Содержание к диссертации
Введение
1 Фотосинтез, общее рассмотрение 11
1.1 Явление фотосинтеза 11
1.2 РЦ пурпурных бактерий 13
1.2.1 Структура 13
1.2.2 Оптические свойства 15
1.2.3 Первичные процессы фотосинтеза 16
1.3 Первичные фотоиндуцированные парамагнитные состояния 18
1.4 Электронная спиновая поляризация 20
1.4.1 Спин-коррелированные радикальные пары 20
1.4.2 Синглет-триплетная конверсия, S-T0 приближение 21
2 Объекты и методы их исследования. Обработка измерений 24
2.1 Биохимические методики приготовления препаратов 24
2.2 Метод электронного парамагнитного резонанса 25
2.3 Магнетофотоселекция 26
2.4 Техника измерения МФС методом ЭПР высокого временного разрешения (ВР-ЭПР) 29
2.5 Математическое моделирование спектров ЭПР 30
2.5.1 Радикальные пары 31
2.5.2 Триплетные состояния 33
2.5.3 Конструирование "изотропного" спектра. Учёт эффектов МФС 36
3 Спектроскопия ВР-ЭПР первичной радикальной пары бактериального фотосинтеза [РФд] 39
3.1 Формирование первичной РП (РП1) в бактериальных РЦ 39
3.2 Наблюдение сигнала РШ в РЦ фотосинтезирующих бактерий 40
3.3 Спектральное моделирование сигнала ЭПР РШ 43
3.4 Наблюдение и свойства сигнала ЭПР РП1 в мутанте
YM210W бактерии Rb. sphaeroides 47
3.5 Краткие выводы 49
4 Спектроскопия ВР-ЭПР вторичной радикальной пары бактериального фотосинтеза [P+QA ] 50
4.1 Наблюдение эффектов МФС сигнала ЭПР [P+QA ] 52
4.2 Спектральное моделирование 54
4.2.1 Моделирование "изотропного" спектра 54
4.2.2 Моделирование спектров РП2 с МФС 56
4.3 Краткие выводы 59
5 Спектроскопия ВР-ЭПР триплетных состояний бактериального фотосинтеза 61
5.1 Формирование триплетных состояний в бактериальных РЦ 61
5.2 Вектор оптического дипольного момента перехода 63
5.3 Возможности ВР-ЭПР спектроскопии при изучении триплетных состояний РЦ 64
5.3.1 Определение ориентации Qy первичного донора РЦ пурпурных бактерий 65
5.3.2 Определение ориентации D каротиноида сфероидина РЦ фототрофной бактерии Rb. sphaeroides 2 АЛ 71
5.3.3 Определение ориентации Qy молекулы бактериофеофитина, промежуточного акцептора РЦ 76
5.3.4 Пересчёт полученной ориентации Qy первичного донора в молекулярную систему координат 80
5.3.5 Пересчёт полученной ориентации D сфероидина в молекулярную систему координат 81
5.3.6 Пересчёт полученной ориентации Qy бактериофеофитина в молекулярную систему координат 85
5.3.7 Неизотропный характер возбуждения неполяризованным светом 88
5.4 Краткие выводы 90
Заключение 92
Литература
- Первичные процессы фотосинтеза
- Техника измерения МФС методом ЭПР высокого временного разрешения (ВР-ЭПР)
- Спектральное моделирование сигнала ЭПР РШ
- Спектральное моделирование
Введение к работе
Постановка проблемы, её актуальность
Основным источником энергии для всех живых существ, населяющих нашу планету, служит энергия солнечного света. Фотосинтез - это процесс преобразования солнечной энергии в энергию химических связей. В результате его протекания энергия солнечного света используется для синтеза органических веществ.
Исследования общих принципов структурной организации и механизма первичных реакций фотосинтеза, происходящих в специализированных пигмент-белковых комплексах (реакционных центрах, РЦ) имеют большое значение, т.к. именно в РЦ происходит стыковка физических, биологических, биохимических процессов, которые и создают энергетическую основу жизни на Земле. Эти исследования важны как для понимания самого процесса фотосинтеза, так и для создания высокоэффективных фотопреобразователей, работающих на сходных принципах.
