Исследование аэробных бактерий, разлагающих полихлорированные бифенилы и хлорбензойные кислоты Рыбкина Дарья Олеговна

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы 14

1.1. Микроорганизмы и их сообщества, осуществляющие деградацию полихлорированных бифенилов и хлор бензойных кислот 17

1.1.1. Микроорганизмы-деструкторы полихлорированных бифенилов 17

1.1.2. Сообщества микроорганизмов, утилизирующие полихлорированные бифенилы 21

1.1.3. Микроорганизмы-деструкторы хлорбензойных кислот 24

1.2. Метаболические пути деструкции полихлорбифенилов и хлорбензоатов 26

1.2.1. Биохимический путь трансформации полихлорированных бифенилов 27

1.2.2. Субстратная специфичность ферментов деструкции полихлорбифенилов 30

1.2.3. Метаболические пути разложения ряда орто- и пара- замещенных хлорбифенилов 35

1.2.4. Метаболический путь деструкции пентадиеновой кислоты, продукта разложения полихлорированных бифенилов 36

1.2.5. Метаболические пути разложения хлорбензойных кислот 37

1.2.5.1. Реакции ферментативного дегалогенирования хлорбензойных кислот 38

1.2.5.2. Энзиматические реакции 0/?торасщепления или 3-оксоадипативный путь 41

1.2.5.3. Модифицированный ортопуть 43

1.3. Генетические системы биодеградации хлорпроизводных бифенила и бензойной кислоты у бактерий 44

1.3.1. Организация генетических систем деструкции полихлорбифенилов 44

1.3.2. Генетические системы утилизации хлорбензоатов 50

ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 54

2.1. Бактериальные штаммы 54

2.2. Среды и условия культивирования 54

2.3. Накопительные культуры 55

2.4. Определение ростовых характеристик 55

2.5. Определение субстратной специфичности 56

2.6. Определение таксономического положения микроорганизмов 56

2.6.1. Морфологические методы 56

2.6.2. Определение физиолого-биохимических характеристик 57

2.6.3. Методы анализа хемотаксономических признаков 59

2.7. Генетические методы 61

2.7.1. Выделение плазмидной ДНК 61

2.7.2. Электрофорез и определение размера плазмидной ДНК 63

2.7.3. Элиминация бактериальных плазмид 63

2.7.4. Определение стабильности признаков биодеградации 64

2.8. Методы анализа деструкции хлорированных бифенилов и

хлорбензойных кислот штаммами микроорганизмов 64

2.8.1. Идентификация продуктов деградации хлорбифенилов 64

2.8.2. Анализ метаболитов 4-хлорбензойной кислоты 65

2.8.3. Определение концентрации ионов хлора 66

2.9. Статистическая обработка данных 66

ГЛАВА 3. Результаты исследований 67

3.1. Выделение и идентификация микроорганизмов-деструкторов хлорзамещенных бензойных кислот 67

3.2. Выделение и идентификация штаммов-деструкторов бифенила 68

3.3. Характеристика бактерий-деструкторов хлорбензойных кислот 72

3.3.1. Анализ субстратной специфичности штаммов-деструкторов хлорбензоатов 72

3.3.2. Характеристика продуктов разложения 4-хлорбензоата у выделенных штаммов рода Arthrobacter 75

3.3.3. Ростовые характеристики выделенных бактерий-деструкторов хлорбензоатов 76

3.3.4. Обнаружение плазмидной ДНК в штаммах-деструкторах 4-хлорбензойной кислоты 79

3.4. Характеристика деградативных способностей микроорганизмов-деструкторов полихлорбифенилов 82

3.4.1. Разложение 2,4-дихлорбифенила выделенными бактериями 82

3.4.2. Биодеградация трихлорированных бифенилов 87

3.5. Характеристика штамма-деструктора полихлорбифенилов Rhodococcus яр. Р25 90

3.5.1. Разложение орто- и иогря-монохлорированных бифенилов 90

3.5.2. Деструкция дехлорированных бифенилов 91

3.5.3. Рост штамма Rhodococcus sp. Р25 на бифениле и его хлорированных производных 93

3.5.4. Трансформация и использование как ростового субстрата хлорированных бензойных кислот 95

3.5.5. Субстратная специфичность штамма Rhodococcus sp. Р25 97

3.5.6. Роль плазмид в обеспечении деградативных свойств штамма -Rhodococcus sp. Р25 99

3.6. Деструкция ряда моно- и дизамещенных хлорбифенилов штаммом Microbacterium sp. В51 103

3.7. Утилизация 2,4-дихлорбифенила искусственной ассоциацией бактериальных культур 105

ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 109

4.1. Многообразие бактерий-деструкторов полихлорированных бифенилов и хлорбензойных кислот 109

4.2. Особенности трансформации хлорбифенилов выделенными бактериями 110

4.3. Деструкция орто- и ляря-замещенных хлорбифенилов штаммом Microbacterium sp. В51 117

4.4. Штамм Rhodococcus sp. Р25 - уникальный деструктор полихлорированных бифенилов 119

4.5. Искусственная ассоциация бактерий, осуществляющая полное разложение 2,4'-дихлорбифенила 127

Выводы 129

Список литературы 130

Приложения 166

• Микроорганизмы-деструкторы полихлорированных бифенилов
• Организация генетических систем деструкции полихлорбифенилов
• Выделение и идентификация штаммов-деструкторов бифенила
• Особенности трансформации хлорбифенилов выделенными бактериями

Введение к работе

Актуальность проблемы. Полихлорированные бифенилы (ПХБ) принадлежат к числу наиболее распространенных и экологически значимых загрязнителей биосферы. Уникальные химические и физические свойства (отличные диэлектрические характеристики, негорючесть, устойчивость к повышенным температурам, действию кислот и щелочей) полихлорбифенилов обусловливают их широкое применение в промышленности. Следует отметить, что полихлорированные бифенилы слабо подвергаются абиотическому разложению и прочно адсорбируются осадочными материалами. Аккумуляция их в организме животных и человека приводит к развитию онкологических и других заболеваний. Основная роль в разложении полихлорбифенилов в окружающей среде принадлежит микроорганизмам, однако, большинство из них трансформируют данные соединения до хлорбензойных кислот (ХБК). Последние широко используются при производстве гербицидов, пластмасс, растворителей и принадлежат к группе токсичных и химически стабильных соединений. Деструкция хлорбензоатов в природе осуществляется микроорганизмами, как правило, не способными разлагать полихлорбифенилы.

В связи с этим, проблема биодеградации полихлорированных бифенилов и хлорбензойных кислот в окружающей среде является актуальной. Детальное изучение процессов микробной трансформации данных соединений позволяет оценить возможность использования при биоремедиации почв и донных отложений микроорганизмов и их сообществ. Исследование биохимических, физиологических и генетических особенностей биодеструкторов полихлорбифенилов и хлорбензоатов перспективно для создания эффективных препаратов биологической очистки окружающей среды.

Состояние вопроса. К настоящему времени имеются сведения о разнообразии бактерий, осуществляющих полную или частичную трансформацию полихлорбифенилов и хлорбензойных кислот [65, 79, 113, 285]. Описанные в литературе микроорганизмы-деструкторы ПХБ и ХБК принадлежат к различным таксономическим и экологическим группам. Способность к полному или частичному разложению данных соединений наиболее широко распространена среди представителей родов Acinetobacter, Alcaligenes, Arthrobacter, Burkholderia, Cellulomonas, Corynebacterium, Nocardia, Pseudomonas и Rhodococcus [4, 13, 40, 58, 111, 112, 133, 144, 175,212, 285, 303]. Известно, что бактерии осуществляют катаболизм ПХБ в четыре этапа, через стадии образования диольных производных и продукта мета-расщепления, до образования хлорбензойной и пентадиеновых кислот [53, 65, 119, 122, 285]. Однако описанные в литературе штаммы-деструкторы ПХБ значительно отличаются спектром деградируемых ими полихлорбифенилов [65, 196, 235, 254, 285]. Ключевую роль в определении субстратной специфичности бактериальных штаммов играет бифенил диоксигеназа, осуществляющая первоначальное окисление субстрата [62, 101, 155, 199]. Наиболее подробно данный фермент изучен у Burkholderia sp. LB400, способного разлагать широкий спектр полихлорированных бифенилов [172,258, 260]. Предпочтительное окисление изомеров ПХБ зависит от количества и расположения заместителей в молекуле [54]. Активность бифенил диоксигеназы штамма LB400 уменьшается от незамещенного кольца молекулы ПХБ к орто-, а затем - лшяа-замещенным кольцам. /7я/7<7-хлорированные кольца слабо подвергаются окислению, а 4,4'-дихлорбифенил практически не трансформируется данной диоксигеназой [260]. Напротив, бифенил диоксигеназа штамма Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707 проявляет активность к 4,4'-дихлорбифенилу, но окисляет узкий спектр ПХБ [285]. Установлено, что бактерии, предпочтительнее окисляющие орто-замещенные кольца ПХБ, осуществляют эффективную деструкцию широкого спектра полихлорированных бифенилов и являются перспективными для использования в биоремедиации загрязненных почв [48,192, 207].

Известно, что большинство микроорганизмов-деструкторов ПХБ разлагают полихлорбифенилы до хлорбензойных кислот. Описано лишь несколько природных грамотрицательных штаммов, полностью разлагающих монохлорированные бифенилы, и один штамм Burkholderia sp. SK-3, способный полностью утилизировать 2,4'-дихлорбифенил [53, 168, 170, 285].

Катаболизм хлорбензоатов осуществляет другая группа бактерий-деструкторов. Ключевой реакцией в разложении ХБК микроорганизмами является реакция дегалогенирования субстрата [18]. Анализ литературных данных показал, что большинство выделенных штаммов-деструкторов ХБК осуществляют отщепление атома галогена после разрыва ароматического кольца молекулы субстрата, и описано несколько штаммов, осуществляющих дегалогенирование на ранних этапах катаболизма, до расщепления ароматического кольца [9, 32, 43, 113, 138, 163, 236]. Последние представляют наибольший интерес для использования в процессах биоремедиации, так как отщепление галогена от ХБК на первых этапах делает молекулу субстрата доступной для большинства микроорганизмов [18, 43].

К настоящему времени накоплен материал о генетических системах деградации полихлорбифенилов и хлорбензойных кислот. Известно, что гены биодеградации ПХБ (bph-rQHbi) могут иметь как хромосомальную, так и плазмидную локализацию [242, 266, 269, 279]. Наиболее подробно изучена структурная организация bph-гєнов, расположенных в хромосоме, у штаммов Burkholderia sp. LB400, P. pseudoalcaligenes KF707, P. putida KF715 nPseudomonas sp. KKS102 [119, 171, 221, 242, 298]. Плазмидная локализация bph-гепов описана для представителей родов Pseudomonas и Rhodococcus, наиболее подробно данные гены изучены у штамма Rhodococcus sp. RHA1 [118, 242, 266]. Результаты исследований по изучению нуклеотидной последовательности bph-гепов показали, что гены биодеградации бифенила штаммов рода Rhodococcus значительно отличаются от bph-renoB грамотрицательных штаммов-деструкторов ПХБ [49, 199]. Несмотря на то, что биохимическая и генетическая организация р/г-кластера изучена подробно, данных о регуляции экспрессии bph-генов недостаточно [102, 184, 298].

Рядом работ было показано, что гены, контролирующие деградацию хлорбензойных кислот, также могут иметь хромосомальную или плазмидную локализацию [77, 113, 116, 224, 252, 291]. Наиболее подробно изучена организация ХБК-деградирующих генов у штаммов Pseudomonas sp. ВІЗ, P. aeruginosa 142, Ralstonia eutropha JMP134 и Arthrobacter globiformis K3T1 [4, 144, 185, 282-284, 312]. Установлено, что кластер генов деструкции ХБК может быть полностью локализован в плазмиде или хромосоме, либо гены первых этапов деструкции ХБК (этапа дегалогенирования) и гены, ответственные за дальнейшую трансформацию субстрата до соединений основного обмена, могут быть расположены независимо друг от друга и иметь различную локализацию [4, 32, 131, 242, 291]. Широкое распространение и высокая гомология генов деструкции ХБК среди различных групп микроорганизмов обусловлены часто встречающейся возможностью переноса данных генов в составе транспозонов [90, 91, 216,224, 232, 279, 305].

Цель настоящего исследования - поиск и детальное изучение бактерий, способных к эффективной деструкции полихлорированных бифенилов и хлорбензойных кислот.

Основные задачи исследования.

Выделить и идентифицировать бактерии, способные разлагать бифенил и хлорбензойные кислоты.

Осуществить скрининг выделенных бактерий-деструкторов по способности трансформировать орто- и яяря-хлорированные бифенилы, хлорбензойные кислоты и отобрать наиболее активные штаммы.

Изучить особенности процесса разложения полихлорированных бифенилов и хлорбензойных кислот у активных штаммов-деструкторов.

Исследовать локализацию генов биодеградации полихлорбифенилов и хлорбензойных кислот у активных штаммов-деструкторов.

5. Изучить процесс утилизации 2,4'-дихлорбифенила искусственной ассоциацией бактериальных культур.

Научная новизна. Создана коллекция бактерий-деструкторов полихлорированных бифенилов и хлорбензойных кислот, выделенных из образцов почв и донных отложений, загрязненных отходами химических производств (ОАО "Галоген", г. Пермь; ОАО "Уралкалий", г. Березники, Пермская обл.). Установлено, что выделенные штаммы принадлежат различным таксономическим группам и являются представителями родов Pseudomonas, Alcaligenes, Comamonas, Flavobactehum, Flavimonas, Arthrobacter, Cellulomonas, Microbacterium и Rhodococcus. Впервые выделены и охарактеризованы штаммы грамположительных бактерий, осуществляющие полное разложение ряда моно- и дихлорированных бифенилов, а также некоторых хлорбензойных кислот. Установлено, что Microbacterium sp. В51, в отличие от известных штаммов, активно трансформирует ди(яя/7а)хлорбифенил до ла/?я-хлорбензойной кислоты и осуществляет полную утилизацию моио(орто-), ди(о/7/я0-)хлорбифенилов и о/7/ио-хлорбензоата. Штамм Rhodococcus sp. Р25 эффективно растет на орто- и пара-моноХБ и 2,4'-диХБ, а также на моъо(орто- или пара-) и ди(о/?т<>яя/7я-)хлорбензойных кислотах, осуществляя полную утилизацию субстрата. Штамм Rhodococcus sp. Р25 использует в качестве единственного источника углерода и энергии бензол, толуол, фенол, нафталин, бензоат, салицилат, гентизат, орто-фталат, ПОБК и ПКК, но не фенантрен, 1-гидрокси-2-нафтоат и 3-хлорбензоат. Обнаружено, что Rhodococcus sp. Р25 несет три плазмиды молекулярной массой ПО, 90 и 80 тпн, в которых расположены гены биодеградации хлорбензоатов, бифенила и нафталина. Выделены штаммы Arthrobacter sp. Н4 и Н5, осуществляющие дегалогенирование 4-хлорбензойной кислоты до расщепления ароматического кольца и способные к эффективному росту при высоких (3,0 г/л) концентрациях 4ХБК. Разработана ассоциация биодеструкторов, в состав которой включены штаммы грамположительных бактерий Microbacterium sp. B51 и Arthrobacter sp. H5, осуществляющая утилизацию 2,4'-дихлорбифенила более эффективно, чем описанные ранее сообщества грамотрицательных микроорганизмов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Бактериальные штаммы, изолированные из загрязненных галогенированными углеводородами почв и донных отложений, принадлежащие к родам Alcaligenes, Arthrobacter, Cellulomonas, Comamonas, Flavimonas, Flavobacterium, Microbacterium, Pseudomonas и Rhodococcus,разлагают 2,4'-дихлорбифенил, осуществляя окисление орто- и/или пара-замещенного кольца молекулы.

