Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Краткая характеристика органического вещества почвы 9
1.1. Строение гумусовых кислот 10
1.2. Функциональные группы гуминовых веществ 13
1.3. Формы связи гуминовых веществ с минеральными компонентами почвы 14
Глава 2. Биосферные функции гуминовых кислот 17
Глава 3. Гуминовые вещества и микроорганизмы 22
3.1. Использование гуминовых веществ микроорганизмами 22
3.2. Физиологическое действие гуминовых кислот на живые клетки 34
3.3. Препараты на основе гуминовых веществ 36
Глава 4. Некоторые химические и микробиологические свойства бурых углей 41
4.1. Формирование бурых углей 41
4.2. Роль микроорганизмов в генезисе бурого угля 44
4.3. Состав бурых углей 45
4.4. Структура бурых углей 47
4.5. Микроорганизмы бурого угля 48
Объекты и методы исследования: 50
Объекты исследования: 50
Биологические объекты исследования 51
Методы исследования: 52
- Функциональные группы гуминовых веществ
- Использование гуминовых веществ микроорганизмами
- Препараты на основе гуминовых веществ
- Состав бурых углей
Введение к работе
Сравнение молекулярно-массового распределения, а также элементного состава гуминовых кислот до и после воздействия на них бактерий.
3. Изучение использование бактериями гуминовой кислоты, находящейся на поверхности частиц бурого угля.
4. Исследование сохранения жизнеспособности бактерий в препарате гуминовых кислот.
Научная новизна: Впервые исследовано разложение гуминовых кислот из чернозема, дерново-подзолистой почвы и бурого угля чистыми культурами бактерий и нативным почвенным бактериальным комплексом при помощи современных газохроматографических методов. Установлено, что гуминовые кислоты разлагаются довольно интенсивно всеми исследованными бактериями вне зависимости от их систематического положения. Показано, что выделенный из почвы нативный бактериальный комплекс использует гуминовые кислоты в 4 раза интенсивнее, чем чистые культуры бактерий, а в условиях кометаболизма в 10 раз интенсивнее.
Гуминовая кислота, адсорбированная на каолините, используется с той же интенсивностью, что и свободная.
Впервые при помощи газохроматографических методов показано, что почвенные бактерии не только присутствуют в значительных количествах в буром угле, но и способны использовать гуминовые кислоты с поверхности частиц угля, причем интенсивность процессов эмиссии С02 и азотфиксации ниже, чем при использовании бактериями гуминовых кислот, выделенных из почвы и бурого угля. углерода и по интенсивности процесса азотфиксации растущими на них микроорганизмами.
Практически не изучено использование почвенными бактериями гумусовых кислот, адсорбированных на поверхности глинистых минералов, хотя в почве они находятся в значительных количествах именно в таком состоянии.
Изучение процессов использования почвенного гумуса бактериями с помощью современных газохроматографических методов позволит более точно подойти к оценке баланса гумуса в почве и сохранении его запасов, расширит наши знания о катаболизме гуминовых кислот почвенными бактериями, поможет в разработке бактериальных удобрений на основе препаратов гуминовых кислот из бурого угля и теоретическом обосновании действия этих препаратов на растения.
Цель работы. Целью настоящей работы является изучение использования гуминовых кислот почвенными бактериями, а также оценка интенсивности этого процесса с применением газохроматографических методов.
Задачи исследования:
1. Исследование способности к росту чистых культур почвенных бактерий и нативного бактериального комплекса на препаратах гуминовых кислот, в качестве единственного источника углерода и азота, а также в условиях кометаболизма.
2. Оценка интенсивности дыхания и азотфиксации бактерий при росте на свободных и адсорбированных на каолините гуминовых кислотах.
3. Сравнение молекулярно-массового распределения, а также элементного состава гуминовых кислот до и после воздействия на них бактерий.
4. Изучение использование бактериями гуминовой кислоты, находящейся на поверхности частиц бурого угля.
5. Исследование сохранения жизнеспособности бактерий в препарате гуминовых кислот.
