Содержание к диссертации
Введение
1. Закономерности движения бактерий . 10
1.1. Механизмы перемещения и ориентации бактерий 10
1.2. Молекулярный механизм хемотаксиса 17
2. Структурообразование в популяциях бактерий 20
2.1. Популяционные кольцевые волны 21
2.2. Механизм взаимодействия кольцевых популяционных волн 25
2.3. Зерноподобные структуры 27
2.4. Фракталоподобные структуры 29
2.5. Спиральные структуры 34
3. Нестационарная динамика бактериальных популяционных волн. 37
3.1. Периодические процессы в природе 37
3.2. Экспериментальные исследования формирования стационарных концентрических колец в процессе роста колонии подвижных бактерий Е. coli 41
3.3. Математическая модель формирования стационарных концентрических структур популяциями подвижных бактерий 49
4. Условия возникновения неустойчивости фронта бактериальной популяционной волны и формирования фракталоподобных структур. 59
4.1. Экспериментальные исследования механизмов формирования фракталоподобных структур на популяциях бактерий Е. coli 59
4.2. Математическая модель возникновения неустойчивости фронта, распространяющейся популяции хемотаксисных бактерий 76
Основные результаты 86
Список литературы. 88
- Механизм взаимодействия кольцевых популяционных волн
- Спиральные структуры
- Экспериментальные исследования формирования стационарных концентрических колец в процессе роста колонии подвижных бактерий Е. coli
- Математическая модель возникновения неустойчивости фронта, распространяющейся популяции хемотаксисных бактерий
Введение к работе
популяций и экосистем, возбудимьгх тканей, нейронных сетей и т.д. (Holden А.
І 1991; Иваницкий Г.Р. 1991, 1994; Shapiro, 1988; Ben-Jacob Е. 2000).
Диссертационная работа посвящена экспериментальным и теоретическим исследованиям динамики процессов формирования и развития пространственно-временных структур в популяциях подвижных бактерий. Популяционные волны представляют собой наглядный j пример перехода от случайного движения отдельных организмов к детерминированному поведению их сообществ. Кооперативное «социальное» поведение, а также возможность смены режима распространения и формирования различных волновых структур, способствуют эффективной адаптации растущей и распространяющейся популяции к меняющимся условиям окружающей среды. Простейшей и наиболее естественной формой распространения нелинейной волны в возбудимой среде является регулярный кольцевой. или плоский фронт - вследствие наличия диффузии, нерегулярные возмущения фронтов со временем обычно выпрямляются. Однако, при некоторых условиях (например, при различиях в скорости диффузии
активных компонентов среды), на фронте бегущей волны могут развиваться, неустойчивости, ведущие к ее разрушению и образованию более сложных пространственно-неоднородных структур Адекватное управление внешними условиями дает возможность изменять режим распространения популяционной волны. Спектр получаемых структур очень широк - от диссипативных структур Тьюринга и автоволновых спиралей Белоусова-Жаботинского до, детерминированного хаоса и фракталов. Структуры, образующиеся при росте бактериальных сообществ, можно разделить на несколько основных классов: кольцевые популяционные волны (Adler J. 1966); пространственно-периодические стационарные кольцевые волны (Matsuyama Т. 1999; Wakita J. 2000); пространственные спирали (Watanabe К. 2002); зерноподобные и ячеистые структуры (Budrene Е. 1991); фракталоподобные структуры (Fujikawa Н. 1989; Ben-Jacob Е. 1990,1995,2003; Крестьева И. 1996; Tsyganov М. 1999).
Стационарные кольцевые волны возникают в результате последовательной серии симметричных расщеплений распространяющегося кольцевого популяционного фронта. Механизмы подобных расщеплений, предложенные в нескольких независимых работах (Matsuyama Т. 1999; Wakita J. 2000, 2001; Shimada Н. 2004), были специфичны к виду использованных бактерий - в частности, во всех этих работах необходимым условием остановки фронта с его последующим разделением являлось существование двух состояний бактерий -подвижного и неподвижного. Вопрос о возможности существования периодических колец в недифференцированных бактериальных сообществах, а
также вопрос об универсальном физическом механизме формирования стационарных кольцевых структур, таким образом, остается открытым.