Выделенные штаммы грамположительных бактерий, принадлежащих к родам Microbacterium и Rhodococcus, осуществляют процесс полного разложения моно- и дихлорбифенилов. При этом штамм Microbacterium sp. В51 полностью утилизирует мопо(ррто)-, ди(о/?я70-)хлорбифенилы и opwo-хлорбензоат, а штамм Rhodococcus sp. Р25 - полихлорированные бифенилы и хлорбензойные кислоты с заместителями как в орто-, так и пара-положениях.

Гены биодеградации хлорбензоатов, бифенила и нафталина штамма Rhodococcus sp. Р25 локализованы в плазмидах с молекулярной массой ПО, 90 и 80 тпн.

4. Выделенные штаммы Arthrobacter sp. Н4 и Н5 осуществляют дегалогенирование 4-хлорбензойной кислоты до расщепления ароматического кольца и растут при высоких (3,0 г/л) концентрациях 4-хлорбензоата.

5. Ассоциация биодеструкторов, в состав которой включены штаммы грамположительных бактерий Microbacterium sp. В51 и Arthrobacter sp. Н5, осуществляет полную утилизацию 2,4'-дихлорбифенила в концентрации 1 г/л в течение 72 часов.

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы были представлены на региональной конференции молодых ученых «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии», г. Пермь, 1999; VII и VIII межвузовской конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Экология: проблемы и пути решения", г.Пермь, 1999, 2000; XXXVIII Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс», г. Новосибирск, 2000; VII Молодежной научной конференции «Актуальные проблемы биологии и экологии», г. Сыктывкар, 2000; Международном семинаре «Научно-технический потенциал Западного Урала в области конверсии военно-промышленного комплекса», г.Пермь, 2001; VI Международной научно-практической конференции «Биосферосовместимые и средозащитные технологии при взаимодействии человека с окружающей природой», г.Пенза, 2001; V Международной конференции «Проблемы загрязнения окружающей среды», гг. Волгоград-Пермь, 2001; 6-й Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», г. Пущино, 2002. По теме диссертации опубликовано 14 научных работ, в том числе 3 статьи.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 165 страницах печатного текста, иллюстрирована 21 рисунком и 13 таблицами; состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов исследования, обсуждения, выводов, списка литературы и приложений. Список литературы включает 312 наименований работ отечественных и зарубежных авторов.

Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме «Изучение процессов спонтанного и индуцированного мутагенеза в условиях экспериментальной и реальной химической нагрузки» (номер государственной регистрации 01.9.00017990). Работа поддержана грантом РФФИ-Урал № 02-04-96404.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Полихлорированными бифенилами являются вещества, имеющие в своем составе два бензольных кольца, не имеющих общих атомов углерода, и присоединенные к ним от одного до десяти атомов хлора. Семейство ПХБ содержит 209 изомеров, отличающихся по количеству и расположению заместителей в молекуле бифенила. Уникальные химические и физические свойства полихлорбифенилов привели к широкому использованию данных соединений в промышленности. В химическом отношении ПХБ очень стабильны, являются отличными диэлектриками, обладают пластичностью и адгезивностью, не поддаются гидролизу и окислению в широком диапазоне температур, термоустойчивы, не чувствительны к действию кислот и щелочей. ПХБ применяются при изготовлении пластификаторов, смазочных средств, пестицидов, красок, лаков, клеев, а также в качестве компонента диэлектриков, использующихся в электрических аппаратах, в частности, в трансформаторах [7, 79, 285]. В большинстве случаев, в промышленности используются сложные смеси изомеров ПХБ. В России в качестве диэлектриков применялись смеси пентахлорбифенилов и трихлорбифенилов, получившие коммерческие названия - совол, совтол [21]. В США и странах Европы широко использовались смеси ПХБ марок Aroclor, Fecol, Delor [71,107, 285].

Впервые промышленное производство ПХБ было открыто в 1929 году в США [44]. Масштаб производства полихлорированных бифенилов - сотни тысяч тонн в год. Поступление ПХБ в окружающую среду происходит в результате испарений из пластификаторов, при сжигании отходов производств, вывоза на поля в составе пестицидов, утечек жидкостей и аварий оборудования, размещения в составе отходов на свалках. Помимо этого, ПХБ могут накапливаться в почвах в результате микробной трансформации хлорированных производных анилина, дибензофурана и некоторых полиароматических углеводородов [136, 162, 294].

Благодаря химическим свойствам полихлорированные бифенилы слабо подвержены абиотическому разложению. Концентрация ПХБ в шламах очистных сооружений колеблется от 0.1 до 60 мкг/кг, загрязненность поверхностных вод варьирует от нескольких нанограмм на 1 литр до 500 нг/л, в иловых отложениях рек и лиманов промышленных зон содержится от 50 до 500 мг/л различных изомеров полихлорбифенилов [11, 88]. Помимо районов производства и непосредственного применения, ПХБ обнаружены в песках Сахары, в Арктике и Антарктике [37].

ПХБ долго остаются в окружающей среде и прочно адсорбируются осадочными породами. Хлорированные бифенилы обнаружены во всех объектах окружающей среды и всех звеньях биологических трофических цепей [182, 200, 262, 293]. Исследования показали, что на высших трофических уровнях происходит в основном накопление ПХБ [99, 204]. Однако установлено, что личинки комаров способны к незначительной трансформации моноХБ, а период полувыведения ПХБ из организма человека составляет порядка 10 лет [44, 191].

Полихлорированные бифенилы - высокотоксичные соединения. Интоксикация организма ПХБ ведет к развитию синдрома истощения, повышенной утомляемости, дерматитов, выпадению волос, поражению печени и нервной системы, нарушениям иммунных реакций, тератогенезу, канцерогенезу, нарушению репродуктивных функций. С повышением содержания хлора в молекуле хлорбифенилов усиливается их способность вызывать порфирию [7, 11, 231].

Установлено, что ПХБ оказывают сильное воздействие на озоновый слой. В 1976 году был принят Монреальский протокол, согласно которому производство ПХБ было ограничено начиная с 1980 года, а к 2000 году их не должно быть в эксплуатации [21, 38]. Несмотря на прогрессирующее снижение использования ПХБ в промышленности, они продолжают загрязнять окружающую среду за счет их вымывания из районов складирования.

Основную роль в трансформации полихлорированных бифенилов в окружающей среде принадлежит микроорганизмам. Смеси ПХБ в пробах почвы отличаются по составу от смесей, получаемых в промышленности, поскольку они модифицируются природными системами [3]. С увеличением степени хлорирования понижается растворимость ПХБ в воде и падает скорость их метаболизма у бактерий [7, 79, 114]. Повышению уровня микробной деструкции хлорбифенилов способствует внесение анионных сурфактантов и циклодекстринов [105, 106, 108]. Большинство бифенил деградирующих бактерий способны разлагать ПХБ только до хлорбензойных кислот [37, 44, 205, 284, 300]. Полное разложение ПХБ осуществляется лишь смешанными культурами микроорганизмов [3,47, 107, 110, 150].

Известно, что ХБК также принадлежат к группе токсичных и химически стабильных синтетических соединений. В связи с этим, хлорбензоаты включены Министерством здравоохранения и медицинской промышленности РФ в перечень вредных и опасных веществ [36]. Однако, несмотря на их токсичность, ХБК продолжают использоваться при производстве гербицидов, пластмасс и растворителей, а также являются продуктами их разложения. Хлорбензоаты поступают в окружающую среду с продукцией, а также с отходами многочисленных технологий. Загрязнение окружающей среды этими соединениями может иметь тератогенные, мутагенные, канцерогенные и другие негативные последствия для организма [22, 44, 46]. Присутствие ХБК ингибирует процесс микробной деструкции ПХБ [82, 274]. Несмотря на то, что хлорбензойные кислоты принадлежат к группе веществ, устойчивых к микробной атаке, были выделены и описаны микроорганизмы, способные использовать их в качестве ростовых субстратов [13, 14, 15, 19,43, 141].

В последнее время становится очевидным, что наиболее эффективным для детоксикации хлорированных ароматических соединений, таких как ПХБ и ХБК, является биологический метод очистки с использованием бактерий-деструкторов. Разработка методов биоремедиации загрязненных территорий позволяет решать проблему их санации без вовлечения энергоемких и высокозатратных операций, включающих механические, физические и химические методы. Интродукция в почву микроорганизмов, способных активно деградировать ПХБ и ХБК, рассматривается как оптимальное решение проблемы очистки загрязненных данными веществами почв, промышленных стоков, поверхностных и грунтовых вод [17, 18, 22, 23, 95, 228]. Для мониторинга состояния природных популяций микроорганизмов после внедрения в них бактерий-деструкторов разработан ряд молекулярно-генетических методов [203, 300].

1.1. Микроорганизмы и их сообщества, осуществляющие деградацию полихлорированных бифенилов и хлорбензойных кислот

1.1.1. Микроорганизмы-деструкторы полихлорированных бифенилов

К настоящему времени накоплен большой объем информации о разнообразии бактерий, способных осуществлять полную или частичную деструкцию бифенила и его хлорированных производных. Описанные в литературе штаммы-деструкторы ПХБ принадлежат к различным таксономическим и экологическим группам. Способность к утилизации или частичной трансформации данных соединений обнаружена у представителей родов Acinetobacter, Achromobacter, Alcaligenes, Arthrobacter, Bacillus, Burkholderia, Cellulomonas, Clostridium, Comamonas, Corynebacterium, Cycloclasticus, Dehalococcoides, Desulfitobacterium, Flavobacterium, Mycobacterium, Nitrobacter, Nitrosomonas, Nitrosospira, Nocardia, Paenibacillus, Pseudomonas, Ralstonia, Rhodococcus, Rhodopseudomonas, Sphingomonas, Terrabacter, Vibrio [51, 79, 87, 97, 111, 133, 145, 164, 209, 212, 235, 285, 303]. Накопленные данные показывают, что микроорганизмы-деструкторы ПХБ не специфичны для определенной экологической ниши. Они широко распространены в естественных и подвергающихся антропогенному воздействию почвах, речных и морских экосистемах, входят в состав микробных сообществ донных отложений и активного ила [97, 151, 87, 167, 273, 285, 301]. Большинство штаммов, осуществляющих деструкцию ПХБ, являются мезофилами [111, 145, 168, 197, 285]. Shimura с коллегами выделен термофильный штамм Bacillus sp. JF8, использующий бифенил в качестве единственного источника углерода и энергии при 60 С и осуществляющий деструкцию ряда хлорбифенилов, несущих от одного до пяти заместителей в молекуле [267]. Из арктических почв, загрязненных ПХБ, выделены психротолерантные микроорганизмы, осуществляющие утилизацию бифенила и трансформацию таких смесей ПХБ как Aroclor 1221 и Aroclor 1242. Температурный оптимум максимальной деструктивной активности данных штаммов при деградации Aroclor 1221 составлял 7 С [50, 197, 198].

Помимо аэробных бактерий значительную роль в деструкции ПХБ играют анаэробные микроорганизмы [10,. 48, 205, 301, 302]. Анаэробные штаммы-деструкторы осуществляют восстановительное дехлорирование смесей ПХБ, содержащих в молекуле от 4 до 9 заместителей. Уровень деградации высокохлорированных бифенилов бактериями зависит как от внешних условий, так и от расположения заместителей в молекуле бифенила. Наиболее эффективно анаэробными бактериями осуществляется деструкция мета- и ляря-хлорированных бифенилов.

Способность к утилизации бифенила до соединений, включающихся в основной обмен, изучена у ряда почвенных бактерий рода Pseudomonas, в частности у P. putida KF715 [221], P. Jluorescens [111], P. pseudoalcaligenes KF707 [285], Pseudomonas sp. P20 [167], Pseudomonas sp. KKS102 [119, 285], Pseudomonas sp. DJ-12 [168], а также у представителей родов Alcaligenes, Corinebacterium, Rhodococcus, Sphingomonas, Mycobacterium [87, 208, 269, 273, 285, 303]. Обнаружена способность ряда штаммов-деструкторов бифенила к деградации других ароматических углеводородов, содержащих в своей молекуле одно или два и более конденсированных ароматических колец, таких как бензол, толуол, фенол, нафталин, фенантрен [2, 87, 170, 269]. Позднее была обнаружена способность бактерий, утилизирующих бифенил, осуществлять деструкцию дибензофурана [63, 258, 273].

Для большинства штаммов-деструкторов бифенил а характерна способность к полной или частичной деградации ПХБ. Способность к росту на моноХБ описана для бактерий родов Alcaligenes, Burkholderia, Pseudomonas [167, 170, 230, 241, 285]. Известно, что в процессе трансформации моноХБ не всегда происходит их полная утилизация. Описано лишь несколько природных штаммов, способных расти на монохлорбифенилах и соответствующих хлорбензоатах. Так, Pseudomonas sp. МВ86, Pseudomonas cepacia PI66 и Burkholderia sp. SK-3 способны использовать в качестве ростового субстрата 4-хлорбифенил, осуществляя при этом утилизацию образующейся 4ХБК [52, 53, 168, 285].

Способность к деструкции ди-, три-, тетра- и пентахлорированных изомеров ПХБ обнаружена у бактерий родов Acinetobacter, Alcaligenes, Arthrobacter, Burkholderia, Cellulomonas, Corynebacterium, Pseudomonas, Rhodococcus [55, 122, 133, 145, 213]. Bedard и Haberl описан метаболизм ряда ди- и триХБ у восьми штаммов, обладающих широким деградативным потенциалом. По характеру деструкции ПХБ штаммы разделены на 4 группы. Штаммы первой и второй групп Pseudomonas sp. HI 130, P. testosteroni H430, P. cepacia H201, Alcaligenes faecalis РІ434 и Corynebacterium sp. MB1 предпочтительнее окисляли изомеры ПХБ, содержащие заместителей в мета-положении, а штамм P. testosteroni Н336, помещенный в третью группу, был более активен по отношению к яяря-замещенным кольцам ПХБ. Четвертая группа представлена двумя штаммами Burkholderia sp. LB400 и Rhodococcus sp. RHA1. Для данных штаммов характерно предпочтительное окисление 2-> 2,5-> 3-» 2,4-> 4-хлорзамещенных колец молекулы хлорбифенила. Штаммы LB400 и RHA1 способны деградировать значительное количество изомеров ПХБ [65]. Наиболее изученным является Burkholderia sp. LB400 [68, 69]. Описана способность данного штамма к эффективной деструкции как промышленных смесей ПХБ, так и отдельных хлорпроизводных бифенила. Штамм LB400 способен к росту на моноХБ, используя в качестве источника углерода один из продуктов деструкции монохлорбифенилов нехлорированную пентадиеновую кислоту [238].

В настоящее время среди описанных бактерий-деструкторов ПХБ известен лишь один природный штамм Burkholderia sp. SK-3, способный осуществлять полную утилизацию дихлорбифенила, несущего по одному заместителю в каждом из колец молекулы (2,4'-диХБ). В процессе роста штамма SK-3 на 2,4'-диХБ в среде не было обнаружено 2ХБК или 4ХБК, но происходило накопление хлорид-иона в количестве, соответствующем полной минерализации 2,4'-дихлорбифенила [169, 170].