Научная новизна: Впервые исследовано разложение гуминовых кислот из чернозема, дерново-подзолистой почвы и бурого угля чистыми культурами бактерий и нативным почвенным бактериальным комплексом при помощи современных газохроматографических методов. Установлено, что гуминовые кислоты разлагаются довольно интенсивно всеми исследованными бактериями вне зависимости от их систематического положения. Показано, что выделенный из почвы нативный бактериальный комплекс использует гуминовые кислоты в 4 раза интенсивнее, чем чистые культуры бактерий, а в условиях кометаболизма в 10 раз интенсивнее.
Гуминовая кислота, адсорбированная на каолините, используется с той же интенсивностью, что и свободная.
Впервые при помощи газохроматографических методов показано, что почвенные бактерии не только присутствуют в значительных количествах в буром угле, но и способны использовать гуминовые кислоты с поверхности частиц угля, причем интенсивность процессов эмиссии С02 и азотфиксации ниже, чем при использовании бактериями гуминовых кислот, выделенных из почвы и бурого угля.
Практическая значимость: Полученные результаты могут быть использованы при балансовых расчетах количества диоксида углерода выделяющегося из почвы за счет разложения гумуса. Полученные результаты о численности и структуре бактериального комплекса в буром угле и препарате гуминовой кислоты из бурого угля, а также сохранении жизнеспособности бактерий в препарате гуминовой кислоты из бурого угля помогут в разработке новых бактериальных удобрений на основе препарата гуминовой кислоты - «Бактогумуса».
Функциональные группы гуминовых веществ
Гуминовые вещества содержат около 15 различных видов функциональных групп, среди которых наибольшее значение имеют карбоксильные группы, фенольные группы и аминогруппы. Количественное содержание многих групп и их роль в органоминеральных взаимодействиях окончательно не выяснены (Драгунов и др., 1948; Ziechmann, 1993; Орлов, 1997). Количественно или качественно установлено, что гуминовые вещества содержат следующие функциональные группы: аминогруппы -NH2, амидные R-C(0)-NH2, спиртовые R-CH2-ОН, альдегидные -R-CHO, карбоксильные -R-C(0)-OH и др. Таким образом, молекулы гумусовых кислот представляют собой рандомизированные полимеры ароматических и алифатических структурных фрагментов, содержащих разнообразные функциональные группы, способные вступать в химические реакции с многими химическими веществами, поступающими в почву.
Удобная группировка форм связей гуминовых веществ с минеральными компонентами при образовании органоминеральных соединений была предложена Л.Н. Александровой (1980), которая различала следующие их виды:
1) гетерополярные соли; 2) комплексно-гетерополярные соли; 3) сорбционные комплексы.
Гетерополярные соли гумусовых кислот Гумусовые кислоты вступают в реакцию нейтрализации с образованием простых гетерополярных солей (гуматов и фульватов) (ГК - гуминовая кислота):
ГК - (СООН) n + n Na ОН - ГК - (COONa) n + n Н20 Образование солей возможно не только при реакции нейтрализации, но и при реакции катионного обмена:
ГК - (COO )2 Са + Mg - ГК - (COO )2 Mg + Са Для почв, насыщенных основаниями, характерно накопление гуматов кальция и гуматов магния.
Гуматы кальция очень плохо растворимы в воде при любых встречающихся в почвах значениях рН (вплоть до рН 12). Образование гетерополярных солей гумусовых кислот с катионами кальция могут вызвать формирование мостиков между гумусовыми кислотами и глинистыми минералами. Роль мостиков выполняют катионы кальция:=
Гуматы кальция, будучи нерастворимыми, могут выпадать в осадок и образовывать пленки на поверхности почвенных частиц. Такого рода пленки образуют прочные связи с минеральными компонентами почвы за счет адгезионных сил. В связи с этим соли гуминовых кислот труднее поддаются микробному воздействию.
Индивидуальные гуматы или фульваты различных металлов в почве встречаются редко. Чаще формируются сложные органоминеральные производные, которые преимущественно относятся к группе комплексно-гетерополярных соединений.
Комплексно-гетерополярные соли В настоящее время установлено, что металлы образуют с гумусовыми кислотами комплексные соединения. В этих соединениях металл входит в состав анионной части молекулы и не способен к реакциям ионного обмена или образует хелаты, реагируя одновременно с двумя группами гумусовых кислот.