Фотосинтетические РЦ остаются объектом пристального внимания исследователей многих стран, и интенсивно изучаются. Уже известна структурная организация ряда реакционных центров, но уникальные свойства этого объекта (практически равный единице и не зависящий от температуры квантовый выход первичного фотохимического процесса, асимметрия переноса электрона в РЦ и др.) остаются до конца не объяснёнными.
Современный взгляд на механизм первичных стадий фотосинтеза предполагает, что с электронного возбуждения одной из молекул пигментов, входящих в состав РЦ, начинается цепочка реакций переноса электрона между его компонентами. В процессе этого первичного разделения зарядов образуются парамагнитные продукты, такие как свободные радикалы, радикальные пары (РП) и триплетные состояния пигментов. Эффективным методом изучения подобных состояний является электронный
7 парамагнитный резонанс (ЭПР). Этот метод позволяет получать информацию о природе парамагнитных молекул, их магнитных взаимодействиях, динамических свойствах и, в конечном счёте, о механизмах реакций, в которых они принимают участие.
Надо отметить, что спектры, полученные методом стандартного ЭПР, являются стационарными, в то время как большинство парамагнитных состояний в РЦ - короткоживущие. В связи с этим, в качестве методического подхода в диссертационной работе выбран метод электронного парамагнитного резонанса прямого детектирования высокого временного разрешения (ВР-ЭПР). Важным преимуществом данного метода является также то, что он даёт возможность регистрации парамагнитных состояний ещё до протекания их заметной спин-решёточной релаксации или дезактивации.
Из литературы известны многочисленные попытки применения кинетического ЭПР к исследованию фотохимических процессов в РЦ. Между тем, при анализе этих работ обнаруживаются определённые проблемы:
существенные детали спектральной формы некоторых сигналов ЭПР препаратов РЦ, приготовленных одинаковым образом, измеренные исследователями разных групп, различаются;
качество моделирования сигналов короткоживущих состояний РЦ (соответствие модельного спектра экспериментальному) зачастую весьма далеко от удовлетворительного, что вызывает сомнения в правильности интерпретации экспериментальных данных;
сигналы некоторых парамагнитных состояний, (например, первичной радикальной пары, см. ниже), наблюдаемые другими время-разрешёнными методиками, методом ЭПР не наблюдаются вовсе.
Цель и задачи исследований
Целью настоящей работы являлось исследование короткоживущих парамагнитных интермедиатов первичной фотохимической реакции в РЦ
8 фототрофных бактерий методом ВР-ЭПР, что включало:
поиск сигнала ЭПР первичной радикальной пары (РШ) в реакционных центрах ряда фототрофных бактерий, его анализ с целью выяснения взаимодействий между компонентами РШ;
исследование спектральных свойств сигнала ЭПР вторичной радикальной пары бактериального фотосинтеза (РП2), анализ зависимости формы сигналов РП2 от условий их регистрации, получение информации о взаимодействиях между компонентами РШ;
систематическое исследование триплетных состояний бактериальных РЦ и анализ формы полученных спектров;
- разработку программ математического моделирования спектров ЭПР
короткоживущих состояний РЦ с целью определения, из экспериментально
полученных данных, величин магнитных взаимодействий и ориентации
физических (оптических и магнитных) осей парамагнитных молекул.
Научная новизна и практическое значение работы
Впервые зарегистрирован спектр ЭПР первичной радикальной пары фотосинтетического реакционного центра. В результате разработанных программ спектрального моделирования (в среде ТурбоПаскаль 5.0) наиболее прямым образом определён знак обменного взаимодействия (7РФ) между радикалами первичного донора и промежуточного акцептора РЦ для ряда фототрофных бактерий. Определённый в работе отрицательный знак 1РФ согласуется с механизмом последовательного переноса электрона в первичной фотохической реакции бактериального фотосинтеза.
Разработана методика измерения спектров ВР-ЭПР в условиях возникновения магнетофотоселекции (МФС) и разработаны программы математического моделирования полученных спектров:
- вторичной радикальной пары бактериального фотосинтеза, с определением ориентации дипольной оси РП2;
- триплетных состояний бактериальных РЦ, с определением ориентации векторов оптических дипольных моментов перехода, D, ряда пигментов: РЦ-связанного каротиноида сфероидина фототрофной бактерии Rb. sphaeroides 2АЛ., а также первичного донора и промежуточного акцептора РЦ пурпурных бактерий.