С использованием методов генной инженерии создан ряд микроорганизмов, осуществляющих полную утилизацию хлорированных бифенилов [72, 95]. Штаммы Pseudomonas putida JHR и Pseudomonas sp. UCR2 осуществляют полную трансформацию 2-, 2,4- и 2,5-диХБ [143, 147]. Генетически модифицированный штамм Pseudomonas sp. КЕ150 способен расти, используя в качестве источника углерода и энергии 4-моноХБ, 3- и 4ХБК, 3,5ХБК, выделяя при этом в среду стехиометрическое количество ионов хлора [274]. Более эффективными деструкторами монохлорбифенилов являются рекомбинантные штаммы Comamonas testosteroni VP44 (рРСЗ) и VP44 (рЕ43), утилизирующие высокие концентрации (до 10 мМ) 2-моноХБ и4-моноХБ [154]. Однако, создание штаммов, несущих искусственно сконструированные метаболические пути утилизации хлорбифенилов, является достаточно сложным процессом [173, 225]. Так штаммы Pseudomonas putida КЕ210 и Burkholderia cepacia JHR22, утилизирующие 4-моноХБ и 2-моноХБ, соответственно, получены в результате объединения участков метаболических путей четырех различных штаммов-деструкторов [242].

1.1.2. Сообщества микроорганизмов, утилизирующие полихлорированные бифенилы

Бактериальные сообщества играют ключевую роль в биодеградации многих органических синтетических соединений, в частности ПХБ, в природе. Исследования накопительных культур и смешанных культур в биореакторах показали, что микробные сообщества включены в процесс очистки ила, сточных вод и почв, загрязненных различными ароматическими соединениями [2, 27, 75, 76, 89, 98,126, 160, 166, 292].

Местообитания сообществ микроорганизмов-деструкторов ПХБ разнообразны. Данные сообщества обнаружены в районах, загрязненных полихлорбифенилами, на различных континентах. Широко исследованы бактериальные сообщества, осуществляющие деградацию ПХБ, выделенные в Канаде, США, Германии, Японии, Нидерландах, Чехии, Италии, Новой Зеландии [71, 222, 301]. Сообщества бактерий-деструкторов формируются в различных условиях: в почве, воде, на пленках поверхностного натяжения на границе вода-воздух, в кислых или щелочных средах, а также в районах с низкими или высокими температурами, сильным засолением или высоким давлением [89, 211]. Видовой состав микробных сообществ, осуществляющих деградацию ароматических синтетических углеводородов и их хлорированных производных, разнообразен и нестабилен. В процессе деструкции для данных сообществ характерно явление сукцессии. Взаимодействие микроорганизмов в сообществе в ходе сукцессии строго скоординировано [66, 86, 263]. В зависимости от преобладающих в среде изомеров ПХБ доминируют определенные виды, входящие в состав бактериального сообщества [135, 153, 248,280]. Nogales с коллегами провел изучение состава микробного сообщества, полученного из почв, загрязненных ПХБ. Большая часть сообщества была представлена микроорганизмами, относящимися к р субклассу Proteobacteria, в частности к родам Burkholderia, Variovorax, Xylophilus, Nevskia и Sphingomonas.

В меньшем количестве были представлены бактерии, относящиеся к филогенетическим ветвям Rhodopila globiformis и Acidobacterium capsulatum. Представители класса Actinobacteria присутствовали в незначительном количестве. Наибольшей деградативной активностью по отношению к ПХБ в данных почвах обладали бактерии рода Burkholderia [222].

Результаты исследования микробного разнообразия различных образцов почв,-подвергнутых длительному культивированию с бифенилом, проведенные Wagner-Dobler с коллегами, отличались от данных, полученных Nogales. Из образцов почв и донных отложений, отобранных в чистых от ПХБ и загрязненных районах, после б месяцев инкубирования с бифенилом были выделены 177 штаммов-деструкторов. В результате таксономического анализа было установлено, что большинство штаммов принадлежат роду Rhodococcus, в меньшей степени представлены рода Nocardiopsis, Bacillus, Alcaligenes, Terrabacter и Yersinia. Во всех образцах доминировали представители грамположительных бактерий, в частности Rhodococcus opacus [296].

Описана способность к деструкции промышленной смеси ПХБ Delor 103 для трех бактериальных сообществ, выделенных из районов загрязненных ПХБ. Два микробных сообщества осуществляли деградацию изомеров ПХБ с небольшим количеством заместителей в молекуле. Одно из бактериальных сообществ осуществляло 50 % деструкцию 28 изомеров ПХБ, входящих в состав Delor 103 [71].

Известны анаэробные микробные сообщества, осуществляющие деструкцию высокохлорированных изомеров ПХБ. Сообщество анаэробных микроорганизмов, выделенное из донных отложений, обладало стабильным деградативным потенциалом и осуществляло отщепление заместителей от три-, тетра- и пентаХБ в яоря-положении, но не в орто-попожетт [304].

Анаэробное метаногенное бактериальное сообщество, выделенное из иловых отложений Балтиморского порта, осуществляет орто-дехлорирование 2,3,5,6-тетраХБ до 3,5-диХБ, доступного для аэробных деструкторов ПХБ. В отсутствии ГГХБ в сообществе доминировали представители рода Clostridium. Напротив, во время активного дехлорирования ПХБ основную часть сообщества составляли представители 5 подгруппы класса Proteobacteria, подгруппы грамположительных микроорганизмов с низким содержанием G+C, подгруппы Thermotogales, а также виды, близкие к Dehalococcoides ethenogenes. В обоих случаях в бактериальном сообществе присутствовали виды подгрупп Methanomicrobiales и Methanosarcinales [153]. Natarajan с коллегами показал, что исследованное ими анаэробное метаногенное микробное сообщество осуществляет дехлорирование 2,3,4,5,6-пентаХБ до стадии образования бифенила. В отличие от описанных выше данное сообщество обладало дехлорирующей активностью по отношению к орто-, мета- и пара-заместителям молекулы ПХБ [220].

Анаэробная деструкция ПХБ микробными сообществами в большинстве случаев завершается образованием незамещенной молекулы бифенила или изомеров с одним - тремя заместителями. Описано анаэробное метаногенное сообщество микроорганизмов-деструкторов ПХБ, утилизирующее бифенил через стадию образования яяря-крезола до углекислого газа и метана [219].

Помимо природных микробных сообществ, осуществляющих деструкцию ПХБ, известны специально созданные в лабораторных условиях смешанные культуры штаммов-деструкторов. Fava с коллегами создан ряд аэробных смешанных культур микроорганизмов, осуществляющих деструкцию моно-идиХБ, а также смесей ПХБ Fenclor42 и Aroclorl221. В состав одной из наиболее активных смешанных культур ЕСОЗ входили два штамма-деструктора ХБК и штамм Pseudomonas sp. CPEl, осуществляющий минерализацию 4-моноХБ и дехлорирование 3,4'-диХБ. Смешанная культура ЕСОЗ осуществляла деструкцию ПХБ наиболее активно при иммобилизации клеток на носителе, чем в свободном состоянии [107, 109, НО]. В литературе описана смешанная культура микроорганизмов, в состав которой входят штаммы Burkholderia sp. LB400 и Pseudomonas putida mt-2a, осуществляющая утилизацию 2,4'-дихлорбифенила. Однако, способность к полной утилизации высоких концентраций 2,4'-диХБ культура приобрела только после генетической модификации штамма P. putida mt-2a [238].

Для оптимизации процесса минерализации ГГХБ, в почвы, содержащие сообщества микроорганизмов-деструкторов полихлорбифенилов, вносили штаммы, утилизирующие хлорбензойные кислоты. В результате данных экспериментов было отмечено увеличение уровня деструкции бифенила и ПХБ, а также перенос bph-генов в бензоат-деградирующие штаммы [115,150].

1.1.3. Микроорганизмы-деструкторы хлорбензойных кислот

Хлорбензойные кислоты принадлежат к группе веществ, устойчивых к микробной атаке. Несмотря на это, основная роль в деструкции хлорбензоатов в окружающей среде принадлежит микроорганизмам. Выделены бактериальные сообщества, способные использовать ХБК в качестве источника питания [19, 57, 121, 233, 264]. Первое сообщение об утилизации ЗХБК штаммом Pseudomonas sp. появилось в 1972 году [158]. К настоящему времени выделено значительное количество штаммов микроорганизмов, использующих хлорбензоаты как единственный источник углерода и энергии. Способность к утилизации моно-, ди- и трихлорированных бензойных кислот описана для бактерий родов Pseudomonas, Arthrobacter, Acinetobacter, Alcaligenes, Burkholderia, Cellulomonas, Comamonas, Corynebacterium, Desulfomicrobium, Desulfomonile, Desulfitobacterium, Micrococcus, Nocardia, Oerskovia, Ralstonia, Rhodococcus, Rhodopseudomonas [13, 14, 32, 40, 43, 58, 67, 79, 92, 94, 103, 108, 112, 113, 117, 129, 144, 146, 152, 163, 175, 177, 179, 180, 181, 186, 195,214,223, 232, 234, 244, 249,281, 305, 309].

Почти все известные в настоящее время микроорганизмы, способные деградировать ХБК, выделены, в основном, из окультуренных почв, сточных вод и активного ила. Fulthorpe с соавторами описана способность к утилизации ЗХБК для 150 штаммов, полученных методом накопительных культур из образцов почв, отобранных в шести регионах с различными климатическими условиями на пяти континентах. На основании анализа нуклеотидной последовательности ДНК сделан вывод что, полученная коллекция штаммов-деструкторов включает в себя 48 генотипов [120]. Из образцов активного ила и подземных вод, отобранных на участках промышленной территории Ниагарского водораздела, выделены 464 штамма-деструктора различных хлорбензойных кислот. Данные микроорганизмы принадлежат к пяти фенотипически различным группам и несут три негомологичных генотипа, обеспечивающих деструкцию хлорбензоатов [232]. Хорошо изученные штаммы Acinetobacter sp. ST-1, Arthrobacter sp. SB8, Arthrobacter sp. SU DSH и Arthrobacter globiformis K3T1, выделенные из садовых почв, могут использовать 4-хлорбензоат в качестве единственного источника углерода и энергии [13, 177, 214, 265]. Выделенный из почв, загрязненных ПХБ, штамм Pseudomonas aeruginosa JB2 осуществляет деградацию моно-, ди-и трихлорбензоатов, несущих заместителей в орто-, мета- или пара-положениях. [146]. Почвенный штамм Burkholderia sp. NK8 способен к росту с одинаковой скоростью на минеральных средах, содержащих в качестве источника углерода бензоат, ЗХБК или 4ХБК [116]. Способность к утилизации ряда хлорзамещенных ароматических соединений обнаружена у бактерий-деструкторов хлорбензоатов, принадлежащих к родам Pseudomonas, Alcaligenes, Burkholderia, Comamonas, Rhodococcus [16, 28, 152, 245, 288, 305].

Несколько штаммов получены методом генетической инженерии. В клетках Pseudomonas putida КЗ-6 сконструирован рекомбинантный путь деградации 4ХБК [35]. Путем интеграции fcb-теноъ из A. globiformis КЗТ1 в хромосому штамма P. putida КЗ-6 получен рекомбинантный штамм, который характеризуется высокой стабильностью признака утилизации 4ХБК и суперэкспрессией ^/с^-генов [32]. В результате ряда экспериментов создан модифицированный штамм Pseudomonas sp. ВІЗ, способный утилизировать ЗХБК и 4ХБК. Конъюгационный перенос хлоркатехол-деградирующих генов штамма Pseudomonas sp. ВІЗ в реципиентные штаммы, обладавшие различным деградативным потенциалом, привел к созданию трансконъюгантов, способных использовать в качестве единственного источника углерода и энергии 2-хлор-, 3-хлор-, 4-хлор-, 2,4-дихлор и 3,5-дихлорбензойные кислоты [4, 144, 242]. В экспериментах по конъюгации с использованием плазмиды pJP4 и смешанной культуры бактерий выделен алкалофильный, умеренно галофильный штамм Halomonas sp. EF43, разлагающий ЗХБК [176].

1.2. Метаболические пути деструкции полихлорбифенилов и хлорбензоатов

Деструкция полихлорбифенилов и хлорбензоатов микроорганизмами затруднена вследствие химической стабильности и плохой растворимости в воде данных соединений. Так, растворимость ПХБ в воде варьирует у различных изомеров от 0.001 до 0.2 мг/л. Биодеградация ХБК и ПХБ осложняется наличием в молекуле в качестве заместителей ионов хлора [7, 79].

Ферментативные системы подготовительного метаболизма ПХБ и ХБК, изучены довольно подробно. Термином "подготовительный метаболизм" обозначают совокупность реакций разложения сложных органических веществ микроорганизмами до соединений основного обмена [18].

Известно, что деструкция бифенила и его хлорированных производных начинается включением кислорода в молекулу субстрата в результате диоксигеназной атаки одного из ароматических колец. Диоксигеназы являются ключевыми ферментами в микробной деградации ароматических структур, образуя диольные производные, которые легко подвержены действию других ферментов. В результате ферментативной трансформации ПХБ разлагаются до хлорированных бензойных и пентадиеновых кислот. В ходе дальнейшего метаболизма, образующиеся ХБК подвергаются действию дегалогеназ или диоксигеназ и ферментов катаболизма бензойной кислоты, что приводит к отщеплению ионов хлора и разрыву ароматической структуры.

Формирующиеся в процессе деструкции ПХБ и ХБК карбоксилированные соединения могут утилизироваться до интермедиатов цикла Кребса и включаться в основной обмен [18, 60,123, 132, 193, 227, 229,241, 242].

1.2.1. Биохимический путь трансформации полихлорированных бифенилов

К настоящему времени известно, что бактериальные деструкторы осуществляют разложение полихлорированных бифенилов в четыре этапа до стадии образования хлорбензойной кислоты (рис. 1) [53, 65, 119, 122, 285].

С1у₄ ⁶%J ^С_ч*з _ЧЛ)н

4>S^H +o> 6 +H₇0 +02+2Н _{^4 ЧІ Ч Ч,} ⁹_{S>iL Ч}

Рис. 1. Общая схема микробной деструкции полихлорбифенилов: 1 - полихлорбифенил (ПХБ); 2 - хлорбифенилдигидродиол;

3 - хлоргидроксибифенил; 4 - хлор-2-гидрокси-6-оксо-6-фенилгекса-_; 2,4-диеновая кислота (ГОФДК); 5 - хлорбензойная кислота (ХБК); 6 - хлор-2-гидроксипента-2,4-диеновая кислота. Ферменты, катализирующие деструкцию ПХБ: а - бифенил диоксигеназа (BphA); б - бифенилдигидродиол дегидрогеназа (BphB); в - гидроксибифенил 2,3-диоксигеназа (BphC); г - ГОФДК гидролаза (ВрШ).

Первым метаболитом в результате двойного гидроксилирования соседних орто-мета атомов углерода одного из колец бифенила, является бифенил-2,3-дигидродиол. Данную реакцию катализирует мультикомпонентная бифенил диоксигеназа (BphA), состоящая из трех белков: терминальной оксигеназы, ферредоксина и ферредоксин редуктазы (рис. 2). Начальным акцептором электронов является ферредоксин редуктаза (М_г = 43 кДа), передающая их отНАДН+Н⁺ на ферредоксин. Ферредоксин (М_г=12 кДа), в свою очередь, передает электроны на каталитический центр фермента. Присоединение двух атомов кислорода к молекуле бифенила катализирует терминальная диоксигеназа в присутствии двух других компонентов. Исследования показали, что бифенил диоксигеназа содержит а и Р субъединицы с молекулярной массой 51 кДа и 22 кДа, соответственно, является аЗрЗ гексамером и принадлежит классу ПВ. Каждая а субъединица содержит [2Fe - 2S] кластер Риске, негемовое железо (II) и гидрофобные аминокислоты [80,156,157, 258].

Окисл.

Окисл.