Кроме собственно гуминовых и фульвокислот комплексы с ионами металлов образуют многочисленные неспецифические органические соединения, в том числе низкомолекулярные органические кислоты. В их числе лимонная, щавелевая, кетоглутаровая, яблочная, янтарная и др. Их комплексообразующая способность сильно зависит от реакции среды.
Формирование комплексно-гетерополярных солей гумусовых кислот и неспецифических соединений имеет большое значение для трансформации минеральных компонентов почв, увеличения их подвижности и миграционной способности.
Адсорбционные комплексы
Под адсорбционными комплексами понимают продукты взаимодействия гуминовых веществ с кристаллическими и аморфными минералами почв или органоминеральные продукты поглощения гуминовых веществ минералами.
Образование адсорбционных комплексов возможно за счет межмолекулярных связей (собственно адсорбция) и за счет ионных и координационных связей (хемосорбция) (Орлов, 1990). .
Стивенсоном (Stevenson, 1994) было исследовано взаимодействие гумусовых кислот с глинистыми минералами. Результаты исследований показали, что гумусовые кислоты адсорбируются на глинистой поверхности и там накапливаются. В свою очередь, глинистые минералы активизируют абиотическую полимеризацию адсорбируемых гумусовых кислот; кислоты проникают внутрь минералов и становятся недоступными почвенным микроорганизмам.
По результатам проведенных исследований было установлено распределение гумусовых кислот по фракциям почвенных частиц различных плотностей и размеров. Наименьшие концентрации гумусовых кислот были обнаружены в песчаной фракции, более высокие - в пылеватой и наивысшие - во фракции илистых частиц (Young, 1979; Laird, 2001).
Использование гуминовых веществ микроорганизмами
Микроорганизмы оказывают значительное влияние на органическое вещество почвы. В отсутствии их активной деятельности значение органического вещества существенно снижается и сводится лишь к некоторому улучшению физических и химических свойств данной почвы по сравнению с почвой, полностью лишенной органического вещества. Положительное воздействие органического вещества на почвенную экосистему обусловлено, прежде всего, активным метаболизированием его микроорганизмами. Питательные вещества из растительной биомассы, поступающие в почвенную экосистему, минерализуются микроорганизмами и становятся доступными для растений (Тейт, 1991). Молекулы гумусовых кислот представляют собой наиболее сложные из встречающихся в природе молекул, поэтому они слабо подвергаются разложению почвенными микроорганизмами.
Ранее изучение разложения гуминовых веществ бактериями проводили на силикатных гелевых пластинках, пропитанных гуматами, и в жидких средах с гуминовыми кислотами (Никитин, 1960; Теппер, 1976; Туев, 1989). Об активности процесса судили, главным образом, по обесцвечиванию питательной среды. При этом гуминовые кислоты использовались как в качестве единственного источника углерода и азота, так и вместе с другими источниками углерода и азота.
Кудриной (1951) было также выяснено, что гуминовые кислоты используются Bacillus megatherium, азотобактериями, миксобактериями, плесневыми грибами и актиномицетами в качестве единственного источника углерода и азота. Также было высказано предположение о том, что исследуемыми микроорганизмами отщепляются только боковые цепи от молекулы гуминовой кислоты.
Процессы синтеза и распада гуминовых веществ исследовал Виноградский (1952). Он считал, что в почве идут два противоположно направленных процесса - разложение свежих органических остатков (растительных, животных и др.) с образованием гуминовых веществ и минерализация последних. Им была выдвинута гипотеза о существовании в почве двух групп микроорганизмов, вызывающих их - автохтонной и зимогенной микрофлоры. Для проверки деятельности автохтонных микроорганизмов, Виноградский поставил лабораторные опыты по разложению гелевых пластин, пропитанных, гуматом кальция. На поверхности пластин были разложены комочки почвы, вокруг которых постоянно наблюдался рост кокковых форм микробов и неспороносных палочек. Доказательством их деятельности служило не только массовое появление этих форм микробов на кальциевых гуматах, но и обесцвечивание питательной среды, что свидетельствовало об использовании гуминовых веществ. Виноградский выделил эти бактерии в особый род - Bactoderma. Однако ему не удалось выделить их в чистые культуры и проверить их способность к разложению гуматов. В дальнейшем многие исследователи изучали разложение гуминовых кислот микроорганизмами методом гелевых пластин, что привело к выявлению этой способности у нокардий (Теппер, 1976; Stevenson, 1982) и актиномицетов (Федоров, Ильина, 1963; Didier, 1956). Они показали, что только некоторые виды актиномицетов слабо развиваются на гуматах, однако процесс этот происходил довольно медленно.