Найденные векторы были совмещены с известной рентгеноструктурной моделью РЦ, в результате были определены ориентации этих векторов по отношению к молекулярной структуре.
Показан неизотропный характер возбуждения неполяризованным светом и, таким образом, определён источник ошибок в обработке и интерпретации спектральных данных в работах прошлых лет.
Полученные результаты способствуют более глубокому пониманию механизмов переноса энергии и электрона в процессе первичной фотохимической реакции в фотосинтетических РЦ.
Апробация работы
Основные результаты диссертации докладывались на: международной конференции "Биоэнергетика фотосинтеза" (Пущино, 1996), IV International Symposium on Magnetic Field and Spin Effects in Chemistry and Related Phenomena (Новосибирск, 1996), 5th Joint Colloquium on Photosynthesis in Bacteria, Algae, and Higher Plants (Берлин, 1998), XI International Congress on Photosynthesis (Будапешт, 1998), TMR meeting 'Molecular mechanisms of photosynthetic energy conversion' (Ноордвайк, 1999), ICP-XX International Conference on Photochemistry (Москва, 2001), Симпозиум "Современная химическая физика" (Туапсе, 2001 - 2007), XVII Pushchino Readings in Photosynthesis and International Conference "Primary Processes of Photosynthesis in Bacteria and Plant Photosystem И" (Пущино, 2002), VI Voevodsky Conference "Physics and Chemistry of Elementary Chemical Processes" (Новосибирск, 2002), International Conference "Primary Processes of Photosynthesis" (Пущино,
10 2003), International Conference 'Modern development of magnetic resonance' (Казань, 2004), а также на иных конференциях и семинарах.
Основные результаты работы изложены в 28 публикациях, в том числе в 10 статьях.
Структура и объём работы
Диссертация состоит из введения, 5 глав с изложением литературных данных и собственного экспериментального материала, а также заключения с выводами. Диссертация содержит 105 страниц, 36 рисунков, 6 таблиц. Список литературы включает 166 ссылок на работы отечественных и зарубежных авторов.
Первичные процессы фотосинтеза
На рисунке 3 показаны спектры поглощения РЦ каротиноид-содержащей фотосинтезирующей бактерии Rb. sphaeroides 2АЛ. при комнатной и криогенной температурах. Полосы поглощения в ближней ИК части спектра (Я, 700 нм) соответствуют Qy-переходам БХл и БФео реакционного центра; при 590 нм и в районе 530 нм соответствуют Qx-переходам БХл и БФео, соответственно; три полосы при 445, 472 и 505 нм принадлежат каротиноиду. Две молекулы БХл, составляющие димер первичного донора Р, экситонно связаны, что приводит к расщеплению их оптических переходов на нижнюю (Q ) и верхнюю (Q ) экситонные компоненты [3], при этом переход Q гораздо более интенсивен и даёт полосу поглощения при 867 нм при комнатной температуре, в то время как менее интенсивный Q поглощает при 814 нм и, соответственно, даёт вклад в полосу мономерных БХл, составляя около 10 % общей интенсивности [34].
При криогенных температурах все полосы сужаются, и полоса Q" сдвигается в длинноволновую область до 890 нм. Молекулы БФео имеют немного различные максимумы поглощения при криогенных температурах, в результате чего молекула БФео активной цепи (БФеоА) поглощает сильнее в длинноволновой части Qy полосы феофитинов. Максимумы поглощения Qx разрешены лучше и демонстрируют две частично разрешённые полосы поглощения при 532 нм и 545 нм для БФеоЛ и БФеов, соответственно.
В заключение этого параграфа отметим, что какой бы пигмент ни поглотил световой квант, возбуждение с него передаётся в РЦ и приводит к образованию возбуждённого состояния первичного донора электрона Р.