Окисл.

Восст. NADH+H⁴"

Восст. *" ^⁴ Восст. хлорбифенил-дишдродиол Оксигеназа Ферредоксин Редуктаза

Рис. 2. Схема организации бифенил диоксигеназной системы.

Дехлорирование ПХБ зависит от количества и расположения заместителей в молекуле полихлорбифенила и от субстратной специфичности бифенил диоксигеназы (см. приложение 1). Отщепление иона хлора от молекулы ПХБ происходит в результате диоксигеназной атаки хлорзамещенных атомов углерода в молекуле ПХБ, осуществляемой бифенил диоксигеназой. Однако, в случае окисления нехлорированных атомов углерода, количество заместителей в молекуле ПХБ в ходе дальнейшей трансформации остается неизменным, элиминирования ионов хлора на последующих этапах не происходит [65, 137, 193, 207, 260].

Бифенил-2,3-дигидродиол окисляется бифенил-2,3-ДИгидродиол

2,3-дегидрогеназой (BphB) с образованием 2,3-дигидроксибифенила в присутствии НАД*, как акцептора электронов. Максимальная каталитическая активность фермента проявляется при рН 8.5. Данный фермент с M_r = 128 кДа содержит четыре идентичные по размеру субъединицы (М_г = 31 кДа), каждая из которых состоит из 277 аминокислотных остатков. Анализ аминокислотной последовательности показал высокий уровень гомологии между бифенил-2,3-дигидродиол 2,3-дегидрогеназами, выделенными из Pseudomonas putida OU83, P. pseudoalcaligenes KF707 и Burkholdeha sp. LB400 [165].

На третьем этапе биодеструкции бифенила 2,3-дигидроксибифенил 1,2-диоксигеназа осуществляет включение молекулярного кислорода по 1 и 2 углеродным атомам окисленного кольца и расщепление углерод-углеродной связи между ними. В результате данной реакции образуется 2-гидрокси-6-оксо-6-фенилгекса-2,4-диеновая кислота (ГОФДК). Фермент, осуществляющий данную реакцию, принадлежит к типу экстрадиольных диоксигеназ (BphC). Выделенная из Pseudomonas sp. KKS102 BphC является октамером. Субъединицы, входящие в ее состав, состоят из двух доменов, каждый из которых содержит дважды повторяющуюся последовательность (PafifiP) из 55 аминокислотных остатков. В активном центре фермента располагается единичный ион железа (II), координационно связанный с Гис145, Гис209, Глу260 и двумя молекулами воды [261]. Asturias и Timmis было показано, что штамм Rhodococcus globerulus Р6 содержит три изофункциональных BphC [56].

Конверсию ГОФДК до пентадиеновой и бензойной кислот катализирует 2-гидрокси-6-оксо-6-фенилгекса-2,4-диеноат гидролаза (ВрЮ), осуществляя разрыв углерод-углеродной связи между 6 и 7 углеродными атомами молекулы. Данный фермент относится к классу а/р гидролаз. ГОФДК гидролаза штамма Burkholdeha sp. LB400 является тетрамером с молекулярной массой 122 кДа, состоящим из идентичных субъединиц (M_r = 32 кДа), каждая из которых образована 286 аминокислотными остатками [257]. Nandhagopal с коллегами было обнаружено, что ГОФДК гидролаза штамма Rhodococcus sp. RHA1 представляет собой октамер (М_г = 250 кДа). Каждая из субъединиц состоит из 285 аминокислотных остатков. Активный центр фермента сформирован гидрофобным и гидрофильным участками. Молекула ГОФДК располагается ароматической частью на гидрофобном участке фермента, а диеновой частью -на гидрофильном. В результате взаимодействия ацил-ферментного комплекса с молекулой воды происходит разрыв ГОФДК и диссоциация бензойной кислоты от фермента [218]. Анализ аминокислотной последовательности выявил 42 % идентичности BphD штаммов LB400 и Р6, и только 30 % идентичности между ГОФДК гидролазами данных штаммов и BphD штамма RHA1 [255].

Известно, что помимо хлорбензойной кислоты, при деструкции ряда ПХБ образуется хлорацетофенон. Экспериментально подтвержден процесс неферментативной трансформации некоторых изомеров ГОФДК до хлорацетофенона [256].

1.2.2. Субстратная специфичность ферментов деструкции полихлорбифенилов

Описанные в литературе бактерии-деструкторы ПХБ значительно отличаются спектром деградируемых ими изомеров полихлорбифенилов. Основываясь на анализе субстратной, специфичности, микроорганизмы-деструкторы условно разделены на две группы: трансформирующие широкий спектр ПХБ, но неспособные атаковать ди-ляра-замещенные хлорбифенилы, и осуществляющие деградацию небольшого круга изомеров, но проявляющие значительную активность по отношению к ди-яа/?а-замещенным ПХБ [285]. Выделены штаммы микроорганизмов, отличающиеся от вышеописанных групп [65, 196, 235, 254]. В связи с этим, большое внимание уделяется изучению механизмов, обусловливающих различия в субстратной специфичности штаммов-деструкторов ПХБ.

Особое внимание уделяется исследованию ключевого фермента деградации бифенила и ПХБ, бифенил диоксигеназе, осуществляющей первоначальный этап окисления субстрата (рис. 1). Наиболее изученной является бифенил диоксигеназа штамма Burkholderia sp. LB400 (ВрЬАьв4оо)-Известно, что данный штамм обладает широкой субстратной специфичностью. Бифенил диоксигеназа штамма LB400 осуществляет диоксигеназную атаку не только орто- и мета- углеродов, но также и мета- и пара- углеродов кольца молекулы ПХБ. Окисление мета- и пара- углеродов обнаружено для изомеров с .ш/яа-монохлорированными и орто- и лара-замещенными 2,5-дихлорированными кольцами в молекуле. Подобные свойства обнаружены и для бифенил диоксигеназ других штаммов-деструкторов ПХБ [101, 137, 259]. Предпочтительное окисление одного из колец молекулы ПХБ зависит от расположения заместителей в молекуле [54]. Активность бифенил диоксигеназы по отношению к различным изомерам ПХБ уменьшается от незамещенного кольца к орто-, а затем - л*е/ия-замещенным кольцам. Яа/?а-хлорированные кольца слабо подвергаются окислению, а 4,4'-диХБ практически не трансформируется BphALB4oo [260]. Напротив, бифенил диоксигеназа штамма Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707 проявляет активность по отношению к 4,4'-диХБ, но не к 2,2',5,5'-тетраХБ и обладает узкой субстратной специфичностью. Сравнение аминокислотных последовательностей данных двух ферментов показало высокий уровень гомологии между ними: 95.6 % для а субъединиц и 99.5 % - для р субъединиц терминальной диоксигеназы, 100 % - для ферредоксина и ферредоксин редуктазы [172]. Каталитический центр фермента расположен на а субъединице терминальной диоксигеназы. а Субъединица ВрпАкг707 отличается 19 аминокислотными остатками и одной делецией по глицину от а субъединицы ВрЬАцв40о [172, 207, 275]. Мутантные штаммы, полученные заменой аминокислот с 335 по 341 в а субъединице ВрИАьшоо на соответствующую последовательность из а субъединицы ВрЬАкг707, способны эффективно деградировать 4,4'-диХБ и обладают широкой субстратной специфичностью [101]. Бифенил диоксигеназы штаммов Comamonas testosteroni В-356 и Rhodococcus globenilus Р6 предпочтительнее окисляли л/еяш-замещенные кольца бифенила, чем ияра-замещенные, и слабо трансформировали дважды о/?шо-замещенные изомеры [155, 199]. При этом анализ аминокислотной последовательности а и Р ВрІіАв-356 показал лишь 76 % и 70% идентичности соответствующему ферменту штамма LB400 [157]. Методом соединения участков гена bphA штаммов LB400, В-356 и Р6 сконструирована бифенил диоксигеназа, обладающая высокой активностью по отношению к 2,2'-, 3,3'- и 4,4'-диХБ [62]. На основании данных сведений был сделан вывод, что ключевую роль в определении субстратной специфичности играет а субъединица бифенил диоксигеназы. Однако анализ субстратной специфичности химерных диоксигеназ, полученных из штаммов В-356, Р6 и LB400, показал, что Р субъединица оказывает значительное влияние на предпочтительное окисление разных изомеров ТТХБ. Диоксигеназа арбрьв4оо не осуществляет окисление 2,2'-диХБ, но проявляет активность по отношению к 2,2',5,5'-тетраХБ, ^трансформируемому родительским штаммом R. globenilus Р6. Штамм С. testosteroni В-356 окисляет 2,2'-диХБ значительно медленнее, чем 3,3'-диХБ. Однако бифенил диоксигеназа ав-з5бРрб осуществляла деструкцию 2,2'-диХБ значительно быстрее, чем 3,3'-диХБ. Метаболическая активность диоксигеназы <хв-з5бРьв4оо по отношению к 4,4'-диХБ сопоставима с активностью бифенил диоксигеназы штамма Burkholderia sp. LB400 [80, 155]. При трансформации различных изомеров ПХБ бифенил диоксигеназа способна образовывать как бифенил-дигидродиол (БДГД), так и дигидрокси-бифенил (ДГБ). Образование БДГД происходит при окислении незамещенных атомов углерода. Диоксигеназная атака пары углеродов, один из которых несет ион хлора, приводит к образованию ДГБ и отщеплению хлорид иона. Окисление по 2 и 3 углеродным атомам 4,4'-диХБ приводит к образованию 4,4'-дихлорбифенил-2,3-дигидродиола, а 2,3,2'-триХБ - 2',3'-дигидрокси-

2,3-дихлорбифенила. Бифенил диоксигеназа вводит гидрокси-группы не только в положении 2,3, но и в положениях 3,4 и 5,6. В результате диоксигеназной атаки 2,5,2'-, 2,5,3'- и 2,5,2',5'-ХБ по 3 и 4 углеродным атомам образуются соединения, нетрансформируемые далее ферментами деградации бифенила [137]. Окисление 2,4,4'-трихлорбифенила по 2,3 и 5,6 положениям приводит к образованию 2,3-дигидрокси-4,4'-дихлорбифенила и 2,4,4'-трихлорбифенил-5',6'-дигидродиола, соответственно [260].

Бифенил диоксигеназа штамма LB400 проявляет конститутивную активность, а диоксигеназа штамма Pseudomonas sp. Cam-1 - индуцибельную активность. Индукция BphAcam-i происходила в присутствии бифенила, нафталина, салицилата, 2-моноХБ и 4-моноХБ [197]. Увеличение индукции диоксигеназы штамма Pseudomonas sp. СРЕ1 стимулировалось присутствием вереде витаминов [159]. Уровень деструкции Aroclor 1242 штаммами Arthrobacter sp. BIB, Cellulomonas sp. T109 и Rhodococcus rhodochrus T100 повышался при выращивании их на цимене или лимонене [133, 145],

Дальнейшие исследования субстратной специфичности штаммов-деструкторов хлорбифенилов показали, что не только бифенил диоксигеназа является определяющим звеном в деструкции различных ПХБ, но также и другие ферменты, которые катализируют последующие этапы разложения хлорбифенилов, играют существенную роль в данном процессе.

Бифенил-2,3-дигидродиол 2,3-дегидрогеназа играет ключевую роль при дальнейшей деструкции высокохлорированных изомеров ПХБ (рис. 1). Bruhlmann и Chen, изучая метаболиты, накапливающиеся в среде при трансформации ряда тетра- и пентаХБ рекомбинантным штаммом Escherichia coli, не содержащим BphB, обнаружили дигидродиольные производные данных изомеров ПХБ, но не соответствующие ГОФДК. Однако, данный штамм Е. coli осуществлял деструкцию моно-, ди- и некоторых триХБ до ГОФДК и ХБК [74].

Одним из этапов, тормозящих деструкцию ПХБ, является ингибирование третьего фермента пути деструкции бифенила (рис. 1).

Для 2,3-дигидроксибифенил 1,2-диоксигеназы характерно два вида ингибирования: аутоингибирование и возвратное субстратное ингибирование. Самоингибирование происходит в присутствии ряда субстратов, таких как катехол и 3-хлоркатехол, в результате окисления иона железа (II) в активном центре фермента, до железа (III). Возвратное субстратное ингибирование осуществляется некоторыми изомерами 2,3-дигидрокси-ПХБ, возможно образующихся при окислении ряда триХБ BphA по 3 и 4 положению. Оказывают ли ингибирующее влияние на BphC высокие концентрации 2,3-дигидроксибифенила окончательно не выяснено. Известно, что ряд органических соединений, таких как ацетон или изопропанол, могут связываться с активным центром BphC и закрывать каталитический ионнй центр, вызывая инактивацию фермента [286, 287].

ГОФДК гидролаза, осуществляющая гидролиз хлорированных ГОФДК до хлорбензоатов, ограничивает деструкцию ПХБ (рис. 1). Неспособность ГОФДК гидролазы трансформировать ряд изомеров хлорированных ГОФДК приводит к накоплению данных соединений, придающих среде желтое окрашивание. Наиболее полно изучены каталитические способности BphD штаммов R. globerulus Р6 и Burkholderia sp. LB400. З-Cl, 4-С1, 5-C1 ГОФДК, несущие заместителей в диеноатной части молекулы, слабо трансформируются ГОФДК гидролазами обоих штаммов, тогда как 8-С1, 9-С1 и I0-C1. ГОФДК, несущие заместителей в фенольной части молекулы, являются более доступными субстратами для ВрШрб и ВрШьв4оо- Вероятно, подобная специфичность характерна для большинства ГОФДК гидролаз, так как исследованные ГОФДК гидролазы штаммов Р6 и LB400 имеют только 42 % идентичности. Однако наблюдаются три основных отличия в активности данных ферментов по отношению к различным хлор-ГОФДК. Во-первых, ВрШрб гидролизует 9-CI (^тах⁼436 нм) и 10-CI (Х_тах=438 нм) ГОФДК в два раза быстрее, чем ВрШьв40о- Во-вторых, ВрШьвдоо осуществляет деструкцию 5-С1 ГОФДК (^=402 нм) и 8-С1 ГОФДК (Х_тах=393 нм) в пять раз активнее, чем BphDp₆. В-третьих, 4-С1 ГОФДК является более сильным ингибитором ВрШрб, чем 3-С1 ГОФДК, тогда как 3-С1 ГОФДК оказывает более сильное ингибирующее влияние на активность ВрШьвт чем 4-С1 ГОФДК. При инкубации штамма LB400 с4,4'-диХБ или 2,4,4'-триХБ образуется 3,10-диС1 ГОФДК, тогда как штамм Р6 трансформирует данные изомеры ПХБ до 3,10-диС1 и 3,8,10-триСІ ГОФДК, соответственно. ГОФДК гидролазы данных штаммов не способны трансформировать 3-С1 ГОФДК (Xma_X=432 нм) и 4-С1 ГОФДК (^^=409.5 нм). В результате в среде инкубации накапливаются соответствующие изомеры хлорированных ГОФДК и отсутствуют хлорбензойные кислоты. Однако, конечным продуктом деструкции 4,4'-диХБ и 3,3'-диХБ штаммом Р6 являются 4ХБК и ЗХБК, соответственно. Механизм трансформации 3,10-диС1 и 4,9-диС1 ГОФДК, окончательно не выяснен. Во-первых, R. globeruhis Р6 может обладать изофункциональными ГОФДК гидролазами, обеспечивающими деструкцию данных изомеров ГОФДК. Во-вторых, так как 9-С1 и 10-С1 ГОФДК являются более доступным субстратом для гидролаз, чем нехлорированная ГОФДК, присутствие заместителей в 9 и 10 положении в дихлорированных ГОФДК может увеличивать афинность фермента к данным изомерам. Таким образом, присутствие заместителей в диеноатной части молекулы ГОФДК снижает активность BphD, и, напротив, наличие заместителей в фенольной части - повышает активность ГОФДК гидролаз [255, 256].