Баргес и Леттер (Burges, Latter, 1960) выявили способность некоторых представителей грибов активно разлагать гуминовые вещества, используя их как единственный источник углеродного и азотного питания. Наиболее активными, по их данным, оказались грибы представители родов Spicario и Polystictus. На агаровых пластинах с гуматами эти авторы наблюдали зоны обесцвечивания гумуса вокруг колоний грибов. Количественные изменения гумуса под воздействием этих грибов Баргес и Леттер исследовали в перколяторе. После восьмимесячного культивирования их в почве с добавление спор Spicario разложилось 44% гумуса, а с добавлением спор Polystictus - 42.8%. В опытах с гуматами на жидких средах эти исследователи наблюдали аналогичную картину. Описанные выше опыты интересны, но к ним надо подходить осторожно, так как известно, что гифы грибов обладают способностью адсорбировать гумусовые вещества на своей поверхности, что может привести к существенной ошибке.
Работы Кюстера (Ktister, 1952), Фляйга и Шмидта (Flaig, Schmidt, 1957) также показали, что некоторые виды грибов рода Penicillium, выделенные из почв, богатых гумусом, способны использовать азот гуминовой кислоты. Однако авторы отмечают, что эта способность весьма ограничена. В опытах Фляйга и Шмидта за пять месяцев грибы рода Penicillium усвоили не более 4% азота гумуса. Углерод гумусовых веществ они использовать не могли.
Процесс биодеградации гумусовых кислот в питательных средах идет очень медленно. Кудриной (1951) было высказано предположение о том, что исследуемые ею бактерии родов Azotobacter и Bacillus отщепляют только боковые цепи молекулы гуминовой кислоты. Однако Никитиным (1960) было показано, что возможен глубокий распад ароматического ядра гуминовой кислоты под влиянием псевдомонад. О разложении судили по обесцвечиванию среды с гуматами, процесс биодеградации гуминовых кислот шел очень медленно. Согласно данным Мишустина и Никитина (1961) азот гуминовой кислоты используется микроорганизмами на 2-10%, а углерод только на 2% за 14 суток.
Разложение другого компонента гумуса - фульвокислоты и ее комплексов с полуторными окислами - были изучены Аристовской (1958; 1965). В своей работе она использовала метод капиллярной микроскопии Перфильева и Габе (1961) в сочетании с методом питательных пластин, пропитанных фульвокислотами. Это позволило выявить широко распространенные в подзолистых почвах группы микроорганизмов, играющие существенную роль в подзолообразовательном процессе и способных разлагать фульвокислоты. Это бактерии рода Seliberia, Pedomicrobium, Metallogenium, Micromonospora и Bactoderma.
Позднее Бардвей и Гаур (Bhardwaj, Gaur, 1971) выделили из элективной среды с гуматами бациллы {Bacillus subtilis, В. brevis) и микроскопические грибы {Aspergillus fumigatus, A. niger, A. oryzae). Степень разложения гуматов авторы определяли по интенсивности обесцвечивания среды под действием микроорганизмов.
Таха с соавт. (Taha et. al., 1973) в питательную среду с гуматами вносили почвенную суспензию, инкубировали в течение 34 суток, затем из накопительной культуры производили посев на агаризованные питательные среды для отбора микроорганизмов, способных использовать гуматы как единственный источник углерода. Было отобранно 85 культур микроорганизмов, отнесенных к десяти родам: 50% из них были отнесены к роду Pseiidomonas, 9% - к роду Sarcina, 8% - к роду Bacillus и 6% - к роду Aeromonas, остальные бактерии принадлежали к другим родам.