Первичным донором электронов в бактериальном фотосинтезе является димер молекул бактериохлорофилла (Р), и с его возбуждения в фотосинтетическом РЦ начинается показанная на Рисунке 4 последовательность реакций переноса электрона [10,35,75]. Этот процесс обычно называется разделением зарядов, т.к. в то время как донор остается заряженным положительно, отрицательный заряд возникает на одном из последующих кофакторов, входящих в электрон-транспортную цепь. На первом этапе электрон с возбужденного донора Р переносится на мономерный бактериохлорофилл ВА, формируя через 3 пс (1-2 пс при криогенных температурах) состояние [Р+В А ], за чем следует быстрый (0.9 пс при комнатной и 0.3 пс при низкой Т) перенос электрона с ВА на молекулу бактериофеофитина ФА с формированием т.н. первичной радикальной пары (РП1) [Р+ФА ], затем через 200 пс (80 пс при низкой Т) - с ФА на первичный акцептор, молекулу хинона QA с формированием РП2 [P+Q А ] и, далее, через 100 мкс, на вторичный хиноновый акцептор QB. При криогенных температурах перенос на QB блокирован [89]. Таким образом, перенос электрона от возбуждённого Р к хиноновым акцепторам происходит трансмембранно, нормально к плоскости фотосинтетической мембраны. Стоит обратить внимание на тот факт, что [Р+ВА], первое из возникающих РП-состояний [50,88,140], формируется медленнее, чем распадается. Его заселенность поэтому весьма мала, с чем и связаны трудности в регистрации [Р+Вд]. Первичной РП1 корректно называть только следующее зарядово-разделённое состояние [Р+ФА], изучаемое как оптически [85,103], так и с помощью магнитных эффектов [74,99]. Вторичная РП2, относительно долгоживущая, в бактериях детектируется, помимо оптических измерений [89], уже и методом ЭПР [9,19,66,123,126,150,151,163].
Техника измерения МФС методом ЭПР высокого временного разрешения (ВР-ЭПР)
Логичным завершением любого экспериментального исследования является объяснение полученных результатов и планирование дальнейших измерений. Зачастую это оказывается невозможным без моделирования, хотя бы предварительного.
Обсудим вначале общие принципы математического моделирования спектров ЭПР парамагнитных продуктов, образующихся в процессе первичной фотохимической реакции.
Радикальные пары
Для того, чтобы из спектров ЭПР получить информацию о взаимодействиях в РП, был применён формализм спин-коррелированных радикальных пар (СКРП) [41,77,78,113,166], впервые введённый для объяснения формы спектра РП2 [41,78]. Спин-гамильтониан РП в рамках этой теории может быть записан в виде:
Н = co,Slz + co2S2z - hi(S2 -1) + УА2(со82$ - /3)(3SZ2 -S1), (2.1) где (йі = gi\iBB0/h + АвМу (1 = l 2) і Здесь Siz — z-проекция (ВДОЛЬ магнитного поля В0) оператора спина, цв -магнетон Бора, g\ - g-тензор, а Ац, Мц - соответственно константа сверхтонкого взаимодействия и магнитное квантовое число ядра j в первом радикале, с аналогичными обозначениями (с заменой 1 на 2) для второго радикала, данные в частотных единицах; S2 = S2\ + 522 - оператор полного спинового момента; Jo и DJ2 - изотропное обменное и анизотропное аксиально-симметричное магнитное диполь-дипольное взаимодействие двух радикалов в частотных единицах; % - угол между дипольной осью, соединяющей два радикала РП, и магнитным полем В0. Ориентационная зависимость дипольного взаимодействия РП: d = Di2(cos - /з). Удобно ввести также полусумму и полуразность ларморовых частот рассматриваемых спинов как соо = /2(0)1 + со2) и Лоз = Уі{ &\ - со2) Приведённый гамильтониан (2.1) можно выразить в матричной форме и, после её диагонализации, получить энергию спиновых подуровней и собственные значения спин-коррелированной РП: = Т+ 2) = cos(pS) + sin(pT0) 3) = - sin(p[S) + СОБфІТо) 4 = Т_ E, = ffl0-(J-d)/2 E2 = Q + (J-d)/2 E3=-Q + (J-d)/2 E4 = -(Oo-(J-d)/2, (2.2) где Q является частотой, а ф - угловым параметром синглет-триплетного смешивания, определяемые равенствами: Q2 = Aco2 + (J + d/2)2; зіп(2ф) = Лш/Q; СОБ(2Ф) = (J + d/2)/Q; tg(2q ) = Aoo/(J + d/2). (2.3)