1.2.3. Метаболические пути разложения ряда орто- и пара-замещенных хлорбифенилов

Разложение ПХБ в объектах окружающей среды представляет собой комбинированный анаэробно-аэробный процесс. В результате анаэробного разложения полихлорированных бифенилов, путем восстановительного дехлорирования, происходит накопление ПХБ с меньшим содержанием атомов хлора в молекуле, которые затем могут трансформироваться микроорганизмами в аэробных условиях. Восемь изомеров хлорированных бифенилов, несущих заместителей в орто- и (или) «ара-положениях, являются основными продуктами анаэробной трансформации коммерческих смесей ПХБ. Данная группа изомеров включает в себя 2-, 4-, 2,4-, 2,6-, 2,2'-, 2,4'-, 2,4,2'- и 2,4,4'-моно-, ди- и триХБ [240, 261]. Деструкция данных изомеров ПХБ исследована уряда микроорганизмов [65, 122, 192, 207, 276]. Большинство описанных в литературе бактерий-деструкторов окисляют лора-хлорированное кольцо в молекулах ПХБ, и известно только несколько бактерий, способных атаковать о/7/ио-хлорированное кольцо [65, 207, 235, 285, 303]. Известно, что штаммы, которые предпочтительнее окисляют орти о-хлорированные кольца, метаболизируют продукты анаэробного дехлорирования ПХБ более эффективно и обладают более широкой субстратной специфичностью [48, 192, 207]. Основываясь на литературных данных о деструктивной активности ряда штаммов и субстратной специфичности ферментов деструкции ПХБ, нами предложены схемы наиболее вероятных путей биоразложения 2-, 4-, 2,2'-, 4,4'-, 2,4'-, 2,4,2'-, 2,4,4'- и 2,4,2',4'-хлорбифенилов (см. приложение 1).

1.2.4. Метаболический путь деструкции пентадиеновой кислоты, продукта разложения полихлорированных бифенилов

Микроорганизмы-деструкторы трансформируют ПХБ до образования хлорбензойных и пентадиеновых кислот (рис. 1) [65, 137, 255, 256, 306]. Дальнейшая утилизация хлорбензоатов осуществляется штаммами, содержащие ферменты, специфичные к хлорбензойным кислотам [44, 285]. Конверсию 2-гидрокси-2,4-пентадиеновой кислоты осуществляют ферменты, кодируемые генами, входящими в состав бифенильного оперона [118, 172, 298].

Разложение 2-гидрокси-2,4-пентадиеновой кислоты осуществляется в три стадии в результате последовательного действия 2-гидрокси-2,4-пентадиеноат гидратазы, 4-гидрокси-2-оксовалерат альдолазы и ацетальдегид дегидрогеназы (рис. 3). Аминокислотная последовательность данных трех ферментов штамма KJF707 на 99 % идентична аминокислотной последовательности ферментов, ответственных за деструкцию 2-гидрокси-2,4-пентадиеновой кислоты, выделенных из штамма LB400 [172]. Sakai с коллегами показано, что уровень идентичности аминокислотной последовательности данных ферментов штамма Rhodococcus sp. RHA1 и грамотрицательных штаммов-деструкторов ПХБ составляет 30-58% [251]. Образовавшийся в результате ферментативной трансформации пентадиеновой кислоты ацетил-кофермент А (КоА) поступает в цикл трикарбоновых кислот и включается в основной обмен. ^у^Н a ^aV^f^ > V \_КоА ' СООН *" I СООН + ₅

Рис. 3. Схема микробной деструкции пентадиеновой кислоты. /- 2-гидрокси-2,4-пентадиеновая кислота, 2 - 4-гидрокси-2-оксовалериановая кислота, 3 - ацетальдегид, 4 - 2-оксопропионовая кислота, 5 - ацетальдегид-кофермент А; ЦТК - цикл трикарбоновых кислот; ферменты, катализирующие деструкцию пентадиеновой кислоты: а - 2-гидрокси-2,4-пентадиеноат гидратаза, б - 4-гидрокси-2-оксовалерат альдолаза, в - ацетальдегид дегидрогеназа.

1.2.5. Метаболические пути разложения хлорбензойных кислот

Ключевой реакцией метаболизма хлорбензоатов является реакция дегалогенизации [18, 112]. Значение этого этапа заключается в том, что отщепление галогена от молекулы хлорбензойной кислоты приводит к резкому снижению ее биологической устойчивости и делает доступной в качестве источника питания для большинства микроорганизмов.

Дегалогенирование хлорбензойных кислот может происходить как до расщепления ароматического кольца, так и после его расщепления. Известны три механизма ферментативного дегалогенирования ароматического кольца: гидролитический, окислительный и восстановительный. Однако, для многих бактерий-деструкторов ХБК характерен модифицированный орто-путъ, в ходе которого, отщепление галогена от молекулы хлорбензойной кислоты происходит после расщепления ароматического кольца (рис. 4) [138].

1.2.5.1. Реакции ферментативного дегалогенирования хлорбензойных кислот

Гидролитическое дегалогенирование. При реакции гидролитического дегалогенирования происходит расщепление связи углерод-галоген с замещением атома галогена на гидроксильную группу молекулы воды. Впервые возможность гидролитического дегалогенирования ЗХБК была показана в 1972 г. у штамма Pseudomonas sp. [43]. Позднее был выделен ряд бактерий, утилизирующих 4-хлорбензоат с образованием в качестве промежуточных продуктов деградации ля/?а-оксибензойной (ПОБК) и протокатеховой (ГЖК) кислот (рис. 4а) [13, 43]. Реакции гидролитического дехлорирования в основном изучены и строго доказаны у культур, разлагающих 4ХБК.

Для определения механизма реакции дегалогенирования 4ХБК бактериями-деструкторами, принадлежащими к родам Acinetobacter, Pseudomonas и Arthrobacter, были проведены эксперименты с включением радиоактивной метки из ¹⁸Ог и Н-^О. Результаты свидетельствуют о том, что превращение 4ХБК в ПОБК является гидролитическим процессом [43, 177].

Анализ количества поглощенного кислорода суспензией клеток штамма Arthrobacter globiformis КЗТ1 показал, что источником гидроксильной группы ПОБК при дегалогенизации 4ХБК данным штаммом является вода [13]. Бесклеточные экстракты Pseudomonas sp. CBS3, Arthrobacter sp. TM-1 и Arthrobacter sp. SU DSM 20407 легко превращали 4-хлорбензойную кислоту в «а/?йг-оксибензоат в анаэробных условиях [163, 214, 215].

^а _Ю

2ХБК

Катехол

2-хлоркатехол

Рис. 4. Механизмы дегалогенирования хлорбензойных кислот: а - гидролитический [13], б - окислительный [247], в - восстановительный [249,

288], г - модифицированный орто-путь [243, 245].

В ряде работ было приведено объяснение механизма реакции гидролитического дехлорирования 4ХБК [84, 189, 190]. Дегалогенирование 4ХБК экстрактами из штаммов Pseudomonas sp. CBS3 и Acinetobacter sp. 4-СВ1 стимулировалось добавлением АТФ и коферментаА (КоА). В результате взаимодействия 4-хлорбензоата, КоА и АТФ синтезировался 4-хлорбензоил-КоА, гидролизующийся в последующей реакции до ПОБК и КоА [67, 78, 113] Присутствие в среде следовых количеств витаминов повышало дехлорирующую активность штаммов-деструкторов [15, 104].

Окислительное дегалогенирование. Реакция окислительного дегалогенирования ароматических соединений, представляющая собой энзиматическую реакцию, катализируемую оксигеназами, в которой атом хлора замещается на гидроксильную группу, была открыта Голдманом при изучении метаболизма 2-фторбензоата штаммами рода Pseudomonas [43]. Реакции окислительного дехлорирования наблюдались при метаболизме 2ХБК штаммами Pseudomonas cepacia 2CBS, P. aeruginosa JB2, P. aeruginosa 142, P. cepacia K3-2 [32, 40, 112, ИЗ]. Диоксигеназы, катализирующие реакции дехлорирования у данных штаммов, представляют собой многокомпонентные ферментативные системы. Дехлорирование 2ХБК и ряда других галозамещенных ор/ио-бензоатов штаммом P. cepacia 2CBS катализировала двухкомпонентная ферментная система 2-галобензоат 1,2-диоксигеназа, представляющая собой 1,2-гидроксилирующий, дегалогенирующий, декарбоксилирующий фермент [247]. В процессе окислительного дехлорирования происходит расщепление 2ХБК до пирокатехина с отщеплением иона хлора (рис. 46).

Клеточные экстракты P. aeruginosa 142 осуществляли деградацию 2,4ХБК, 2ХБК и ряда других замещенных о/?то-галобензоатов с превращением их в 4-хлоркатехол или катехол. Диоксигеназа штамма P. aeruginosa 142 представляет собой трехкомпонентную систему. Один из компонентов охарактеризован как ферредоксин, проявляющий высокую гомологию с

РОССИЙСКАЯ₄₁ ГОСУДАРСТВЕННАЯ

БИБЛИОТЕКА аминокислотными последовательностями ферредоксинов нафталин- и бифенил-трехкомпонентных диоксигеназных систем. Предполагается, что двумя другими компонентами являются NADH-зависимая ферредоксин-редуктаза и терминальный компонент 0/?/ио-галобензоат-1,2-диоксигеназы [250].

Восстановительное дегалогенирование. Реакция восстановительного дегалогенирования в большинстве случаев протекает в анаэробных условиях и зависит от присутствия восстановителя. В ходе данной реакции происходит замещение атома галогена в ароматическом кольце на атом водорода. Возможность восстановительного дехлорирования .метя-хлорбензоатов впервые была продемонстрирована в 1982 г. на примере метаногенного консорциума микроорганизмов [43]. После полного удаления атомов хлора происходило расщепление ароматического кольца с образованием метана и двуокиси углерода. Позже были выделены и описаны индивидуальные микроорганизмы и микробные сообщества, осуществляющие восстановительное дегалогенирование 2ХБК и ЗХБК [103, 129, 139, 178, 205, 264, 281]. Восстановительное дехлорирование происходило также на первой стадии аэробной биодеградации 2,4ХБК штаммом Alcaligenes denitrificans NTB-1 (рис. 4в) [249, 289]. В результате восстановительного дегалогенирования 2,4-дихлорбензоата образуется 4ХБК, которая далее гидролизуется до ПОБК.

1.2.5.2. Энзиматические реакции орто-расщепления или 3-оксоадипативный путь.

В результате ферментативного дегалогенирования и окисления хлорбензоатов на ранних этапах подготовительного метаболизма осуществляется трансформация ХБК до пирокатехина (катехола) или протокатеховой кислоты (рис. 4а-в) [18,307].

Разрыв ароматического кольца образовавшихся метаболитов осуществляют диоксигеназы. При этом в субстрат включается молекулярный кислород [140]. Известно, что для данной реакции не требуется дополнительный донор водорода, такой, как NADPH [12, 18, 100]. Разрыв происходит между двумя соседними гидроксильными группами и приводит к образованию дикарбоновой кислоты. Из участвующих в процессе ферментов лучше всего изучены ферменты, выделенные из разных видов Pseudomonas [9].

Катехол расщепляется с помощью орто-пирокатехазы (катехол-1,2-диоксигеназы), а ПКК - при участии протокатехат-3,4-диоксигеназы. Образующиеся при этом промежуточные продукты - цис, 2/ис-муконовая и З-карбокси-г/wc, г/ис-муконовая кислоты - в ходе дальнейшего катаболизма проходят через этап общего для них обоих продукта - 3-оксоадипиновой кислоты. Последняя активируется КоА-трансферазой и расщепляется с образованием сукцинил-КоА и ацетил-КоА, которые подвергаются дальнейшим превращениям в ходе промежуточного обмена [9, 70,134,277].

Для двух бактерий Azoarcus evansii и Bacillus stearothermophilus описан путь трансформации бензойной кислоты, значительно отличающийся от 3-оксоадипативного, но приводящий к образованию 3-оксоадипата. В результате ряда ферментативных превращений бензоил-КоА, образовавшийся из бензоата, трансформируется до 2,3-дегидроадипил-КоА, через стадию 6-гидрокси-З-гексоноил-КоА. В результате гидратации 2,3-дегидроадипил-КоА образуется 3-оксоадипил-КоА [128, 310].

Как было сказано выше, отщепление галогена от молекулы ХБК может происходить после расщепления ароматического кольца. Связь углерод-галоген становится лабильной после присоединения атома кислорода к углероду, связанному с галогеном, с образованием галогензамещенных катехолов.

Хлоркатехолы разрушаются путем орто-расщепления, так как оказывают ингибирующее действие на ферменты мета-пут. Однако, штамм P. putida GJ31 осуществлял трансформацию 3-хлоркатехола по пути мета-расщепления [195]. В процессе роста штамма Pseudomonas putida WR201 на ЗХБК была обнаружена активность ферментов орто- и мета-путп расщепления субстрата [117]. Обычные пирокатехазы расщепляют галогензамещенные катехолы с относительно низкой эффективностью, поэтому основное значение в деградации этих соединений приобретает раскрытие кольца. На последующих этапах метаболизма, включая изомеризацию, происходит отщепление оставшихся заместителей.

1.2.5.3. Модифицированный орто-путь. .Для многих почвенных бактерий, разлагающих хлорароматические соединения, характерен модифицированный орто-путь [236, 242].

Известно, что ферменты классического opmo-пути, синтезирующиеся у многих микроорганизмов при росте на незамещенных ароматических субстратах, характеризуются узкой субстратной специфичностью и не способны к эффективному использованию галогенированных аналогов. Ферменты модифицированного opmo-пути характеризуются более широкой субстратной специфичностью и высоким сродством к галогенированным субстратам и продуктам их разложения [138].

Ключевыми метаболитами при бактериальной деструкции хлорароматических соединений являются хлоркатехолы. В процессе метаболизма происходит окисление хлоркатехолов под действием хлоркатехол 1,2-диоксигеназ до соответствующих хлорзамещенных г/ис,*/ис-муконовых кислот [73, 237, 243, 244]. Последующую реакцию лактонизации катализирует хлормуконат циклоизомераза. В ходе данной реакции происходит трансформация хлор-*/мс,г/ис-муконовых кислот либо до диенолактона, что сопровождается спонтанным отщеплением хлора от молекулы кислоты, либо до хлор-муконолактона. Дегалогенирование последнего осуществляет хлор-муконолактон дегалогеназа [187, 206, 270, 295]. Гидролиз образовавшихся продуктов до малеилацетата катализирует диенлактон гидролаза [226]. Цепь реакций модифицированного opmo-пути завершается превращением малеилацетата под действием малеилацетат редуктазы в 3-оксоадипиновую кислоту, включающуюся далее в пути центрального метаболизма [161].

Таким образом, штаммы-деструкторы, несущие ферменты модифицированного орто-пут, осуществляют дегалогенирование молекулы ХБК на поздних этапах метаболизма в процессе трансформации хлорбензоатов через стадию хлоркатехолов до соединений основного обмена (рис. 4г).

1. 3. Генетические системы биодеградации хлорпроизводных бифенила и бензойной кислоты у бактерий

В последние десятилетия проводится интенсивное изучение генетических систем, контролирующих бактериальную деградацию ксенобиотиков, в том числе полихлорированных бифенилов и хлорбензойных кислот. Обнаружено, что гены, ответственные за деструкцию замещенных и незамещенных ароматических соединений, могут иметь хромосомальную или плазмидную локализацию [4, 5, 8, 79, 242, 269, 308]. Характерной чертой плазмид биодеградации, или D-плазмид, является их большой размер (50 - 1100 тпн) [93,266, 279, 291, 311].