Препараты на основе гуминовых веществ
Способность гуминовых кислот оказывать положительное физиологическое действие на живые клетки нашло свое практическое выражение в разработке и использовании экологически безопасных органоминеральных удобрений и регуляторов роста растений на основе препаратов гуминовых кислот, получаемых, главным образом, из бурого угля.
Эффект от применения препаратов гуминовых кислот выражается в положительном влиянии на прорастание семян, рост и развитие растений, содержание хлорофилла в листьях растений (Бобырь, 1982), концентрацию сахара в растениях, развитие микроорганизмов (Пироговская и др., 1993; Maggioni et al., 1988).
Действуя, как регуляторы процессов массообмена в почвенных системах, препараты гуминовых кислот могут усиливать мобилизацию питательных веществ из почвенных минералов, увеличивать доступность элементов питания растений, оказывать воздействие на миграцию растворенных веществ поровых растворов, способствовать иммобилизации элементов тяжелых металлов и радиоактивных элементов (Биотехнология - принципы и применение, 1988; Безуглова, 2004).
Работами многих исследователей (Гуминский, Гуминская, 1973; Гуминский, 1967; Горовая, 1984; Burns et. al, 1986; Hayes, Wilson, 1997), установлено, что гуминовые вещества, внесенные с удобрениями, улучшают физические свойства почв. Было установлено, что внесение углегуминовых удобрений положительно влияет на водно-физические свойства почвы: повышается капиллярная и полевая влагоемкость легких почв (в среднем на 20-30%) и водопроницаемость тяжелых, улучшается структура почвы и ее водопрочность, уменьшается плотность почвы. Почвы, куда вносились препараты гуминовых кислот, характеризуются лучшими условиями азотного и фосфатного режимов при накоплении в них гумусовых соединений за счет новообразования гуминовых кислот. При этом усиливается подвижность фосфора почвы; усиливаются процессы азотфиксации в почве, что способствует значительному увеличению общего и белкового азота и доступности растениям органического азота почвы; ускоряется поступление аммиачных и амидных форм азота, фосфора в растение, в результате наблюдается увеличение содержания азота и фосфора в растении и их вынос.
Однако наблюдаются и неблагоприятные факторы влияния гуминовых кислот на растения, а именно: увеличивается концентрация железа, кальция, алюминия при снижении количества магния, т.е. препараты гуминовых кислот оказывают существенное влияние на содержание и динамику почвенных катионов, кроме калия.
Еще одной особенностью этих удобрений является снижение или полное устранение отрицательного воздействия неблагоприятных для развития растений факторов: радиационная защита (Лукьяненко, Петриченко, 1975), защита от фитотоксичного действия гербицидов (Горовая, 1988), адсорбционные свойства по отношению к вредным примесям и пестицидам в почве (Пивоваров, 1962).
По данным Л.А. Христевой (1982), физиологическое действие препаратов гуминовых кислот более эффективно проявляется при неблагоприятных внешних воздействиях на растения или на среду их обитания (избыток или недостаток влаги, тепла, элементов питания). Наибольший эффект препараты на основе гуминовых веществ оказывают на группы азотфиксаторов, аммонификаторов, нитрификаторов и целлюлозолитиков. Одновременно с увеличением численности микроорганизмов усиливается и ферментативная активность почвы, что, в свою очередь, увеличивает подвижность питательных элементов почвы (Алиев, 1988). Кроме того, препараты на основе гуминовых веществ являются экологически инертными, а сырьем для их получения может служить большинство видов органического сырья (торф, сапропель, бурый уголь и т.п.).
Физико-химические свойства препаратов гуминовых кислот в значительной мере обусловлены видом гуминового сырья и способом их получения.
Существуют два основных способа получения гуминовых препаратов. Сущность одного из них состоит в выделении гуминовых веществ из сырья с последующей их переработкой в целевой продукт. Второй путь заключается в совместной переработке всех компонентов гуминового сырья с последующим использованием полученных продуктов для решения той или иной задачи практики (Лиштван, Абрамец, 1993).