Схема расположения упомянутых подуровней представлена на Рисунке 9А. Поскольку наблюдаемая РП возникает в синглетном состоянии, то в 13 9i 12(J-d) і 2(J-d) Рисунок 9. Схема расположения энергетических подуровней спин-коррелированной радикальной пары в сильном магнитном поле (А) и "палочный" спектр ЭПР для произвольной ориентации РП (Б). сильных магнитных полях только два средних подуровня, имеющие синглетную примесь, исходно заселены. Этим объясняется и наличие четырёх разрешенных переходов с этих уровней на незаселённые чисто триплетные, это обуславливает и фазу линий, изображённую на Рисунке 9Б. Частота разрешённых переходов равняется: соп = «о - (J - d) - Q; Ю34 = Юо + (J - d) - Q; о із = coo - (J — d) + Q; co24 = OD0 + (J - d) + Q, (2.4) а их интенсивности, принимая во внимание то, что начальные заселённости подуровней определяются их синглетным характером, а вероятности ЭПР перехода - долей триплетнои примеси подуровней, участвующих в каждом переходе, равняются: І12 = -134 = Ііз = -124 = Aco2/8Q2. (2.5) Для каждой ориентации РП во внешнем поле рассчитывался 5-спектр (состоящий из 8-функций, т.н. "палочный"), затем для учёта анизотропного сверхтонкого взаимодействия вокруг резонансных полей рассчитывались линии гауссовой формы с ширинами, зависящими от ориентации, и полученные таким образом спектры суммировались по всем возможным ориентациям с соответствующим весом. Для учёта анизотропии
Зеемановского взаимодействия вводились ориентационно-зависимые g тензоры радикалов: g2(a, (3) = gl sin2acos2p + g sin2a sin2p + g]2 cos2p\ (2.6) где аир означают сферические углы, определяющие ориентацию Во по отношению к главным осям -тензоров партнёров РП. Было принято, что оси СТВ и g-тензоров совпадают.
Триплетные состояния Спектры ЭПР триплетного состояния пигментов РЦ хорошо описываются в рамках чисто спинового магнетизма, без учёта спин 34 орбитального взаимодействия, соответствующим спин-Гамильтонианом [2,70]: Hs = VnB0gS + D(S I - 1/352) + E(S \ \), (2.7) где S - оператор полного спина молекулы, S, - его проекции на координатные оси, Цв - магнетон Бора, g - g-тензор молекулы, В0 -магнитная индукция, D и Е - параметры расщепления в нулевом поле (РНП). Величина параметров РНП определяется распределением неспаренных электронов по молекуле: D = 3/4gW (r2 - 3z2)/r5 , Е = 3/4gW (y2 - x2)/r5 , (2.8) где угловые скобки означают усреднение по электронной волновой функции. В пигментах хлорофильного типа электронная плотность локализована, в основном, в плоскости тетрапиррольного кольца, так что D приблизительно пропорционален среднему значению 1/г (г - расстояние между неспаренными электронами триплета) и убывает при увеличении области делокализации триплетного состояния, а Е отражает симметрию распределения неспаренных электронов, обращаясь в ноль в пределе аксиальной симметрии.
Спектральное моделирование сигнала ЭПР РШ
Таким образом, при использовании адекватного временного разрешения, методом ВР-ЭПР прямого детектирования удалось впервые зарегистрировать спин-поляризованный сигнал первичной радикальной пары [Р+Фд] в реакционных центрах фотосинтетических бактерий Rb. sphaeroides и В. viridis, электронный перенос после ФА в которых блокирован. Моделирование полученных спектров с применением формализма СКРП, который раньше успешно применялся для описания ЭСП вторичной радикальной пары [P+QA ], позволило впервые и наиболее прямым образом определить величины и знаки магнитных взаимодействий в РШ, что существенно для понимания механизма первичного разделения зарядов. Определённый в работе отрицательный знак обменного взаимодействия хорошо согласуется с механизмом последовательного переноса электрона в первичной фотохимической реакции бактериального фотосинтеза.
