Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Роль серы в жизни клетки и её биогеохими ческий цикл 6
ГЛАВА 2. Ассимиляционная сульфатредукция II
2.1. Пути восстановления сульфата II
2.2. Регуляция пути ассимиляционной сульфатредунции 24
2.3. Использование тиосульфата Б качестве источнина серы 26
2.4. Транспорт сульфата 29
ГЛАВА 3 . Использование элементарной серы микро организмами 36
Заключение 43
II. Экспериментальная часть
Глава 4. Методы исследования 45
Результаты исследования
ГЛАВА 5 . Использование различных соединений серы пропионовокисльш бактериями 53
5.1. Развитие пропионовокислых бактерий на среде с различными источниками серы 53
5.2. Динамика потребления серосодержащих субстратов при развитии культуры 55
ГЛАВА 6 . Транспорт сульфата в клетки 63
6.1. Кинетика потребления сульфата 63
6.2. Выделение сульфата в среду 66
6.3. Влияние некоторых серосодержащих соединений на транспорт сульфата . 72
6.4. Изменение пула свободного внутриклеточного сульфата в процессе роста культуры 73
ГЛАВА 7 . Использование элементарной серы культурой 78
7.1. Ассимиляция элементарной серы . 78
7.2. Редукшаза элементарной серы : 81
III. Обсуждение результатов 84
Выводы 95
Список цитированной литературы 96
- Пути восстановления сульфата
- Использование тиосульфата Б качестве источнина серы
- Развитие пропионовокислых бактерий на среде с различными источниками серы
- Динамика потребления серосодержащих субстратов при развитии культуры
Введение к работе
Пропионовокислые бактерии представляют собой одну из наиболее древних форм жизни на Земле. Предполагают, что их формирование и развитие происходило в ранний период эволюции биосферы до появления молекулярного кислорода. В этот период химические элементы, являющиеся основными компонентами живых клеток, существовали в восстановленной форме. Атмосфера была насыщена метаном, аммиаком и сероводородом. В этих условиях роль сульфида и элементарной серы, участвующих в процессах переноса электронов, была очень высока, что несомненно наложило отпечаток на физиологию всех видов, существовавших в то время, в том числе пропионовокиелых бактерий. Между тем, имен но отношение пропионовокиелых бактерий к сере и её соединениям практически не изучалось, хотя в литературе были описаны некоторые факты, указывающие на своеобразие серного метаболизма пропионовокиелых бактерий, например, их повышенная устойчивость к сероводороду. Изучение серного метаболизма пропионовокиелых бактерий как одной из сторон их физиологии представляет большой теоретический интерес, так как это расширяет наши представления об этих организмах и общих путях развития жизни. Кроме того, всестороннее изучение физиологии имеет большое практическое значение, так как пропионовокислые бактерии являются исключительно полезными микроорганизмами и находят широкое применение в различных областях биотехнологии. Их используют в сыроделии, при силосовании кормов, для получения витамина Bjg» пропионовой и уксусной кислот, для обогащения витаминами кисломолочных продуктов и продуктов детского питания. В последнее время открылись новые возможности их использования в качестве продуцентов комплекса антиоксидантних ферментов. Более глубокое изучение физиологических особенностей этих ценных микроорганизмов может выявить новые возможности их использования, а также явиться фактором повышения продуктивности.
Целью данной работы явилось изучение способности пропио-новокислых бактерий использовать различные соединения серы.
Конкретные задачи настоящей работы состояли в следующем:
- изучение принципиальных возмонносгей пропионовокислых бактерий использовать в качестве источника серы соединения серы различной степени окисленности
- изучение особенностей потребления различных соединений серы
- изучение некоторых аспектов транспорта сульфата и его регуляции.
- изучение механизмов ассимиляции элементарной серы.
В результате исследования установлено, что представитель Пропионовокислых бактерий Propionibacterium ahermanii обладает широкими возможностями в отношении использования соединений серы различной степени окисленности.
Показано, что потребление сульфата в динамике развития культуры p. shermanii отличалось от потребления других серосодержащих субстратов. Потребление сульфата культурой p. shermanii носило осцилляторный характер.
Исследованы некоторые аспекты транспорта сульфата и его регуляции.
Впервые показана способность p. ahermanii ассимилировать элементарную серу. Показана энзиматическая природа восстановления элементарной серы в ходе ассимиляции. Установлена локализация редуктазы элементарной серы.
Пути восстановления сульфата
Большинство микроорганизмов в растения удовлетворяют свою потребность в сере за счёт сульфата. Сульфат прежде чем включиться в состав органических соединений должен быть восстановлен 2 +8е 2 до уровня тиоиов: so Восстановление сульфата осуществляется ступенчато в серш реакций. Процесс восстановления сульфата с целью образования тиоло-ззых групп серосодержащих аминокислот, коферыенгов и других органических соединений называется ассимиляционной сульфакредукцией.