Современный рынок гуминовых препаратов насчитывает десятки наименований самых различных продуктов. Это водные растворы гуматов, сухие порошки, пасты и просто бурые угли, и лигниты, содержащие неконверсированные в гуматы гуминовые кислоты с большим количеством балластных веществ. Предприятием Тумат" (г. Иркутск), НВП БашИнком (Башкирия) и фирмой "ЭФАТ" (г. Москва) освоено производство уникальных по своим свойствам, функциям и эффективности применения гуминовых препаратов (Тумасян, 2004).
К их числу относятся Тумат", "Гумат +7", Тумэл", "Бульба", "Оазис", "Фитоспорин", "Гуми-Оми" и др. (Каталог с/х препаратов, 2004).
Состав бурых углей
Основной химической особенностью бурых углей является значительное содержание в них лигнина и гуминовых кислот (Кузнецов и др., 1962). Ход образования этих каустобиолитов представляется следующим образом. Образование бурых углей происходило в кайнозойскую эру, третичную эпоху. В то время на Земле господствовали покрытосеменные, голосеменные (хвойные, цикадовые и гинкговые), папоротникообразные (папоротники, плауны и хвощи) растения, а также мхи, грибы, водоросли. Основным исходным материалом для формирования бурых углей служат растительные остатки - это в значительной мере остатки ископаемого болотного кипариса, мексиканского кипариса или очень похожей на него древесной породы. Как показали палеонтологические исследования, исходным материалом для бурых углей служили не столько болотные древесные растения, сколько крупные деревья, произраставшие в сырых лесах. Изучение условий залегания бурых углей приводит к заключению, что эти гумусовые породы в подавляющем большинстве случаев образовались на месте сырых лесов и только иногда на месте лесных болот. Условия образования бурых углей сходны с условиями образования современных лесных торфов. Многочисленные исследования условий образования и залегания буроугольных месторождений говорят о том, что ничто не препятствовало деятельности микробов третичной эпохи в разложении и гумификации растительных остатков. Образование бурых углей происходило в две фазы. Первая фаза - период сравнительно быстрого разложения нестойких веществ растительных остатков и накопления устойчивых соединений и продуктов, вроде лигнина, кутина, суберина, спорополенинов. Вторая фаза - период медленного превращения таких устойчивых соединений в еще более стойкие продукты, как, например, превращение легкорастворимых в щелочах гуминовых кислот в совершенно нерастворимые ни в. чем гуминовые вещества каменных углей. Первая фаза идет в аэробных условиях биологическим путем, а вторая - в анаэробных условиях; она оказывается биогенной для торфов и абиогенной для каменных углей (Таусон, 1947).
Бурые угли помимо основного составляющего компонента углерода, которого содержится 55-78%, состоят из, так называемых, гетероатомов, к которым относятся основные макроэлементы кислород, сера и азот (табл. 2). Кислород в состав угля попал как из исходного растительного материала, так и в результате процессов окисления. Основные кислородсодержащие группы следующие: фенольные и спиртовые, кетонные и хиноидные. Значительная доля кислорода входит в состав пяти- и шестичленных гетероциклов.
Аминный азот может участвовать в процессах конденсации с альдегидами, кетонами и спиртами, аналогичных образованию меланоидинов. Часть продуктов конденсации может приводить к гетероциклам, которые приобретают ароматический характер, теряя водород.
Большая часть азота входит в состав первичных, вторичных и третичных аминогрупп.
Сера содержится в органической и минеральной частях углей. Минеральная часть находится, в основном, в виде включений. Органическая сера входит в состав молекул органической массы угля. Большая часть серы имеет микробиологическое происхождение. Как и в случаях кислорода и азота сера содержится в концевых группах или входит в состав тиоэфирных групп и в гетероциклы. Наконец, часть серы находится в свободном состоянии в виде элементарной серы. Водорода в буром угле содержится 4-6,5% (Гапеев, 1949; Зикеев, 1957).
В угле, как и в гуминовой кислоте, более высокомолекулярные компоненты формируют жесткий скелет угольного вещества, а низкомолекулярные размещаются в межмолекулярном пространстве (Бухаркина, Дигуров, 1998) (рис. 2).