Состояние [P+QA] является первым относительно долгоживущим состоянием первичной фотохимической реакции фотосинтеза, его время жизни на порядки величин больше всех предыдущих стадий. В нативных РЦ при температуре выше 15 К методом ЭПР наблюдается только сигнал Р+, т.к. Q А испытывает сильное магнитное взаимодействие с парамагнитным Fe , и его сигнал ЭПР слишком уширен из-за быстрой релаксации в железо-хиноновом комплексе. Если же разрушить магнитное взаимодействие добавлением к образцам РЦ додецилсульфата натрия (Na-ДДС), либо замещением парамагнитного железа Fe2+ диамагнитным цинком Zn2+, оба радикала, Р+ и QA, будут давать вклад в регистрируемый сигнал ЭПР вторичной радикальной пары [P+QA] (РП2). Впервые методом ВР-ЭПР сигнал РП2 наблюдался в образцах РЦ, обработанных Na-ДДС [76], а затем также в интактных [9,126] и Zn-замещённых РЦ [19,66,123,151,163].
РП2 представляет собой пару слабо связанных радикалов, т.к. расстояние между ними (25-30 А) слишком велико для возникновения значительных магнитных взаимодействий. Спины неспаренных электронов радикалов в первые моменты после образования РП коррелированы. Они находятся в синглетной конфигурации, т.к. в процессе нормально функционирующего фотосинтеза РП2 образуется от синглетного предшественника ![P+QA] приблизительно за 200 пс (см. раздел 1.2.3), за которые спиновое состояние радикалов измениться не успевает [142]. Из-за образующейся неравновесной заселённости зеемановских подуровней Р+ и QA во внешнем поле, наблюдаемый сигнал ЭПР пары демонстрирует 100% начальную электронную спиновую поляризацию.
Количественный анализ получаемых спектров (раздел 2.5.1) может дать информацию о величине магнитных взаимодействий между радикалами пары и о расстоянии между ними. Теория СКРП, описывающая ЭСП 51 спектры, учитывает вклады магнитного диполь-дипольного взаимодействия (в приближении точечных диполей): d(r) = D(r) (cos - 1/3), где D(r) = (3gP)2/ (4r3), (4.1) и обменного взаимодействия: J(r) = J0expHr), (4.2) где г - расстояние между спинами, \ - угол между вектором, соединяющим центры радикалов пары (дипольная ось), и направлением внешнего магнитного поля, g - фактор спектроскопического расщепления, (3 -магнетон Бора, Jo и X - константы. Таким образом, определение величины дипольного взаимодействия позволяет рассчитать расстояние между Р+ и Q А не в основном состоянии РЦ, а в процессе прохождения первичной фотохимической реакции, в то время как величина обменного взаимодействия свидетельствует о степени перекрывания волновых функций радикалов, т.е. о скорости переноса электрона между радикалами пары.
Исследование свойств вторичной РП [P+QA] методом ЭПР и определение, по форме линии получаемых спектров, магнитных взаимодействий между кофакторами длительное время привлекает внимание исследователей ряда стран [9,19,66,123,126,150,151,163]. Спин-поляризованные сигналы ЭПР РП2 были рассчитаны в нескольких лабораториях с использованием теории СКРП [78, 110,113,142,152]. Тем не менее, оставался без объяснения тот факт, что формы линий ЭПР, получаемые разными группами исследователей, от препаратов РЦ, приготовленных одинаковым образом, значительно различаются [150,151]. При внимательном рассмотрении условий регистрации вышеозначенных спектров ЭПР прямого детектирования с разрешением по времени, оказалось, что единственным отличием является длина волны возбуждающего РЦ света. Оптическая область возбуждения никогда не считалась важной, т.к. общепризнано, что какой бы пигмент ни поглотил свет первым, быстрый перенос энергии приводит к тому, что в итоге именно !Р даёт начало реакции фотосинтетического переноса электрона [75]. Нами, однако, было показано [124], что форма регистрируемого спектра ЭПР претерпевает существенные изменения как при варьировании длины волны возбуждающего света (Рис. 16), так и при повороте плоскости его поляризации (Рис. 17).