1. 3. 1. Организация генетических систем деструкции полихлорированных бифенилов

Гены, детерминирующие окисление бифенила и ПХБ (bph гены), впервые были клонированы у штамма Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707. Показано, что bph-гены штамма KF707 расположены в следующем порядке (orf0)bphAlA2(orf3)bphA3A4BCX0XlX2X3D. Аналогичный порядок ЬрИ-генов обнаружен у штамма Burkcholderia sp. LB400 (рис. 5). Гены бифенил диоксигеназы у данных штаммов расположены выше остальных генов деструкции бифенила. Гены, кодирующие а и Р субъединицы терминальной диоксигеназы, bphAI и bphA2 {bphA и bphE), расположены выше гена ферредоксина, bphA3 (bphF), за которым расположен ген ферредоксин редуктазы, bphA4 (bphG). Ниже генов бифенил диоксигеназы расположены гены, кодирующие бифенил-дигидродиол дегидрогеназу, bphB, и 2,3-дигидроксибифенил диоксигеназу, bphC. Кластер генов, bphXO-bphXl- bphE bphG bphF 0RF4 bphAl bphA2 ЬрІіАЗ bphB bphC bphD ORF1 bphA4 —^ KKS102 ORFO bphAl bphA2 ORF3 bphA3 bphA4 bphB bphC bphXO bphXl bphX2 bphX3 bphD H > KF707 ORFO bphA bphE ORF1 bphF bphG bphB bphC bphK bphH bphJ bphl bphD > LB400 bphA bphE ORF1 bphF bphG bphB bphC bphD *Щ;Ї-М ІМІІІІ>^ВІ1111Ш^ > KF175

Рис. 5. Сравнительная структура оперонов, детерминирующих путь разложения бифенила в штаммах Pseudomonas sp. KKS102, Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707, Burkholdena sp. LB400 и Pseudomonas putida KF715 [242]. Гомологичные гены обозначены одинаковым цветом и штриховкой. Обозначения генов - в тексте. bphX2-bphX3 (bphK-bphH-bphJ-bphl), ответственных за конверсию гидрокси-пента-диеновой кислоты, образующейся в результате действия ГОФДК-гидролазы, (ген bphD), до соединений, входящих в цикл трикарбоновых кислот, расположен между bphC и bphD [242, 298].

Анализ нуклеотидной последовательности bph-rQHOB штамма Pseudomonas putida KF715 показал расположение генов аналогичное таковому у штаммов KF707 и LB400, за исключением делеции в области bphX0XlX2X3 (рис. 5). Таким образом, в штамме KF715 отсутствуют гены, ответственные за деструкцию 5-углеродного фрагмента [221].

Методом рекомбинантных ДНК было показано, что штамм Pseudomonas sp. KKS102 содержит кластер из 12 bph-генов (рис. 5). Из рисунка 5 видно, что гены bphEGF, кодирующие ферменты утилизации 5-углеродного фрагмента, расположены выше генов деструкции бифенила. На основании сиквенса ДНК авторы предполагают, что гены bphC и bphD, локализованы в одном опероне, в отличие от штамма KF707, несущего оперон bphABC, в состав которого не входит ген ГОФДК-гидролазы, bphD [119, 125, 171]. Почвенный штамм Pseudomonas sp. Р20 несет хромосомально локализованные основные гены деструкции бифенила, расположенные в двух оперонах рсЬАВС и pcbD [167]. Уникальное расположение генов биодеградации ГТХБ обнаружено у штамма Pseudomonas sp. DJ-12. Гены локализованы в двух оперонах. Первый включает в себя гены рсЬА и рсЬВ, кодирующие ферменты первых двух этапов деструкции ПХБ. В результате исследования второго оперона было установлено, что промоторная область находится выше гена pcbD, а входящие в него гены расположены следующим образом pcbDC(orfl)pcbE(orf2) [168, 188].

Для ряда штаммов родов Pseudomonas и Rhodococcus описана плазмидная локализация bph-геиов [118, 242]. В штамме Rhodococcus sp. RHA1 обнаружены три линейные D-плазмиды pRHLl (1100 тпн), pRHL2 (450 тпн) и pRHL3 (330 тпн), несущие гены деструкции полихлорированных бифенилов. Окисление бифенила до ГОФДК контролируется генами, входящими в состав одного оперона, расположенного на pRHLl (bphAlA2A3A4CB). Гены дальнейшей деструкции данного субстрата локализованы на pRHL2 (bphDEF). Плазмида pRHL3 несет гены, кодирующие ферменты, подобные ферментам генов bphAlA2A3. Помимо этого, часть генов деструкции бифенила локализованы в хромосоме (bphC3C5C6) [118, 266]. Подобное расположение изофункциональных генов описано для хромосомально локализованных bph-генов штамма Rhodococcus sp. Р6 [142]. Анализ аминокислотной последовательности продуктов bph-генов штаммов Rhodococcus sp. RHA1 и Rhodococcus sp. M5 выявил более высокий уровень гомологии между bph-генши штаммов рода Rhodococcus и fo^Z-генами, ответственными за деградацию толуола, штамма Pseudomonas putida Fl (49 -79 %), чем с bph-генами штаммов Pseudomonas sp. KF707 и KKS102 (30 - 65 %). В результате изучения нуклеотидной последовательности генов, кодирующих первые три этапа деструкции бифенила, штаммов RHA1 и М5 показано, что уровень гомологии между ними составляет 57 - 74 %. Обнаружены идентичные участки у генов, кодирующих бифенил-дигидродиол дегидрогеназу и

2,3-дигидроксибифенил диоксигеназу, у штаммов Rhodococcus spp. Р6 и М5 [196, 297]. Yamada с коллегами показали, что bphD грамотрицательных штаммов образуют единое подсемейство, тогда как аналогичные гены штаммов М5 и RHA1 значительно отличаются от них [306]. Таким образом, гены биодеградации бифенила штаммов рода Rhodococcus значительно отличаются от bph-генов грамотрицательных штаммов-деструкторов. Однако, в не зависимости от своего происхождения, bph-гены слабо экспрессировались в рекомбинантных штаммах Escherichia coli. Высокий уровень экспресии был характерен для рекомбинантных штаммов Pseudomonas putida [49, 199].

Изучение трансконъюгантов, полученных в результате переноса плазмиды pRHL2 в штаммы, лишенные bph-генов, показало, что 6/?/г⁺-фенотип возникает с частотой 7.5 х 10"⁵. Нуклеотидный анализ плазмиды pRHL2 выявил наличие в концевых областях инвертированных повторов, содержащих GCTXCGC-последовательность. Подобные последовательности были обнаружены в pRHLl, pRHL3 и хромосоме штамма Rhodococcus sp. RHA1. Авторы предполагают, что линейные плазмиды играют ключевую роль в распространении генов биодеградации среди штаммов рода Rhodococcus [266].

Гены биодеградации ПХБ, локализованные в хромосоме, могут входить в состав транспозонов. Так, кластеры bph- и 5я/-генов в штамме P. putida KF715 включены в транспозон с молекулярной массой 90 тпн [279]. Подробно изучен транспозон Тп4371, обнаруженный в хромосоме штамма Ralstonia eutropha А5 [272]. Тп4371 - сложный транспозон с молекулярной массой 55 тпн, распространенный, в основном, среди штаммов группы Р протеобактерий. В правой части данного транспозона локализованы bph-гены, расположенные в следующем порядке bphEGFbphAlA2A3BCDA4 [201]. Нуклеотидная последовательность данных генов на 94 % идентична ЬрИ-генам штамма Pseudomonas sp. KKS102 [271]. Эксперименты по гибридизации различных участков Тп4371 и ДНК из трех Bph⁺ трансконъюгантных штаммов показали, что bph-гєтл являются самостоятельным мобильным элементом. Tn-bph обладает собственной эксцизионно-интеграционной системой и способен к самостоятельному конъюгационному переносу, независимо от большого элемента [202].

Несмотря на то, что биохимическая и генетическая организация /?/г-кластера изучена достаточно подробно, данных о регуляции экспрессии недостаточно. Schell предположил, что bphR ген, примыкающий к группе bph-rQHOB, является регуляторным и кодирует белок-регулятор LysR типа [253]. Ген ог/0, расположенный в начале ЬрИ-кластера в штамме KF707, кодирует регуляторный белок, на 28 % идентичный GntR, белку-репрессору транскрипции глюкозного оперона Bacillus subtilis (рис. 5). Сайт инициации транскрипции располагается выше стартового кодона гена ог/0. Промоторные последовательности TTGACA и TAAGTT, обнаруженные в -35 и -10 позициях, соответственно, подобны консенсусной последовательности о -зависимого промотора Е. coli. ORF0 синтезируется индуцибельно. Активатором экспресии orfO является бифенил. В отличие от GntR-регуляторных белков, ORF0 наиболее вероятно выступает активатором, но не репрессором экспрессии генов bphXD, при этом он не оказывает влияния на экспрессиию генов, кодирующих основные этапы деструкции бифенила [298]. Вероятно, ген orfO штамма LB400 также кодирует белок-регулятор транскрипции [102].

В штамме Rhodococcus sp. М5 регуляцию транскрипции генов bpdCBADEF осуществляет двухкомпонентная сигнал-транспортная система bpdSlbpdT. Индуктором транскрипции bpd-rsHOB является бифенил. В данном случае BpdS и BpdT функционируют как сенсорная гистидин киназа и белок регулятор ответа, соответственно [184].

ЬрИ-Гепы, входящие в состав транспозона Тп4371, организованы в оперон, транскрипция которого начинается с а⁷⁰-зависимого промотора. В результате анализа нуклеотидной последовательности bph-оперона Тп4371 выше bphE идентифицирован регуляторный ген bphS, ниже bphA4 - ген bphR. Делеция bphR не оказывала влияния на транскрипцию bph-оперона. Инактивация bphS приводит к конститутивной экспрессии генов, ответственных за окисление молекулы бифенила. Сравнение аминокислотной последовательности BphS и ORF0 показало, что данные белки идентичны на 58 %. При этом, BphS содержит в N-терминальной области последовательность, характерную для GntR-регуляторных белков. Анализ активности BphC в рекомбинантных штаммах, несущих плазмиды с клонированными генами bph-оперона, показал, что bphS кодирует белок негативной регуляции транскрипции bph-теяов. Индукторами BphS являются дигидрокси-бифенил и ГОФДК[210].

1.3.2. Генетические системы утилизации хлорбензоатов

Гены биодеградации хлорбензойных кислот широко распространены среди микроорганизмов, что обусловлено их плазмидной локализацией. Так, у штамма Pseudomonas sp. ВІЗ гены, контролирующие деградацию ЗХБК, находятся в конъюгативной плазмиде рВ13 размером 111 тпн (другое обозначение pWRl), а в штамме Pseudomonas putida АС858 была обнаружена плазмида рАС25 размером 117 тпн (группа несовместимости Р-9), которая отличается от рВ13 участком ДНК в 6 тпн [77, 144, 242].

Детально изучена коньюгативная плазмида pJP4 размером 77 тпн (группа несовместимости Р-1), находящаяся в штамме Ralstonia eutropha JMP134 [79]. С помощью гибридизационного анализа показано, что ДНК плазмиды pJP4 в области генов деградации ЗХБК гомологична ДНК плазмиды рАС27 [131]. Мутагенез с помощью транспозонов Тп5 и Тп1771 с последующим клонированием и рестрикционным анализом дал возможность определить расположение деградативных генов на плазмиде pJP4. Было установлено, что данная плазмида содержит дуплицированные гены tfdCDEF, организованные в два оперона tfa\ и (/. Ответственными за деструкцию ЗХБК являются гены (/ [4, 94, 185, 282]. Подобную последовательность tfd генов несет плазмида pJP2 (группа несовместимости Р-3), выделенная из штамма Alcaligenes eutrophus JMP363 [130].

Сиквенс генов биодеградации (cbnR-ABCD) штамма-деструктора ЗХБК Alcaligenes eutrophus NH9, локализованных в плазмиде, показал, что они гомологичны (89-100% идентичности на нуклеотидном уровне) генам tcbR-CDEF плазмиды рР51 штамма Pseudomonas sp. Р51, деградирующего 1,2,4-трихлорбензен [224]. В штаммах Pseudomonas sp. Р51, P. putida (pAC27) и Ralstonia eutropha JMP134, был обнаружен высокий уровень гомологии (57.6 - 72.1 %) генов tcbCDEF, clcABD и tfdCDEF [290].

Штамм P. cepacia HCV использует хлорированные толуолы, 2ХБК, 2,4ХБК и 3,4ХБК в качестве единственного источника углерода и энергии, и содержит три плазмиды с молекулярной массой 4.7, 31 и 54 Мд. Предполагается, что последняя содержит гены деградации хлорароматических соединений [291]. В штаммах P. cepacia 2CBS и P. putida Pill обнаружены плазмиды с молекулярной массой 60 тпн и 75 тпн, соответственно, несущие гены биодеградации 2-хлорбензоата [113]. В клетках штаммов грамположительных почвенных бактерий Arthrobacter globiformis КЗТ1 (деструктор 4ХБК) и Corynebacterium sepedonicum КЗ-4 (деструктор 4ХБК и 2,4ХБК) обнаружены D-плазмиды с молекулярной массой ПО тпн, демонстрирующие высокую степень гомологии. Плазмида штамма A. globiformis КЗТ1 pBS1501 содержит fcb-гены, контролирующие первый этап пути деградации 4ХБК до 4-оксибензоата, дальнейшее разложение которого контролируется хромосомальными генами [284, 311]. Плазмида штамма С. sepedonicum КЗ-4 pBS1502, содержащая гены, гомологичные fcb-генш из штамма Л. globiformis КЗТ1, участвует в дехлорировании 4ХБК [32].

Гены биодеградации хлорбензойных кислот могут также входить в состав транспозонов. Так, у штамма Burkholderia cepacia 2а, гены, детерминирующие деструкцию ЗХБК, входят в состав сложного транспозона Тп5530, а у штамма A. eutrophus NH9 подобные гены локализованы на транспозоне Тп5707 [224, 305]. Помимо этого, cbaABC гены, обусловливающие ЗХБК⁺, 4ХБК⁺ и 3,4ХБК⁺ фенотип, несет транспозон Тп5271, обнаруженный в штаммах, изолированных в США и Италии [90, 216, 217, 239, 279]. Изучение нуклеотидной последовательности данного транспозона выявило высокий уровень гомологии (99.3%) генов cbaABC в штаммах, выделенных с разных континентов [91]. Обнаружено, что clc и fcb гены также входят в состав транспозонов [232]. Gartemann и Eichenlaub показано, что в хромосомах 4ХБК-деградирующих штаммов родов Arthrobacter и Micrococcus присутствуют мобильные элементы IS 1409 [127].

Рядом работ было показано, что гены, контролирующие деградацию хлорбензойных кислот, могут иметь хромосомальную локализацию.