Фракталоподобиые структуры, в отличие от стационарных колец, возникают в результате нарушения пространственной симметрии распространяющегося кольцевого фронта, когда шумовые возмущения на фронте популяционнои волны приводят к ее пространственно-неоднородному распространению и развитию выбросов. Получаемые при этом ветвящиеся структуры сходны с фракталами - объектами с расползающейся, разреженной структурой, повторяющий свою форму на разных пространственных масштабах (Sander L. 1986). Первая простая модель механизма фрактального роста -модель агрегации с ограниченной диффузией (Witten Т. & Sanders L. 1981; Ben-Jacob Е. 1994) - постулировала развитие бактериальной популяции путем формирования новых кластеров за счет «налипания» бактерий на уже существующие кластеры. Однако такой постулат является нефизиологичным, так как рост популяции происходит за счет деления уже находящихся в ней клеток.
Недавние работы (Kawasaki К. 1997; Mimura М. 2000) исследовали математическую модель популяции бактерий, распространяющейся и формирующей фракталоподобиые структуры за счет эффектов нелинейной диффузии, когда самоподдерживающиеся возмущения регулярного фронта возникают в результате нелинейной зависимости коэффициента диффузии бактерий от концентраций самих бактерии и питательного субстрата. Эта модель, однако, была построена без учета хемотаксиса (Adler J. 1966). Между тем, способность особей не только блуждать случайным образом («диффундировать»),
но и перемещаться по градиенту предпочтительных условий окружающей среды (для бактерий это градиент питательного субстрата) является одним из фундаментальным свойств многих популяционных сообществ. Таким образом, возникает естественный вопрос \ о взаимодействии хемотаксиса с нелинейно-диффузионной неустойчивостью,! ответственной за разрушение популяционного
фронта, а также вопрос об общих механизмах развития фракталоподобных
!
структур в системах с хемотаксисам.
Исследования быстро размножающихся и образующих . видимые
t невооруженным глазом -, пространственные структуры микробиологических
і сообществ показали, что они являются удобной моделью, использование которой
позволяет за сравнительно короткий отрезок времени приблизиться к решению
задач, касающихся как социального поведения отдельных особей или целых
сообществ, так и механизмов волновых взаимодействий в нелинейных
физических, химических и биологических процессах.
ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью диссертационной работы
является экспериментальное и теоретическое исследование влияния нарушения
устойчивого распространения бактериальных волн на процессы
структурообразования в бактериальных популяциях.
Основные задачи исследования:
I. Исследование динамики нестационарного распространения
концентрических бактериальных популяционных волн.
-і
2. Изучение относительного вклада диффузии и таксиса в процессах формирования нестабильности при фракталоподобном развитии бактериальных популяций.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА.
1... Разработана реакционно-диффузионная модель формирования стационарных концентрических фронтов, в которой предложен новый механизм структурообразования в растущих колониях бактерий. Механизм основан на предположении о существовании: двух морфологических состояний —
вегетативно-подвижного и анабиотически-неподвижного, а также возможности перехода из одного состояния в другое при накоплении медиатора, секретируемого самими бактериями.
2. Проведены микроскопические исследования. различных режимов динамики роста бактериальной колонии от круглого хемотаксисного фронта до фракталоподобных структур. Предложен механизм фракталообразования в бактериальных популяциях в зависимости от соотношения скорости нарастания плотности популяции на фронте и скорости распространения самого фронта.
3,Разработана реакционно-диффузионная модель формирования фраклалоподобных структур с нелинейным коэффициентом бактериальной диффузии, зависящим от концентрации бактерий и потребляемого ими субстрата.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ. Результаты диссертационной работы могут быть использованы для разработки подходов как для исследования
популяционной динамики в экологии, так и для изучения базовых механизмов структурообразования в сложных нелинейных системах. Информация о условиях роста, межклеточной коммуникации и кооперативного поведения сообществ микроорганизмов, полученная в настоящих исследованиях, неоценима при подборе параметров для биореакторов, во время биосинтеза лекарственных препаратов и других, используемых в практике веществ, при утилизации экологически вредных отходов, включая нефтяные пленки, а так же может использоваться для нарушения структуры бактериального сообщества, например во время протекания воспалительных процессов (Ben-Jacob Е. 2002; Fenchel Т. 2002). Кроме того, системы такого рода, как описанные в настоящей работе, могут использоваться как модели для изучения процессов роста и развития злокачественных опухолей (Painter К. 2003).
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты работы представлялись на семинарах Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Международном симпозиуме «Биологическая подвижность: Новые направления в исследовании» (Пущино, 2001), конференциях «От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям» (Пущино, 2002, 2003), 2-ом (Москва, 1999) и 3-ем (Воронеж, 2004) Съездах Биофизиков России.
ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертационной работы опубликовано 14 печатных работ.
*
Механизм взаимодействия кольцевых популяционных волн
В работах А.Медвинского и М.Цыганова было показано, что одновременный посев бактерий в несколько точек одной чашки Петри демонстрирует возможность взаимного влияния сближающихся популяционных фронтов, в зависимости от условий роста которых, образуются разные режимы взаимодействия: столкновительный, бесстолкновительный и режим проникновения (А. Медвинский 1991а,б;1993; М. Цыганов 1993). Реализация того или иного режима определяется скоростями расширения колец хемотаксиса. Столкновения воли не происходит, когда их средняя скорость не превышает значения 4.5 мм/ч. При скоростях от 4.5 до 9 мм/ч возникает режим столкновения, а при дальнейшем увеличении скорости наблюдается необычное для автоволн поведение, а именно: волны подобно солитонам проходят друг сквозь друга без деформаций и временных задержек (рис. 8). Скорости перемещения колец хемотаксиса регулировались понижением концентрацию агара, а, следовательно, и вязкости агаризованной питательной среды. Механизмом, обеспечивающим возникновение бесстолкновительных структур, является дефицит аттрактанта в узких демаркационных зонах, разделяющих отдельные популяции, перед медленно движущимися фронтами. Позади «быстрых» волн остается некоторое количество неметаболизированного бактериями субстрата, достаточное для возникновения его градиента в характеризующейся повышенной плотностью бактериальных клеток области фронтального столкновения таких волн. В результате распространение каждой из волн будет продолжаться до того момента, когда концентрация субстрата перед ними упадет практически до нуля в результате потребления субстрата теми бактериями, которые отстали и не вошли в состав колец хемотаксиса.
Клетки Escherichia coli (Budrene ЕЛ 991) или близкородственного вида Salmonella typhimurium (Woodward D.1995), высеянные на слабоагаризсванную среду могут формировать диссипативные структуры, принципиально отличные от волновых, Будрене и Бергом были найдены условия, при которых после точечной инокуляции, образовывались стационарные структуры, имеющие характерный вид пятен или зерен повышенной плотности локальных скоплений бактериальных клеток по периметру чашки, обладающие центральной симметрией (рис. 9). Механизмом, обуславливающим появление подобных структур, является агрегация клеток в ответ на химический сигнал, выделяемый самими клетками. Для подобного рода экспериментов использовались бактерии E.coli, штам НСВ317,. генетически модифицированный с целью повышения чувствительности к аспартату, и понижения чувствительности к серину. В качестве субстрата (источника углерода) і использовались сукцинат или фумарат. Выбор именно этих веществ обусловлен необходимостью присутствия их; как интермедиаторов в цикле трикарбоновых кислот. В результате метаболитических реакций, клетки экскретировали аспартат или его аналоги, повышение локальной концентрации которого вызывало хемотаксисный ответ. Скорость выделения атрактанта-аспартата увеличивалась с ростом концентрации сукцината. В то же время, скорость распространения хемотаксисного кольца уменьшалась с ростом концентрации источника углерода (Budrene Е. 1991, 1995). В тех же условия была получена и кольцевая популяциопная волна, но механизм ее формирования отличается от Адлерова. Кольцевая структура появляется в результате хемотаксисного ответа на выделяемый клетками аспартат, так же как зерноподобные структуры. Популяционные структуры, которые могут быть отнесены к классу фрактальных, представляют собой: другой тип кооперативного хемотаксического ответа бактерий на индуцированное ими изменение среды обитания и сходны с процессами неравновесного роста в неживых системах. »v t Понятие фрактальной геометрии было введено в употребление Бенуа Б. Мандельбротом (Mandelbrot В. 977).
Теорией, предложенной Мандельбротом,: можно описать достаточно широкий круг явлений, таких, как например, рост і колоний клеток, структурообразовйние коллоидных суспензий, узоры на стеклах в сильный мороз, электрические разряды, напоминающие молнию, даже хаотичная і форма облаков и береговой линии может также являться фрактальной. Впервые фракталоподобные структуры возникающие при росте популяции з бактерий были описаны Фуджикавбй и Матсушитой для Bacillus subtilis (Fujikawa Н. 1989). Основываясь на работе последних, Бен-Якоб с соавторами на примере многочисленных экспериментов і показали многообразие возникаемых в ходе развития бактериальной колонии структур и систематизировали их (Ben-Jacob Е. 1993-2003; Cohen I. 1999, 2000; Golding I. 1998; Kozlovsky Y. 1999). Среди структур, полученных при развитии сообществ микроорганизмов, были выделены четыре типа (рис. 10): - собственно фракталы (DLA-structures); - плотноветвящиеся образования (DBM-structures); - дендриты (dendrits); - компактный рост (compact growth); Компактность структур зависела от концентрации питательной среды: чем беднее среда, тем более разветвлена структура. Было показано, что изолированная бактерия Bacillus subttilis растет более длинной и реже репродуцируется в условиях бедного питания. Кроме того, Бен-Якобоб с соавторами было показано возможность существования популяционных структур другого вида на морфотипах выделенных из культуры бактерий Bacillius subtilis\ и определенных как род Paenibacillus (Ben-Jacob Е 1995аД 1997а, б, 1998 а,б, 20006, 2002, 2003; Cohen 1.2000).
По определению Бен-Якоба, под морфотипом понимается совокупность микроорганизмов, обладающих схожими морфологическими признаками и образующими при росте колоний на полужидкой среде структуры определенного типа. Таких морфотипов и, следовательно, популяционных структур выделено на сегодняшний день четыре (рис. П): Т - морфотип P. dendritiformis (от tip-splitting growth) образует на агаризованной питательной среде типичные фрактальные структуры, у которых кончик растущей ветки фрактала разделяется на несколько ответвлений. С — морфотип P. dendritiformis (от chiral growth) характеризуется так называемым хиральным ростом, при котором веточки растущей популяции закручены в одну и ту же сторону. Новые веточки образуются, как боковые выросты уже существующих. V - морфотип P. vortex (от vortex growth) образует вихревые структуры, которые характеризуются наличием нескольких ведущих центров. Каждые такой центр состоит из миллиона клеток, вращающихся вокруг определенного центра. N - морфотип P. alvei, образует, так называемые, туманные структуры (от nebula growth). Микроструктура этого типа растущей популяции составляет объект текущего изучения группы Бен-Якоба. Помимо этого было показано изменение картины популяционного роста при воздействии на микроорганизмы специфического антибиотика септрина. Было продемонстрировано, что действие не летальных концентраций антибиотика порядка 0.0003% усиливает ветвление растущих фракталообразных структур. Действие септрина индуцирует эффект голодания у бактерий, при котором они перестают делиться и увеличиваются в размерах в несколько раз. По предположению Бен-Якоба изменение, наблюдаемое в структурообразовании популяции, является кооперативным ответом бактериального сообщества, помогающее ему справиться со стрессом, вызванным антибиотиком (Ben-Jacob Е. 2000а.б, 2002.2003).
Спиральные структуры
В работах Ватанабе К. (Watanabe К. 2002) с соавторами была продемонстрирована возможность получения кольцевых и спиральных популяционных структур на бактериях Proteus mirabilis, напоминающие те, что возникают в химической реакции; Белоусова-Жаботинского (Zhabotinsky А. 1995) (рис.12 б). Такого рода пространственные структуры имеют механизм і возникновения, отличающийся от других популяционных структур в силу специфичности бактерий. і ! Proteus mirabilis - палочковидная бактерия с разбросанными по поверхности і жгутиками, служащими для поступательного движения. Клетки могут находиться в і двух состояниях: 1) Вегетативные клетки около 2:мкм длины и имеющие 6-10 флагел, 2) Гиперфлагелярные швермеры до 80 мкм длины и имеющие 103 - 104 флагел. Эти два состояния клеток переходят одно в другое только при инкубации клеток на твердой поверхности питательного субстрата и не наблюдаются в жидкой культуре. Роение швермеров начинается при увеличении плотности среди и, как было показано, не связанно с потреблением питания. Роение на границе фронта начинается при достижении определенного порога плотности клеток, задолго до истощения питания, даже при низких концентрациях последнего. Авторами предполагается, что роение, служит стратегией для максимального увеличения продукции биомассы. Скорость и продолжительность роения зависят от концентрации агара. Бактерии движутся над поверхностью агара в тонком слое жидкости, который создают сами. Жидкость получается путем экстракции воды из агара, при обработке его кислым капсулярным полисахаридом, выделяющимся при роении клеток.
В определенных условиях через 5 часов после инокуляции колония начинает расти монослоем вегетативных клеток и распространяется по всей чашке Петри. Через 8-9 часов после иннокуляции на поверхности агара возникают несколько темных и светлых областей, которые затем распространяются по всей поверхности. При этом в течение 3 часов; наблюдается пространственно-временная структура из перемещающихся фронтов или вращающихся спиралей, которая затем исчезает. Бактерии, участвующие в образовании таких структур, представляют собой швермеры. При этом авторами наблюдались следующие закономерности: - Наблюдаемая пространственно-временная картина зависит от позиции наблюдения и меняется при смене точки обозревания, - Светлые и темные области структур не являются флуктуациями плотности бактерий.. ] г - Микроскопические наблюдения показывают, что существуют, по крайней мере, два наложенных один на другой уровня бактерий, в каждом из которых клетки движутся независимо друг от друга. - Развитие структуры характеризуется скоростью движения границы между светлыми и темными областями, которая приблизительно равна 100 мкм/сек. При этом скорость движения индивидуальных клеток всегда меньше, от 10 до 80 мкм/сек в зависимости от состояния клеток. - Закручивание спирали может происходить как во внутрь, так и во вне, но всегда против часовой стрелки. Все перечисленное, кроме последнего, позволяет авторам предположить, что механизмом возникновения подобных структур может быть так называемый эффект «муаре», при котором сдвиг идентичных, чаще симметричных картинок, наложенных одна поверх другой, приводит к видимому изменению картинки, рисунок которой зависит от точки наблюдения. Целый ряд явлений в природе происходит с некоторой периодичностью. Например, смена дня и ночи, или скена времен года, приливы и отливы, циркадные і ритмы, сокращение и релаксация мышц, биение сердца, дыхание, популяционные І процессы - временное соотношения хищника и жертвы или периодические вспышки і численности какого-то вида и міюгое другое.
Периодические процессы можно наблюдать и в экспериментах с химическими веществами. Например, периодическое изменение цвета раствора в реакции Белоусова-Жаботинского или образование концентрических колец Лизеганга в желеобразных растворах высокомолекулярных веществ (рис, 13), В реакции Белоусова-Жаботинского (Zhabotinsky А. 1995) в термостатированной колбе исследуется окислительно-восстановительная реакция Се3+ - Се 4+ в растворе серной кислоты H2SO4, малоновой кислоты СН(СООН)2, сульфата церия Сег(804)з и бромата калия КВгОз. При добавлении в раствор индикатора окислительно-восстановительной реакции (ферроина) можно следить за ходом реакции по изменению цвета или, более точно, по спектральному поглощению. При достаточно высокой концентрации веществ, участвующих в реакции, наблюдается периодическое изменение цвета раствора от красного (при избытке Се4+) до синего (при избытке Се3+). Р. Лизегангом в конце 19 века были обнаружены интересные особенности желатиновых гелей при диффузии в них низкомолекулярпых веществ (Liesegang R. 1896). Если в гель, содержащий какое-нибудь низкомолекулярное вещество, диффундирует другое вещество, способное с первым веществом образовывать нерастворимое соединение, то в этом случае реакция осаждения часто идет только в определенных зонах системы, чередующихся с зонами, в которых осадка не образуется вовсе. В результате получаются слои, если диффузия идет вглубь геля, или кольца, если диффузия начинается в центре поверхности геля и продолжается параллельно последней. Роль высокомолекулярного вещества, из которого состоит сам гель, при образовании таких «ритмических осадков», очевидно, сводится к предупреждению образования в системе конвективных потоков. В недавних работах В. Кравченко с соавторами (Кравченко В. 2000) было показано образование колец Лизеганга из нерастворимых комплексов фолиевой кислоты, образующихся во время роста колонии почвенных простейших Dictyostelium discoideum. Образование ярко-желтых концентрических окружностей обуславливалось перераспределением фолиевой кислоты при уменьшении рН среды, индуцированном жизнедеятельностью амеб, растущих на бактериальном газоне (рис. 14).
Экспериментальные исследования формирования стационарных концентрических колец в процессе роста колонии подвижных бактерий Е. coli
Периодические процессы весьма распространены в динамике развития и взаимодействия популяций. В начаіле 20 века исследователи обратили внимание на экспериментальное и теоретическое моделирование разнообразных популяционных режимов после опубликования работ А. Лотки (Lotka A.J. 1910) и В. Вольттера (Volterra V. 1928) о периодических колебательных режимах в системе хищник-жертва. Позднее эти работы были экспериментально подтверждены Г. Гаузе на культуре простейших Paramesium (Gause G. 1934, 1936). В работах Дж. Адлера (Adler J. 1967) была показана возможность получения популяционных волн на культуре! подвижных бактерий Е. coll В экспериментах Адлера на многокомпонентной питательной среде возникали круглые фронты повышенной плотности бактерий, которые распространялись из точки инокуляции в центре чашки Петри к ее краю, причем каждый из получаемых фронтов возникал из точки инокуляции. Однако, в некоторых условиях можно получить другой режим распространения популяционных фронтов, при котором точка инокуляции инициирует появление только первого фронта, а каждый следующий возникает на границе предыдущего. В результате, получается периодическая структура, напоминающая мишень. В работах К. Ватанабе и М. Матсушиты, а так же О. Раупричи и Дж.
Шапиро и других исследователей было показано образование таких стационарных концентрических фронтов во время роста колонии Proteus mirahilis (Rauprich О. 1996; Allison С. Г991; Malsuyama Т. 2000; Watanabe К. 002). Как было описано выше, P. mirabilis палочковидная бактерия, с разбросанными по поверхности жгутиками, служащими для поступательного движения. Клетки этих і бактерий могут находиться в дву# состояниях: вегетативные клетки около 2 мкм длиной, имеющие 6-10 флагелл и гиперфлагелляриые швермеры до 80мкм длиной,, имеющие 103 - 104 флагелл. Эти два состояния клеток переходят одно в другое только при инкубации клеток на твердой поверхности питательного субстрата 1 и не наблюдаются в жидкой культуре. Роящиеся швермеры образуют подвижный фронт, который через некоторое время останавливается, и клетки переходят в вегетативное состояние, а через некоторое время процесс повторяется вновь. Роение швермеров начинается при увеличении плотности популяции бактерий и, как было показано, не связано с потреблением питания. Роение на границе фронта начинается при достижении определенного порога плотности клеток; задолго до истощения питания, даже при низких концентрациях последнего. Скорость и продолжительность роения зависят от концентрации агара. Бактерии движутся в тонком слое жидкости над поверхностью агара, который создают сами. При увеличении концентрации агара способность бактерий выделять воду падает. При этом уменьшается конечный диаметр колонии. В тоже время, концентрация агара не влияет на количество образованных фронтов. Авторами предполагается, что роение служит стратегией для максимального увеличения продукции биомассы (рис. 15а).
В работе Дж. Вакиты и других (Wakita J. 2001; Shimada Н. 2004) была продемонстрирована возможность получения концентрических фронтов на бактериях Bacillus subtilis. Отличительной особенностью этих бактерий является способность образовывать споры в неблагоприятных условиях, к которым можно отнести и недостаток питания. Авторами было показано, что многокольцевые структуры могут образо вы иаться только подвижными бактериями, а не за счет деления и бактериальной диффузии. Использование мутантного штамма, неспособного к движению, не приводило к появлению концентрических фронтов, тогда как другие типы популяционных структур, например некоторые из фракталоподобных структур, продолжали образовываться в процессе роста колонии (рис. 15 6). Нами получены стационарные концентрические структуры на бактериях Escherichia coli. Бактерии Е. coli в отличие от Proteus mirabilis не образуют швермеров и не переходят в состояние спор при ухудшении условий культивирования, как бактерии Bacillus subtilis. Поэтому, механизмы формирования пространственно-временных структур могут отличаться от тех, что были продемонстрированы в выше описанных работах. Мы проводили наши эксперименты следующим образом. Бактерии E.coli, штамм К12 высеивались с помощью инокуляционной петли на сильно агаризованные чашки Петри, содержащие 1.5% пептона и 2% агара, из агарового стока. Чашки инкубировались при температуре 37С 12-16 часов с целью образования единичных колоний. После этого, бактериальные клетки «старились» в течении 10-14 дней при температуре 4С. Затем, бактерии точечно инокулировались в центр чашки Петри, содержащей слабо агаризованую питательную среду, и культивировались при температуре 37С в течение 30-36 часов. При таких условиях, колонии образовывали несколько концентрических популяционных колец, схожих с кольцами Адлера на многокомпонентной среде. Но, в отличие от колец Адлера, распространение каждого отдельного кольца не начиналось из центра инокуляции. В динамике таких колец необходимо выделить три основных этапа: 1) Формирование. Из центра инокуляции формируется таксисное кольцо, которое распространяется аналогично кольцу Адлера. Формирование первого кольца начинается через 10-12 часов, после инокулирования {рис. 17 д, е). 2) Распространение. Кольцо распространяется со скоростью около 1 мм/ч, В отличие от Адлеровских хемотаксисных колец, на скорость распространения фронта практически не влияют концентрация питательной среды и ее плотность (рис. 17 а, б). 3) Остановка.
По достижении определенного радиуса, зависящего- от концентрации агара, бактериальная волна останавливается, образуя стационарное кольцо (рис. 17 в, г) j Через некоторый промежуток времени, обычно от 2 до 4 часов, из этого і кольца вновь формируется популрционная волна с более низкой концентрацией бактерий. По мере распространения этой волны бактериальная плотность ее фронта увеличивается за счет деления бактерий. Далее вновь следует процесс остановки, формирования и распространения волны и т.д. (рис. 17) При образовании такого рода популяционных структур нами были выявлены следующие закономерности. - Стационарные концентрические кольца образовывались в достаточно широком диапазоне концентраций агара и пептона - 1-2% пептона и 0.28-3.2% агара. При более высоких концентрациях агара и низких концентрациях пептона происходило «набухание» колонии, свидетельствующее о размножении бактерий в центре инокуляции, но хемотаксисный фронт не образовывался. При более низких концентрациях агара формировался равномерный бактериальный газон (рис. 16). - Скорость фронта во время фазы распространения равнялась около 1 мм/ч. Следует отметить, что в подобных условиях культивирования, описанных выше, на предварительно «разогнанной» культуре бактерий можно получить скорость распространения фронта от 4 до 10 мм/ч, что соответствует обычному режиму роста колец Адлера. Под «разогнанной» бактериальной культурой подразумевается выращивание бактерий на полужидкой агаризованной среде или в жидкой культуре, с целью получения физиологически активной фракции бактерий. Поэтому, мы предполагаем, что получение режима стационарных колец возможно только при «старении» культуры, в условиях приведенных нами раннее, - Количество колец, полученных в конечном итоге после прекращения роста колонии, варьировало от 4 до 8J При этом количество колец не зависело от і концентрации питательного субстрата, а зависело только от концентрации агара, т.е. от плотности среды. Концентрация пептона оказывала влияние на очерченность и визуальную плотность фронтов, которые были выше при более высоких концентрациях питания. Кроме того, с увеличением концентрации пептона уменьшалось время і неподвижного состояния кольца. Можно предположить, что это связано с увеличением скорости нарастания бактериальной плотности на фронте, напрямую зависящей от концентрации пептона. В работе Е, Будрене с соавторами описывались случаи получения визуально хорошо различимых концентрических стационарных колец через некоторое время после формирования равномерного бактериального газона клетками Exoli (Budrene Е. 1988).
Математическая модель возникновения неустойчивости фронта, распространяющейся популяции хемотаксисных бактерий
Распространение нелинейных волн в возбудимых средах с диффузией играет фундаментальную роль в функционировании многих биологических систем, в том числе популяционных (Holden А, 1991; Иванищшй Г.Р. 1994, 1999). Естественной формой волны возбуждения является регулярный кольцевой или плоский фронт -вследствие наличия диффузии, нерегулярные возмущения фронтов со временем обычно выпрямляются (Kuramoto Y. 1984; Lebiedz D. 2003), Однако, при некоторых условиях (например, при определенных различиях в скорости диффузии активных компонентов среды), на фронте бегущей волны могут развиваться неустойчивости, ведущие к ее разрушению и образованию пространственно-неоднородных структур. Подобная трансформация волновых фронтов наблюдается, в частности, в экспериментах с популяциями подвижных бактерий (Fujikawa Н. 1989; Ben-Jacob Е. 1994; Крестьева И. 1996; Tsyganov М. 1999) - в зависимости от условий роста локально инокулированной колонии бактерий на слабоагаризованной питательной среде популяционная волна может распространяться как регулярным кольцевым фронтом (рис. 23 а), так и в форме системы ветвящихся выбросов (рис. 23 б, 24). Механизмом образования таких необычных фракталоподобных структур может являться неустойчивость, связанная с наличием нелинейной диффузии в бактериальной возбудимой среде.