Наблюдение эффектов МФС сигнала ЭПР [P+Q \ ]
На Рисунке 16 показана серия спин-поляризованных сигналов РП2, полученных в образце Zn-замещённых РЦ Rb. sphaeroides R26, возбуждаемом светом различной длины волны. Ясно видно, что при возбуждении РЦ в полосу поглощения Р (Рисунок 16А, Б), форма сигналов практически не меняется, хотя и отличается от опубликованных ранее [66,151]. Между тем, при возбуждении в полосу мономерных бактериохлорофиллов, форма спектра изменяется существенно (Рисунок 16В, Г). Полученный результат может быть объяснён качественно, если принять во внимание явление фотоселекции при возбуждении образца линейно-поляризованным светом лазера (см. раздел 2.3). Облучение образца в ближнюю инфракрасную полосу Р (около 900 нм) выборочно возбуждает ту часть РЦ, оптический дипольный момент перехода Qy первичного донора которых направлен приблизительно вдоль электрического вектора (Е) возбуждающего света. И эта выборка практически не меняется по всей полосе поглощения Р. Облучение же в полосу мономерных бактериохлорофиллов (около 810 нм), где частично перекрываются полосы поглощения двух мономеров (с возможной примесью вклада Р), преимущественно возбуждает ту часть РЦ, в которых вектору Е коллинеарны моменты перехода Qy мономерных бактериохлорофиллов. Средний оптический дипольный момент перехода при этом имеет направление, отличное от Qy первичного донора, и более того, изменения внутри полосы 810 нм определяется изменением распределения возбуждения между двумя поглощающими молекулами.
Спектральное моделирование
Триплетное состояние каротиноидов РЦ изучалось как оптически [44,109], так и методом ЭПР [59,61,62]. Большие усилия были предприняты для определения ориентации главных триплетных осей каротиноида сфероидина в РЦ Rb. sphaeroides 2 АЛ. с использованием техники магнетофотоселекции [105]. В этих экспериментах использовался традиционный метод стационарного ЭПР и возбуждение светом, модулированным по амплитуде для повышения чувствительности. Т.к. состояние 3Кар короткоживущее, в процедуру моделирования вынужденно вводились кинетические параметры, что существенно ухудшило надёжность информации, полученной из МФС.
Воспользовавшись существенным различием в спектрах поглощения Р и Кар, что позволяет осуществлять избирательное возбуждение этих пигментов (Раздел 1.3, Рис. 5), и возможностью контроля заселения Кар и Р Ell Br
Спектры РЦ Rb. sphaeroides 2 АЛ. с восстановленным QA, полученные в "Тип 2" эксперименте (А, Б) и их моделирование (В, Г). Параметры моделирования МФС указаны в Таблице 5.2. состояний изменением температуры (схема 5.1), мы провели 4 типа экспериментов:
Тип 1. Прямое возбуждение первичного донора и регистрация сигнала 3Р 0-возб = 896 нм, Т = 10 К) позволяет определить ориентацию переходного момента донора Qy относительно магнитных осей 3Р.
Тип 2. Прямое возбуждение Р и регистрация сигнала 3Кар (Яв03б = 896 нм, Т = 100 К) позволяет определить ориентацию оптического дипольного момента перехода Qy относительно магнитных осей 3Кар.
Тип 3. Косвенное возбуждение Р, происходящее посредством S переноса энергии с возбуждённого Кар и регистрация сигнала 3Кар (Хв03б = 472 нм, Т = 100 К) позволяет определить ориентацию оптического дипольного момента перехода Кар D относительно магнитных осей 3Кар.
Тип 4. Косвенное возбуждение Р, происходящее посредством S переноса энергии с возбуждённого Кар и регистрация сигнала Р (XB03Q = 472 нм, Т = 10 К) позволяет определить ориентацию переходного момента Кар D относительно магнитных осей 3Р.
Эксперимент первого типа был подробно рассмотрен в предыдущем разделе 5.3.1. Что касается экспериментов второго и третьего типа (высокотемпературных), на зарегистрированных спектрах видно небольшое количество узкого 3Р сигнала, наложенного на гораздо более интенсивный сигнал 3Кар (спектры не показаны). Это происходит, вероятно, вследствие неполного переноса триплета от первичного донора к каротиноиду, а также в результате наличия небольшого количества РЦ, потерявших каротиноид [144]. Благодаря существенной разнице в величинах параметров РНП сигналов ЭПР JP и JKap, несложно избавиться от этой добавки простым вычитанием подходящего количества Р сигнала, измеренного в низкотемпературных экспериментах. На рисунках 28 и 29 спектры показаны уже после такого вычитания. И, таким образом, мы видим чистый сигнал триплетного состояния Кар, при возбуждении Qy первичного донора Р (Рис.