В результате проведенных исследований Savard с коллегами показал хромосомальное расположение генов, детерминирующих дехлорирование 4ХБК у штамма Pseudomonas sp. CBS3 [252]. Штамм Pseudomonas putida PI 11, несущий на хромосоме гены бензоат диоксигеназы, использует в качестве ростового субстрата ЗХБК и 4ХБК [113]. Высокую активность по отношению к данным субстратам демонстрирует штамм Burkcholderia sp. NK8. Гены, кодирующие ферменты окисления ХБК (cbeABCD), катехола (catABC) и регуляторный ген (cbeR) у данного штамма объединены в один кластер. Хлорбензоат 1,2-диоксигеназа (СЬеАВС) на 50-65% идентична бензоат диоксигеназе штамма Acinetobacter sp. ADPl, толуол- и 2-галобензоат диоксигеназам штамма Bwkholderia cepacia 2CBS, локализованных в плазмидах [116]. Штаммы P. cepacia КЗ-2, Burkholderia sp. ТН2, P. Aeruginosa 142 и P. aeruginosa JB2 осуществляют деструкцию 2ХБК и ряда дихлорбензоатов. При этом гены ohbAB, кодирующие орто-1,2-галобензоат диоксигеназу, расположены в хромосоме в одном мобильном элементе. ПЦР-анализ показал, что гены ohbA штаммов P. aeruginosa 142 и P. aeruginosa JB2 идентичны, a ohbB - значительно различаются [148, 149, 283, 311].

Таким образом, гены биодеградации хлорированных бензойных кислот, широко распространенные среди микроорганизмов, могут быть локализованы в хромосоме или в плазмидах, а также входить в состав сложных транспозонных структур.

Анализ литературных данных показал, что основная роль в процессах деструкции полихлорбифенилов и хлорбензоатов в природе принадлежит микроорганизмам. Бактерии-деструкторы ПХБ и ХБК широко распространены и являются представителями различных таксономических и экологических групп. Исследование биохимических особенностей деградации ПХБ показало, что большинство известных микроорганизмов-деструкторов не осуществляют полное разложение ПХБ, а трансформируют данные соединения до стадии образования хлорбензойной кислоты. Описанные штаммы-деструкторы ПХБ характеризуются разным деградативным потенциалом. Установлено, что штаммы, предпочтительно окисляющие ор/яо-хлорированные кольца ПХБ, обладают широкой субстратной специфичностью. Утилизацию хлорбензоатов осуществляют бактерии, в большинстве своем не способные разлагать ПХБ. Наибольший интерес представляют микроорганизмы, осуществляющие дегалогенирование ХБК до расщепления ароматического кольца. Однако описано лишь несколько штаммов с данным типом деструкции хлорбензоатов. Известно, что гены биодеградации хлорароматических соединений могут иметь хромосомальную или плазмидную локализацию. Большинство описанных штаммов-деструкторов ПХБ несут гены биодеградации в хромосоме, тогда как у хлорбензоат-деградирующих штаммов широко представлена как хромосомальная, так и плазмидная локализация генов биодеструкции. Таким образом, поиск новых штаммов-деструкторов полихлорированных бифенилов и хлорбензойных кислот, исследование их биодеградативного потенциала является актуальным и необходимым условием для создания эффективных препаратов для биоремедиации загрязненных территорий.

Микроорганизмы-деструкторы полихлорированных бифенилов

К настоящему времени накоплен большой объем информации о разнообразии бактерий, способных осуществлять полную или частичную деструкцию бифенила и его хлорированных производных. Описанные в литературе штаммы-деструкторы ПХБ принадлежат к различным таксономическим и экологическим группам. Способность к утилизации или частичной трансформации данных соединений обнаружена у представителей родов Acinetobacter, Achromobacter, Alcaligenes, Arthrobacter, Bacillus, Burkholderia, Cellulomonas, Clostridium, Comamonas, Corynebacterium, Cycloclasticus, Dehalococcoides, Desulfitobacterium, Flavobacterium, Mycobacterium, Nitrobacter, Nitrosomonas, Nitrosospira, Nocardia, Paenibacillus, Pseudomonas, Ralstonia, Rhodococcus, Rhodopseudomonas, Sphingomonas, Terrabacter, Vibrio [51, 79, 87, 97, 111, 133, 145, 164, 209, 212, 235, 285, 303]. Накопленные данные показывают, что микроорганизмы-деструкторы ПХБ не специфичны для определенной экологической ниши. Они широко распространены в естественных и подвергающихся антропогенному воздействию почвах, речных и морских экосистемах, входят в состав микробных сообществ донных отложений и активного ила [97, 151, 87, 167, 273, 285, 301]. Большинство штаммов, осуществляющих деструкцию ПХБ, являются мезофилами [111, 145, 168, 197, 285]. Shimura с коллегами выделен термофильный штамм Bacillus sp. JF8, использующий бифенил в качестве единственного источника углерода и энергии при 60 С и осуществляющий деструкцию ряда хлорбифенилов, несущих от одного до пяти заместителей в молекуле [267]. Из арктических почв, загрязненных ПХБ, выделены психротолерантные микроорганизмы, осуществляющие утилизацию бифенила и трансформацию таких смесей ПХБ как Aroclor 1221 и Aroclor 1242. Температурный оптимум максимальной деструктивной активности данных штаммов при деградации Aroclor 1221 составлял 7 С [50, 197, 198].

Помимо аэробных бактерий значительную роль в деструкции ПХБ играют анаэробные микроорганизмы [10,. 48, 205, 301, 302]. Анаэробные штаммы-деструкторы осуществляют восстановительное дехлорирование смесей ПХБ, содержащих в молекуле от 4 до 9 заместителей. Уровень деградации высокохлорированных бифенилов бактериями зависит как от внешних условий, так и от расположения заместителей в молекуле бифенила. Наиболее эффективно анаэробными бактериями осуществляется деструкция мета- и ляря-хлорированных бифенилов.

Способность к утилизации бифенила до соединений, включающихся в основной обмен, изучена у ряда почвенных бактерий рода Pseudomonas, в частности у P. putida KF715 [221], P. Jluorescens [111], P. pseudoalcaligenes KF707 [285], Pseudomonas sp. P20 [167], Pseudomonas sp. KKS102 [119, 285], Pseudomonas sp. DJ-12 [168], а также у представителей родов Alcaligenes, Corinebacterium, Rhodococcus, Sphingomonas, Mycobacterium [87, 208, 269, 273, 285, 303]. Обнаружена способность ряда штаммов-деструкторов бифенила к деградации других ароматических углеводородов, содержащих в своей молекуле одно или два и более конденсированных ароматических колец, таких как бензол, толуол, фенол, нафталин, фенантрен [2, 87, 170, 269]. Позднее была обнаружена способность бактерий, утилизирующих бифенил, осуществлять деструкцию дибензофурана [63, 258, 273].

Для большинства штаммов-деструкторов бифенил а характерна способность к полной или частичной деградации ПХБ. Способность к росту на моноХБ описана для бактерий родов Alcaligenes, Burkholderia, Pseudomonas [167, 170, 230, 241, 285]. Известно, что в процессе трансформации моноХБ не всегда происходит их полная утилизация. Описано лишь несколько природных штаммов, способных расти на монохлорбифенилах и соответствующих хлорбензоатах. Так, Pseudomonas sp. МВ86, Pseudomonas cepacia PI66 и Burkholderia sp. SK-3 способны использовать в качестве ростового субстрата 4-хлорбифенил, осуществляя при этом утилизацию образующейся 4ХБК [52, 53, 168, 285].

Способность к деструкции ди-, три-, тетра- и пентахлорированных изомеров ПХБ обнаружена у бактерий родов Acinetobacter, Alcaligenes, Arthrobacter, Burkholderia, Cellulomonas, Corynebacterium, Pseudomonas, Rhodococcus [55, 122, 133, 145, 213]. Bedard и Haberl описан метаболизм ряда ди- и триХБ у восьми штаммов, обладающих широким деградативным потенциалом. По характеру деструкции ПХБ штаммы разделены на 4 группы. Штаммы первой и второй групп Pseudomonas sp. HI 130, P. testosteroni H430, P. cepacia H201, Alcaligenes faecalis РІ434 и Corynebacterium sp. MB1 предпочтительнее окисляли изомеры ПХБ, содержащие заместителей в мета-положении, а штамм P. testosteroni Н336, помещенный в третью группу, был более активен по отношению к яяря-замещенным кольцам ПХБ. Четвертая группа представлена двумя штаммами Burkholderia sp. LB400 и Rhodococcus sp. RHA1. Для данных штаммов характерно предпочтительное окисление 2- 2,5- 3-» 2,4- 4-хлорзамещенных колец молекулы хлорбифенила. Штаммы LB400 и RHA1 способны деградировать значительное количество изомеров ПХБ [65]. Наиболее изученным является Burkholderia sp. LB400 [68, 69]. Описана способность данного штамма к эффективной деструкции как промышленных смесей ПХБ, так и отдельных хлорпроизводных бифенила. Штамм LB400 способен к росту на моноХБ, используя в качестве источника углерода один из продуктов деструкции монохлорбифенилов нехлорированную пентадиеновую кислоту [238].

В настоящее время среди описанных бактерий-деструкторов ПХБ известен лишь один природный штамм Burkholderia sp. SK-3, способный осуществлять полную утилизацию дихлорбифенила, несущего по одному заместителю в каждом из колец молекулы (2,4 -диХБ). В процессе роста штамма SK-3 на 2,4 -диХБ в среде не было обнаружено 2ХБК или 4ХБК, но происходило накопление хлорид-иона в количестве, соответствующем полной минерализации 2,4 -дихлорбифенила [169, 170].

С использованием методов генной инженерии создан ряд микроорганизмов, осуществляющих полную утилизацию хлорированных бифенилов [72, 95]. Штаммы Pseudomonas putida JHR и Pseudomonas sp. UCR2 осуществляют полную трансформацию 2-, 2,4- и 2,5-диХБ [143, 147]. Генетически модифицированный штамм Pseudomonas sp. КЕ150 способен расти, используя в качестве источника углерода и энергии 4-моноХБ, 3- и 4ХБК, 3,5ХБК, выделяя при этом в среду стехиометрическое количество ионов хлора [274]. Более эффективными деструкторами монохлорбифенилов являются рекомбинантные штаммы Comamonas testosteroni VP44 (рРСЗ) и VP44 (рЕ43), утилизирующие высокие концентрации (до 10 мМ) 2-моноХБ и4-моноХБ [154]. Однако, создание штаммов, несущих искусственно сконструированные метаболические пути утилизации хлорбифенилов, является достаточно сложным процессом [173, 225]. Так штаммы Pseudomonas putida КЕ210 и Burkholderia cepacia JHR22, утилизирующие 4-моноХБ и 2-моноХБ, соответственно, получены в результате объединения участков метаболических путей четырех различных штаммов-деструкторов [242].

Организация генетических систем деструкции полихлорбифенилов

В ряде работ было приведено объяснение механизма реакции гидролитического дехлорирования 4ХБК [84, 189, 190]. Дегалогенирование 4ХБК экстрактами из штаммов Pseudomonas sp. CBS3 и Acinetobacter sp. 4-СВ1 стимулировалось добавлением АТФ и коферментаА (КоА). В результате взаимодействия 4-хлорбензоата, КоА и АТФ синтезировался 4-хлорбензоил-КоА, гидролизующийся в последующей реакции до ПОБК и КоА [67, 78, 113] Присутствие в среде следовых количеств витаминов повышало дехлорирующую активность штаммов-деструкторов [15, 104].

Окислительное дегалогенирование. Реакция окислительного дегалогенирования ароматических соединений, представляющая собой энзиматическую реакцию, катализируемую оксигеназами, в которой атом хлора замещается на гидроксильную группу, была открыта Голдманом при изучении метаболизма 2-фторбензоата штаммами рода Pseudomonas [43]. Реакции окислительного дехлорирования наблюдались при метаболизме 2ХБК штаммами Pseudomonas cepacia 2CBS, P. aeruginosa JB2, P. aeruginosa 142, P. cepacia K3-2 [32, 40, 112, ИЗ]. Диоксигеназы, катализирующие реакции дехлорирования у данных штаммов, представляют собой многокомпонентные ферментативные системы. Дехлорирование 2ХБК и ряда других галозамещенных ор/ио-бензоатов штаммом P. cepacia 2CBS катализировала двухкомпонентная ферментная система 2-галобензоат 1,2-диоксигеназа, представляющая собой 1,2-гидроксилирующий, дегалогенирующий, декарбоксилирующий фермент [247]. В процессе окислительного дехлорирования происходит расщепление 2ХБК до пирокатехина с отщеплением иона хлора (рис. 46).

Клеточные экстракты P. aeruginosa 142 осуществляли деградацию 2,4ХБК, 2ХБК и ряда других замещенных о/?то-галобензоатов с превращением их в 4-хлоркатехол или катехол. Диоксигеназа штамма P. aeruginosa 142 представляет собой трехкомпонентную систему. Один из компонентов охарактеризован как ферредоксин, проявляющий высокую гомологию с аминокислотными последовательностями ферредоксинов нафталин- и бифенил-трехкомпонентных диоксигеназных систем. Предполагается, что двумя другими компонентами являются NADH-зависимая ферредоксин-редуктаза и терминальный компонент 0/?/ио-галобензоат-1,2-диоксигеназы [250].

Восстановительное дегалогенирование. Реакция восстановительного дегалогенирования в большинстве случаев протекает в анаэробных условиях и зависит от присутствия восстановителя. В ходе данной реакции происходит замещение атома галогена в ароматическом кольце на атом водорода. Возможность восстановительного дехлорирования .метя-хлорбензоатов впервые была продемонстрирована в 1982 г. на примере метаногенного консорциума микроорганизмов [43]. После полного удаления атомов хлора происходило расщепление ароматического кольца с образованием метана и двуокиси углерода. Позже были выделены и описаны индивидуальные микроорганизмы и микробные сообщества, осуществляющие восстановительное дегалогенирование 2ХБК и ЗХБК [103, 129, 139, 178, 205, 264, 281]. Восстановительное дехлорирование происходило также на первой стадии аэробной биодеградации 2,4ХБК штаммом Alcaligenes denitrificans NTB-1 (рис. 4в) [249, 289]. В результате восстановительного дегалогенирования 2,4-дихлорбензоата образуется 4ХБК, которая далее гидролизуется до ПОБК.

В результате ферментативного дегалогенирования и окисления хлорбензоатов на ранних этапах подготовительного метаболизма осуществляется трансформация ХБК до пирокатехина (катехола) или протокатеховой кислоты (рис. 4а-в) [18,307].

Разрыв ароматического кольца образовавшихся метаболитов осуществляют диоксигеназы. При этом в субстрат включается молекулярный кислород [140]. Известно, что для данной реакции не требуется дополнительный донор водорода, такой, как NADPH [12, 18, 100]. Разрыв происходит между двумя соседними гидроксильными группами и приводит к образованию дикарбоновой кислоты. Из участвующих в процессе ферментов лучше всего изучены ферменты, выделенные из разных видов Pseudomonas [9].

Катехол расщепляется с помощью орто-пирокатехазы (катехол-1,2-диоксигеназы), а ПКК - при участии протокатехат-3,4-диоксигеназы. Образующиеся при этом промежуточные продукты - цис, 2/ис-муконовая и З-карбокси-г/wc, г/ис-муконовая кислоты - в ходе дальнейшего катаболизма проходят через этап общего для них обоих продукта - 3-оксоадипиновой кислоты. Последняя активируется КоА-трансферазой и расщепляется с образованием сукцинил-КоА и ацетил-КоА, которые подвергаются дальнейшим превращениям в ходе промежуточного обмена [9, 70,134,277].

Для двух бактерий Azoarcus evansii и Bacillus stearothermophilus описан путь трансформации бензойной кислоты, значительно отличающийся от 3-оксоадипативного, но приводящий к образованию 3-оксоадипата. В результате ряда ферментативных превращений бензоил-КоА, образовавшийся из бензоата, трансформируется до 2,3-дегидроадипил-КоА, через стадию 6-гидрокси-З-гексоноил-КоА. В результате гидратации 2,3-дегидроадипил-КоА образуется 3-оксоадипил-КоА [128, 310].

Как было сказано выше, отщепление галогена от молекулы ХБК может происходить после расщепления ароматического кольца. Связь углерод-галоген становится лабильной после присоединения атома кислорода к углероду, связанному с галогеном, с образованием галогензамещенных катехолов.

Хлоркатехолы разрушаются путем орто-расщепления, так как оказывают ингибирующее действие на ферменты мета-пут. Однако, штамм P. putida GJ31 осуществлял трансформацию 3-хлоркатехола по пути мета-расщепления [195]. В процессе роста штамма Pseudomonas putida WR201 на ЗХБК была обнаружена активность ферментов орто- и мета-путп расщепления субстрата [117]. Обычные пирокатехазы расщепляют галогензамещенные катехолы с относительно низкой эффективностью, поэтому основное значение в деградации этих соединений приобретает раскрытие кольца. На последующих этапах метаболизма, включая изомеризацию, происходит отщепление оставшихся заместителей.

.Для многих почвенных бактерий, разлагающих хлорароматические соединения, характерен модифицированный орто-путь [236, 242].

Известно, что ферменты классического opmo-пути, синтезирующиеся у многих микроорганизмов при росте на незамещенных ароматических субстратах, характеризуются узкой субстратной специфичностью и не способны к эффективному использованию галогенированных аналогов. Ферменты модифицированного opmo-пути характеризуются более широкой субстратной специфичностью и высоким сродством к галогенированным субстратам и продуктам их разложения [138].

Выделение и идентификация штаммов-деструкторов бифенила

Установлено, что большая часть штаммов-дестукторов бифенила представлена грамотрицательными бактериями (18 штаммов),а к грамположительным относятся только 7 штаммов (см. приложение 3,4).

Колонии грамотрицательных штаммов Р22, Р23, Р24, В2, В7, В8, В106, Gl, Gil, G12 и G13 круглые, ровные, светло-зеленые, выпуклые, блестящие, среднего размера. Клетки данных штаммов не изменяются по морфологии в течение жизненного цикла и представляют собой мелкие, одиночные, подвижные палочки правильной формы с закругленными концами. На основании морфо-физиологических и биохимических признаков данные штаммы отнесены к роду Pseudomonas (см. приложение 3) [30]. Штаммы Р23, В7 и G12, в отличие от штаммов В106 и G13, способны к гидролизу желатина, обладают лецитиназной и амилазной активностью. На основании вышеперечисленных признаков штаммы Р23, В7 и G12 отнесены к виду P.fluorescens, а штаммы В106 и G13 - к виду P. putida. Штаммы Р22, Р24 и G11 способны к гидролизу желатина, не осуществляют денитрификацию, не обладают амилазной активностью, способны использовать в качестве источника азота нитрат и растут при +4 С, что позволяет отнести их к виду P.facilis. Видовая принадлежность штаммов В2, В8 и G1 не установлена.

Штаммы грамотрицательных бактерий S210 и Р39 образуют на среде LB неокрашенные колонии, обладают палочко- или кокковидными клетками. Покоящиеся стадии не обнаружены. Данные штаммы идентифицированы как представители рода Alcaligenes, так как обладают характерными для микроорганизмов данного рода физиологическими и биохимическими характеристиками (см. приложение 3) [30].

Клетки грамотрицательных штаммов Р38 и G14 - палочки с закругленными концами, при росте на плотных средах образуют просвечивающие, округлые, слабо выпуклые, гладкие и блестящие колонии. Каталазо-, оксидазо- и фосфотазоположительные. Из углеводов образуют кислоты. На основании полученных данных (см. приложение 3) штаммы отнесены к роду Flavobactehum. Штамм Р38 образует индол, не разлагает крахмал, не восстанавливает нитраты и образует кислоту из глюкозы, но не из арабинозы и ксилозы, идентифицирован как F. breve [30].

Грамотрицательные штаммы S211 и S212 представлены подвижными палочковидными клетками (см. приложение 3). На плотной полноценной среде формируют светло-желтые, блестящие, непрозрачные круглые колонии. Оксидазо- и каталазоположительные. Облигатные аэробы, брожение не осуществляют. По культурально-морфологическим и биохимическим признакам штаммы отнесены к роду Comamonas [30]. Клетки штамма S214 окрашиваются по Граму отрицательно, на плотных средах формируют округлые, слабо выпуклые, морщинистые, блестящие колонии (см. приложение 3). При росте на плотной среде с тирозином штамм продуцирует темно-коричневый, диффундирующий пигмент, флуоресцирующие пигменты не отмечены. На основании исследованных признаков штамм отнесен к роду Flavimonas [30]. Два грамположительных штамма-деструктора бифенила Р29 и В107 идентифицированы как Arthrobacter sp. [20, 29, 30]. Они обладают характерными для микроорганизмов данного рода морфологией колоний и клеток, морфогенетическим циклом, а также физиолого-биохимическими особенностями (см. приложение 4). Кроме того, в клеточной стенке данных штаммов присутствуют лизин, глюкоза и галактоза, но отсутствуют миколовые кислоты.

Из исследуемых штаммов-деструкторов, два грамположительных организма (Р27, Р28) идентифицированы как Cellulomonas sp. Молодые культуры состоят из тонких палочек, иногда сгруппированных в пары V-образной конфигурации. Образование мицелия не отмечено. Колонии на плотных средах желтые, выпуклые, блестящие, непрозрачные. Хемоорганотрофы, обладающие дыхательным и бродильным типами метаболизма. Каталазоположительные, целлюлолитические, восстанавливают нитрат до нитрита. Физиологические и биохимические характеристики соответствуют роду Cellulomonas (см. приложение 4) [30].

Грамположительные аэробные штаммы Р26 и В51 в молодых культурах представлены клетками неправильной формы, но четкий цикл палочка-кокк отсутствует. Хемоорганотрофы (см. приложение 4). Способны к росту в микроаэрофильных условиях. Анализ метанолизатов целых клеток показал отсутствие миколовых кислот. Диаминокислота клеточной стенки представлена орнитином, а сахара - галактозой и рамнозой. В составе пептидогликана штамма В51 присутствует орнитин, аланин, глицин, гомосерин, глутаминовая и гидроксиглутаминовая кислоты в соотношении 1.0 : 1.1 : 3.0 : 0.7 : 0.3 : 0.7, соответственно. Подобный состав аминокислот пептидогликана характерен для пептидогликана типа В2{3 и описан в настоящее время только у нескольких видов рода Microbacterium [278]. Преобладающие изопреноидные хиноны дыхательной цепи - менахиноны с негидрированной одиннадцатизвенной изопреноидной цепочкой (МК-11). На основании исследованных признаков штаммы отнесены к роду Microbacterium [30, 278].

Клетки грамположительного штамма-деструктора Р25 отличаются по морфологии в разные стадии жизненного цикла. Клетки культур 16-20-часового возраста длинные, обильно ветвящиеся, к 28-32 часам роста нити фрагментируются до кокковидных овальных клеток. На полноценных питательных средах колонии оранжево-красные, на селективных - розово-оранжевые, круглые, выпуклые, непрозрачные, матовые. Воздушный мицелий не образует. Хемоорганотроф (см. приложение 4). В клеточной стенке присутствуют мезо-диаминопимелиновая кислота, арабиноза и галактоза, что соответствует IV типу клеточной стенки. Анализ метанолизатов целых клеток на наличие миколовых кислот показал, что хроматографическая подвижность липида LCN-A штамма Р25 на 97 % соответствует хроматографической подвижности липида LCN-A Rhodococcus ruber. На основании культурально морфологических и физиолого-биохимических признаков штамм Р25 отнесен к роду Rhodococcus [29,30].

Таким образом, выделенные грамотрицателъные штаммы-деструкторы бифенила являются представителями родов Pseudomonas, Alcaligenes, Comamonas, Flavobacterium и Flavimonas, а грамположительные - родов Arthrobacter, Cellulomonas, Microbacterium и Rhodococcus.

Особенности трансформации хлорбифенилов выделенными бактериями

Разложение полихлорбифенилов в объектах окружающей среды представляет собой комбинированный анаэробно-аэробный процесс [48]. В результате анаэробной трансформации высокохлорированных изомеров ПХБ, происходит накопление хлорированных бифенилов с меньшим содержанием заместителей в молекуле. Основными продуктами анаэробной микробной деструкции являются изомеры ПХБ, несущие атомы хлора в орто- и/или пара-положении [240, 261]. Дальнейшая трансформация данных полихлорированных бифенилов осуществляется аэробной микрофлорой. Известные бактерии-деструкторы ПХБ значительно отличаются спектром разлагаемых ими изомеров ПХБ. Большинство описанных в литературе штаммов окисляют пара-замещенное кольцо в молекуле ПХБ [65, 235, 285]. Однако, микроорганизмы, которые предпочтительнее атакуют о/?то-хлорированные кольца, обладают большей деградативной активностью по отношению к различным индивидуальным ПХБ [48, 192, 207]. Установлено, что спектр изомеров ПХБ, трансформируемых микроорганизмами, и глубина разложения данных изомеров в значительной степени зависят от особенностей активности ферментов деструкции ПХБ бактериальных штаммов [255, 256, 259, 260]. Поэтому изучение новых микроорганизмов-деструкторов с необычными и уникальными свойствами разложения полихлорированных бифенилов остается актуальным.

При поиске и изучении деградативных активностей выделенных штаммов в качестве модельных соединений были использованы 2,4 -диХБ, 2,4,2 - и 2,4,4 -триХБ, содержащие заместителей в орто- и ла/?я-положениях [192].

Двадцать восемь отобранных для исследования штаммов проявлют активность по отношению к 2,4 -диХБ, однако характер окисления и степень деструкции данного соединения у штаммов различается. На основании анализа данных по аккумуляции продуктов окисления 2,4 -дихлорбифенила все штаммы разделены на три группы (табл. 4, 5, 6).

В первую группу включены 10 штаммов, у которых в процессе деструкции 2,4 -диХБ в среде отмечено накопление ГОФДК (1 =397 нм), но не зафиксирована аккумуляция хлорбензойных кислот (табл. 4). Основываясь на полученных результатах можно сказать, что бактерииальные штаммы, входящие в данную группу, осуществляют окисление пара-хлорированного кольца молекулы 2,4 -дихлорбифенила по 2 и 3 атомам углерода, так как известно, что ГОФДК с Хтах=397 нм (3,8-диС1 ГОФДК) образуется в результате 2,3-диоксигенирования иоря-замещенного кольца 2,4 -диХБ (см. приложение 1) [65, 192, 259, 260]. Аккумуляция больших количеств данного интермедиата обусловлена, вероятно, высокой активностью бифенил 2,3-диоксигеназы (BphA) штаммов первой группы (за исключением BphA штаммов Р38 и Р39) по отношению к ия/?а-замещенному кольцу 2,4 -диХБ и низкой ГОФДК гидролазной активностью. Невысокая активность ГОФДК гидролаз (BphD) штаммов I группы может быть обусловлена ингибирующим эффектом, который, как известно из литературы, оказывает присутствие атома хлора в 3 положении в молекуле ГОФДК [255]. Известно, что большинство описанных в литературе бактерий, разлагающих ПХБ, также предпочтительнее осуществляют 2,3-диоксигенирование ляря-замещенного кольца молекулы 2,4 -диХБ до 3,8-диС1 ГОФДК или осуществляют дальнейшую деструкцию образовавшихся интермедиатов до 2ХБК (см. приложение 1) [65, 192]. Так, штаммы Pseudomonas cepacia Н201 и Corynebacterium sp. МВ1 {Rhodococcus globerulus P6) разлагают 2,4 -диХБ до 2ХБК, окисляя шра-хлорированное кольцо данного хлорбифенила [65]. По-видимому, у штаммов, осуществляющих деструкцию 2,4 -диХБ до 2ХБК, ГОФДК гидролаза устойчива к ингибирующему действию 3,8-диС1 ГОФДК. Однако данные штаммы оказываются неактивными по отношению к высокохлорированным изомерам ПХБ [192, 207].

У нескольких штаммов первой группы исследована способность к деструкции трихлорированных бифенилов (табл. 7, 8). Анализ продуктов разложения 2,4,4 -триХБ, образовавшихся в результате трансформации данного соединения штаммом P. facilis Р24, позволяет предположить, что бифенил диоксигеназа штамма Р24 активно окисляет моно-хлорированное кольцо молекулы 2,4,4 -триХБ по 2 и 3 положению, что приводит к образованию 3,8,10-триС1 ГОФДК (см. приложение 1). В результате гидролиза данного изомера ГОФДК обнаружено накопление 2,4ХБК (около 50 %). По-видимому, присутствие заместителя у 10 атома углерода в молекуле ГОФДК снимает ингибирующую активность 3-С1 в ГОФДК для BphDp24, и способствует повышению гидролазной активности данного фермента по отношению кЗ,8,10-триС1 ГОФДК. Известно, что 10-С1 ГОФДК является легко доступным субстратом для ВрЮ штаммов LB400 и Р6. Для штаммов LB400 и Р6 также высказано предположение, что присутствие заместителя в 10 положении в хлорированных ГОФДК увеличивает афинность ВрШрб и ВрШьшоо к данным изомерам ГОФДК [255].

Штаммы P.facilis Р24 и Flavobacterium breve Р38 разлагают 2,4,2 -триХБ накапливая 2,4ХБК (6.8 и 30.8 % за 24 часа, соответственно) (табл. 7). Вероятно, BphA штаммов Р24 и Р38 осуществляет 2,3-диоксигенирование моно(о/?/ио)-хлорированного кольца молекулы 2,4,2 -триХБ (см. приложение 1). Так как накопление продукта л еша-расщепления 2,4,2 -триХБ не отмечено, можно предположить, что образовавшаяся 8,10-диС1 ГОФДК полностью гидролизуется BphD до 2,4ХБК. Исследования, проведенные Seah с коллегами, показали, что наличие заместителя в фенольной части молекулы ГОФДК не препятствует ее гидролизу ВрШрб и ВрШьв40о, причем наиболее доступными для действия ГОФДК гидролаз являются 9-С1 и 10-С1 замещенные изомеры ГОФДК [255, 256]. Таким образом, высказанное нами предположение согласуется с литературными данными. Бифенил диокигеназа штамма P. putida G13 не проявляла активности к 2,4,2 -триХБ.

Похожие диссертации на Исследование аэробных бактерий, разлагающих полихлорированные бифенилы и хлорбензойные кислоты

Использование гуминовых кислот почвенными бактериямиПостникова Мария Александровна

Поиск и исследование природных штаммов-деструкторов 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислотыЖуренко Евгения Юрьевна

Влияние озонированного физиологического раствора на вирулентность синегнойных бактерий (экспериментальное исследование)Кувакина Нина Аркадьевна

Исследование комплексообразования метаболитов бактерий рода pseudomonasСулейманова Лина Ринатовна

Исследование комплексообразования метаболитов бактерий рода PseudomonasСулейманова Лина Ринатовна

Исследование морфо-функциональной реакции бактерий на различные воздействия с использованием атомно-силовой микроскопииВасильченко, Алексей Сергеевич

Распределение рибосомного материала бактерий в организме животного (радиоизотопное исследование)Кошелева Светлана Владимировна

Исследование структурно-функционального состояния бактерий в микробных сообществах методами электронной микроскопииБаринова Екатерина Сергеевна

Сравнительное исследование О- и Н-антигенов почвенных бактерий рода Azospirillum Бурыгин Геннадий Леонидович

Исследование роли тиоловых редокс-систем в SOS-ответе у бактерий Escherichia coliУшаков Вадим Юрьевич