При условии зависимости коэффициента диффузии бактерий от концентраций самих бактерии и питательного субстрата, шумовые возмущения на фронте популяционной волны могут приводить к ее пространственно-неоднородному распространению и развитию выбросов (Kawasaki К. 1997, MimuraM. 2000). В 1981 году Т. Уиттеном III и Л. Сандером была предложена простая модель механизма фрактального роста - агрегации с ограниченной диффузией (Witten Т. 1981). При этом агрегация определялась как процесс, при котором каждая частица входит в контакт с растущим объектом (кластером) при первом же соприкосновении, а весь процесс в целом начинается с гладкого центра, на который агрегируют диффундирующие частицы. Однако очевидно, что развитие бактериального сообщества не может происходить путем формирования новых кластеров за счет «налипания» бактерий на уже существующие кластеры, т.к. рост структуры происходит за счет деления клеток, находящихся в пределах уже существующей структуры. Однако такой механизм фракталообразования был принят за основу при моделировании структур, получаемых при росте популяций микроорганизмов Bacillus subtilis на слабоагаризованной среде Бен-Якобом и соавторами (Ben-Jacob Е, 1994). Математическая модель бала комбинацией дифференциального уравнения и «клеточного автомата». В модели учитывалась - диффузия питательных веществ, движение бактерий, их репродукция и споруляция; локальная коммуникация. Диффузия питательных веществ управляется путем решения уравнения диффузии для концентрации питательных веществ С. Вся колония бактерий делилась на некоторое количество фракций, каждая из которых представлялась в виде блуждающей частицы (walker). Частица описывается местоположением rt и внешней степенью свободы Еь определяющей ее активность. Когда для данного интервала времени пищи недостаточно, что вызывает понижение , до 0, частица становится стационарной (споруляция). Когда еды достаточно, Е, возрастает, и когда она достигает некоторого порога, частица делится на две (репродукция).
Частицы движутся внутри ячейки сетки, на которой считается уравнение диффузии для концентрации питательных веществ С. При каждом соударении частицы со стенкой счетчик сегмента решетки увеличивается на 1. После того, как счетчик достигает некоторого значения Nc, решетка становится проницаемой и еще одна ее ячейка присоединяется к колонии. В первом приближении уровень Nc представляет концентрацию агара, так как для продвижения частиц вперед по более твердому субстрату требуется больше столкновений. На дискретном временном отрезке dt каждая активная частица перемещается на расстояние d в направлении, определяемом случайным углом Q из интервала [О, 2л]. Т.о. новое местоположение частицы г, записывается следующим образом: г/ = rf + d(cosQ,sinQ) (1Л) Метаболическое состояние і-той частицы представляется, как скорость изменения энергии Ej и определяется по формуле: где к - фактор превращения субстрата в интегральную энергию, Ет - общая энергия, равная потери энергии на все процессы во время репродукции TRP. CCOnS- функция, характеризующая скорость потребления субстрата в зависимости от его концентрации. Концентрация субстрата: ILoyN-dSU (1.3) где о - плотность частиц, В результате компьютерных экспериментов, проведенных на этой модели, были получены структуры, сходные с одним из пяти типов, полученных Бен-Якобом в натурных экспериментах. Образования были более компактны для высокого уровня пептона и более разветвлены для низкого. В недавних работах Кавасаки и Мимуры (Kawasaki К. 1997; Mimura М. 2000) была рассмотрена модель, построенная на системе дифференциальных уравнений, в которой рост популяции бактерий Bacillus subtilis осуществлялся за счет деления клеток, зависящего от концентрации питания и клеточной диффузии. Кроме того, на основании экспериментальных данных авторами постулировалось, что морфология получаемых пространственных структур зависит от подвижности бактерий, которые образуют споры в неблагоприятных условиях среды.
Поэтому, в модели авторами предполагалось, что клетки, в зависимости от внешних параметров, могут находиться как в активном, так и не в активном состоянии. При низких концентрациях питательного субстрата и клеточной плотности на границе популяционного фронта клетки становятся неактивными, а при возрастании этих параметров снова переходят в активное состояние. an/a=D„v2n-f(n,b) (2.1) д Ш - V (Db V b) + 6f (n, b) (2.2) Где b(x,y,t) - плотность бактерий, n(x,y,t) - концентрация питательного субстрата, Оь и Dn - коэффициенты ди фузии бактерий и субстрата соответственно. При этом предпологается, что Dn = const, и D& = onb - меняется в зависимости от клеточной плотности и концентрации питания. При п — 0 или b — 0, Db так же стремится к 0 и бактерии переходят в неактивное состояние. о = а0(1+Д) (2.3) Где коэффициент 0о зависит от плотности агара и увеличивается с уменьшением последней, а Д - определяет стохастический шум при случайном перемещении бактерий. Функция f(n, Ь) определяется уравнением Михаэлиса-Ментена и описывает скорость потребления клетками питательного субстрата: f(n,b) = knb/(I+7n) (2.4) тогда как 0f (п, Ь), соответствует скорости роста бактериальной плотности, коэффициент 6 определяется как обратное соотношение скорости потребления питательного субстрата к росту клеточной плотности. В результате численного моделирования иа модели (2), авторами были получены плотно ветвящиеся образования и фракталоподоюные структуры.