РЦ Rb. sphaeroides 2.4.1. с восстановленным QA, полученные в "Тип 4" эксперименте (А, Б) и их моделирование (В, Г). Параметры моделирования указаны в Таблице 5.2. 28) и оптического дипольного момента перехода D сфероидина Кар (Рис. 29). Вид сигналов, полученных в экспериментах 4-го типа, показан на Рисунке 30. В этом случае наблюдается триплетный сигнал Р при возбуждении дипольного переходного момента D каротиноида.
Первым шагом спектрального моделирования, как и ранее (Раздел 5.3.1), был расчёт "изотропного" спектра, равного сумме одного Е\\Во и двух Е±Во экспериментальных спектров (не приводится). Полученные на этом этапе ЭПР-спектроскопические константы для триплетных сигналов: 3Р (Рис. 30): D = 0.0188 ± 0.0003 см 1, Е = 0.0032 ± 0.0003 см 1, gx = gy = 2.002 ± 0.001, gz = 2.000 ± 0.001, АНХ = АНУ = AHZ = 1.3 мТл; 3Кар (Рисунки 28 и 29V. D = -0.0285 ± 0.0003 см"1, Е = 0.0043 ± 0.0003 см"1, gx = gy = 2.002 ± 0.001, gz = 2.000 ± 0.001, АНХ = 2.5 мТл, АНУ = 1.5 мТл, ДН2 = 2.5 мТл.
При дальнейшем моделировании эти значения поддерживались постоянными, варьировались лишь угловые параметры. Последние указаны в Таблице 5.2. Величины ошибок допустимых значений оценивались, как и раньше, исходя из того, насколько можно изменять значения углов 5 и у, чтобы модельный спектр сохранял соответствие экспериментальному.
Исследование магнитных осей Кар проводились в течение нескольких лет группой американских учёных [62,105]. В Таблице 5.3 сравниваются ориентации векторов Qy и D относительно системы осей 3Кар, полученные этой группой [105], и результаты нашей работы.
Из Таблицы 5.3 видно, что ориентация Qy, полученная нами, существенно отличается от известной из литературы. Это отличие объясняется, по-видимому, неадекватностью используемого ранее метода МФС со стандартным ЭПР при изучении короткоживущих парамагнитных состояний. Спектры стандартного ЭПР, по сути, стационарны, они показывают фотоиндуцированный сигнал, усреднённый по времени. Спектральное моделирование, как и в наших работах, в предыдущих исследованиях начиналось с построения "изотропного" спектра, т.е. спектра, который регистрировался бы при равновероятном возбуждении всех ориентации молекул в образце. Спин-решёточной релаксацией 3Кар пренебрегали, т.к. она предполагалась более медленной, чем дезактивация триплета в основное состояние, а отклонение амплитуд канонических линий от теоретических значений корректировалось введением констант скоростей дезактивации спиновых подуровней. Кинетические параметры, полученные из моделирования "изотропного" спектра, в дальнейшем вводились в расчёты спектров с МФС, из которых и были получены угловые параметры. К тому же, спектр, полученный в стандартных условиях ЭПР, не может рассматриваться как изотропный (см. Раздел 5.3.7). Допущение его изотропности вносит ошибку в определяемые из его моделирования кинетические параметры и, в итоге, в величины угловых координат оптических дипольных моментов переходов. В нашей работе спектры Е \\ Во и Е1Л0 были измерены по-отдельности, и в качестве "изотропного" служила сумма одного Е В0 И двух Е±В0 спектров. К тому же, спектр ЭПР прямого детектирования действительно свободен от эффектов спин-решёточной релаксации.
Похожие диссертации на Исследование короткоживущих парамагнитных интермедиатов первичной фотохимической реакции в реакционных центрах фототрофных бактерий