Первой стадией ассимиляции является акгивацин сульфата АТф с образованием аденозин--5-фосфо сульфата (АФС). На этой стадии пирофосфатная группа АТФ замещается на сульфат (Wilson and Bandurski, 1956; Robins and Lipmann, 1958). Реакция катализируется АТФ-сульфурилазой (аденозин трифосфат-оульфат аденилилтрансфераза, E.G. 2.7.7.4.) Кроме этого» в реакции принимает участие пирофосфатаза, без которое как показано Шоу и Андерсоном, не идёт синтез АФС (Shaw and-Anderson, 1972). Дело в том, что равновесие реакции, катализируемой АТФ-сульфурилазой, сдвинуто влево.
Пирофосфатаза удаляет пирофосфат из сферы реакции и» тем самым, сдвигает равновесие Б сторону образования АФС. Обратимая инактивация пирофосфатазы предотвращает синтез АФС, что позволяет бактериям сохранять АІФ в неблагоприятных условиях (Чеботарёв, 1978). Вторая стадия активации, приводящая к образованию 3-фосфо-аденозин-5-фосфосульфата (ФАФС), заключается в фосфорилированни АФС ещё одной молекулой АТФ под действием фермента АФС-кинаэы (аденозин трифосфат-аденилшісульфат 3-фосфотрансфераза, E.G. 2.7.1.25-)- Впервые реакция была показана у дрожжей и других грибов (Wilson and Bandurski, 1958; Kaji and McElroy, 1958). АФС + АТФ NH, N u it CHf0-P-S-ff Н05РСГ АДФ ФАФС Фермент АФС-киназа имеет высокое сродство к АФС (Alison and Bandurski, 1956), в связи с чем образующийся на первой стадии активации продукт (АФС) переходит в более стабильную форму активиро - ІЗ -ванного сульфата - ФАФС.
Именно о этой стадии у большинства микроорганизмов начинается восстановление сульфата. Кроме того, ФАФС являемся универсальным донором сульфогрупп в реакциях этери-фикации сульфатом спиртов, фенолов» а такие полисахаридов у большинства живых организмов (schiff and Hodson» 1973). ФАФС монет претерпевать обратное превращение и переходить в АФС. Это осуществляется под действием фермента 3 /2/ 5-дифосфонуклеозид 3 /2/Чосфогидролазы (ДфНФ-аза) (Taang and schiff, 1976).
Реакция образования АФС из ФАФСЯ катализируемая ДфНФ-азой, имеет определенные преимущества по сравнению с реакцией катализируемой АТФ-сульфурилазой» идущей против направления благоприятного равновесия. На основании этого Тсан и Шифф делают предположение, что запасаемой активной формой сульфата является ФАФС, а АФС образуется по мере надобности за счёт реакции, катализируемой ДФНФ-азой (Tsang and Scfaiff, 1976). Но, надо сказать, что у многих организмов, использующих АФС как донор сульфогрупп для редукции, ФАФС вообще не обнаружен. Функция ДФНФ-азы, по-видимому, состоит в разрушении аденозин 3,5-дифосфата, который образуется в ходе восстановления ФАФС.
Активированный сульфат далее подвергается восстановлению через ряд промежуточных стадий. Выяснение путей и механизмов восстановления сульфата шло долго и трудно и к настоящему времени выяснено не полностью.
Для ряда Микроорганизмов Escherichia coll, Salmonella ty-phimurium» Baciliua subtilis был предложен путь ассимиляционной сульфатредукции с несвязанными интермедиантами, включающий свободный АФС, ФАФС, сульфит И сульфид (рис- 2) (Dreyfuss and Monty, 1965; Pasternak et al. 1965; Jones Mortimer et al. 1968).
Использование тиосульфата Б качестве источнина серы
Кроме основного пути ассимиляционной сульфатредукции, существуют ещё другие альтернативные пути, снабжающие конструктивный метаболизм восстановленной серой. Известно, что тиосульфат является хорошим источником серы для многих микроорганизмов. Были мнения, что тиосульфат является непосредственным интермедиатом пути восстановления сульфата (См. 2.1.). У дрожжей и грибов был показан синтез s-сульфоцие теина непосредственно ИЗ серина И тиосульфата (Nakammra and Sato, I960).
Б реакции с восстановленным глютатионом s-сульфоцистеин превращается в цистеин (wooden and Segei, 1968). Дальнейшее изучение метаболизма тиосульфата показало, что эти реакции в большинстве случаев, по-видимому, не имеют физиологического значения. Леинвебер и Монти (beinweber and Monty, 1963) показали методом ингибиторного анализа, что у salmonella typhimurium тиосульфат не является интермедиатом пути восстановления сульфата, а, скорей всего, является альтернативным источником серы. Это было показано для Neuroapora craasa и для других микроорганизмов (Hilz et al. 1959; beinweber and Monty, 1965).
Альтернативный путь использования тиосульфата связан с его восстановительным расщнплением под действием фермента роданезы (тиосульфат: цианидсульфуртрансфераза Е.С. 2.8.1.1.)« Два атома серы в тиосульфате неадекватны и по-разному ассимилируются (Anderaen, 1936). Под действием роданезы происходит восстановительное расщепление тиосульфата, при котором один его атом серы восстанавливается до s , а другой - до so (viiiarejo and Wesiey, 19бЗа,в). Физиологическим донором электронов для этой реакции является липоевая кислота. Механизм редукции тиосульфата включает в себя образование комплекса роданеза - s?, существование которого было показано Грином и Вестли (Green and Weatley, 1961). