грам отрицательный микроорганизм Escherichia coli характеризуется выраженной реакцией размерных характеристик, шероховатости поверхности и механических свойств при изменении данного параметра. Определены диапазоны значений о.в., позволяющие получать воспроизводимые значения морфо-функциональных характеристик бактериальных клеток при проведении АСМ. Обосновано использование биополимерных пленок на основе агарозы в качестве стандарта эластичности при подготовке атомно-силового микроскопа к исследованию упруго-механических свойств бактериальных клеток.
С использованием АСМ визуализирован характер контакта бактериальных клеток с широким спектром углеродных наноматериалов, представленных одно- и многостенными нанотрубками, нановолокнами и С60-фуллеренами, в том числе функционализированных различными химическими группировками (аддендами). Показано, что нанотрубки и нановолокна не имеют однозначной ориентации к бактериальной поверхности и не ведут к потере внутриклеточного содержимого, что регистрируется только в случае присутствия в их составе значительных количеств технологических (металлических) примесей. Установлено, что модификация С60-фуллеренов катионоидными, но не анионоидными аддендами существенно повышает степень их сродства к бактериальной поверхности, предположительно определяемого электростатическим взаимодействием между данными объектами.
С использованием АСМ оценена морфо-функциональная реакция бактериальных клеток с различным типом строения клеточной стенки на воздействие антибиотиков микробного и животного происхождения. При воздействии ампициллина зафиксировано формирование выраженной гетерогенности морфологических и механических свойств популяций Е. coli и В. cereus, в том числе проявляющихся в нарушении процессов септирования и выраженной дезорганизации поверхностных клеточных структур.
Впервые методом ACM проведен сравнительный анализ эффектов магаинина 2 и экстракта тромбоцитов человека в отношении морфо-функциональных характеристик модельных микроорганизмов. Значительное сходство результатов действия названных антибиотиков животного происхождения на бактериальные клетки, оцененное с использованием АСМ, позволило отнести их к классу поро-формирующих катионных антимикробных пептидов.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Обоснована необходимость контроля относительной влажности среды при подготовке препаратов бактериальных клеток для исследования методом атомно-силовой микроскопии. Предложенная инкубация образцов при относительной влажности 93 % позволяет минимизировать влияние процесса дегидратации на морфологические и механические параметры клеток, что наиболее значимо для грам отрицательных микроорганизмов.
Разработан алгоритм калибровки атомно-силового микроскопа для исследования упруго-механических свойств бактериальных клеток с использованием в качестве внутреннего стандарта эластичности полимерных пленок с содержанием 2 - 4% агарозы, приготовленных при контролируемых значениях о.в.
Полученные посредством АСМ данные о связи между морфологической организацией, характером функционализации углеродных наноматериалов и наличием обусловленных ими повреждений бактериальных клеток могут быть использованы при оценке потенциальной биотоксичности или антибактериальной активности подобных веществ.
Для оценки методом АСМ известных и вновь синтезируемых соединений, направленных на нарушение синтеза пептидогликана, рекомендовано использование грамположительных микроорганизмов. В свою очередь грам отрицательные бактерии представляются адекватными модельными объектами при оценке посредством АСМ биологической активности различных мембраноповреждающих факторов.
Основные положения, выносимые на защиту.
Воспроизводимый анализ морфологических и механических свойств бактериальных клеток с использованием атомно-силовой микроскопии требует стандартизации процедуры пробоподготовки исследуемых препаратов с учетом относительной влажности среды, а также калибровки микроскопа с использованием пленок на основе различных концентраций агарозы.
Использование атомно-силовой микроскопии демонстрирует вариативный характер контакта углеродных нанотрубок с поверхностью бактериальных клеток, интенсивное повреждение микроорганизмов присутствующими в препаратах углеродных наноматериалов технологическими примесями, а также выраженное сродство к бактериальной поверхности катионоидного, но не анионоидного производного С60-фуллерена.
Атомно-силовая микроскопия свидетельствует о существовании межвидовых особенностей и внутрипопуляционной гетерогенности реагирования микроорганизмов на воздействие ампициллина и катионных антимикробных пептидов животного происхождения.
Связь работы с научными программами и собственный вклад автора.
Исследования выполнены при частичной финансовой поддержке Аналитической ведомственной целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы (2009 - 2010 годы)» (проект № 2.1.1/3770 «Оценка биологических эффектов углеродных наноматериалов методами биолюминесцентного анализа»), а также гранта РФФИ 08-04-13726 офи-ц «Разработка биолюминесцентной технологии количественного определения катионных антимикробных пептидов в биологических субстратах».
Научные положения и выводы диссертации полностью базируются на результатах собственных исследований автора.
Апробация работы и публикации.
Отдельные фрагменты работы доложены и обсуждены на XXII Российской конференции по электронной микроскопии (Москва, 2008), Российской конференции с международным участием «Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» (Москва, 2009), V Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2010), I Всероссийской с международным участием школе-конференции молодых учёных «Современные проблемы микробиологии, иммунологии и биотехнологии» (Пермь, 2011).
По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 4 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ и 2 в зарубежной печати.
Объем и структура диссертации.
Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы из 185 наименований отечественных и зарубежных авторов.
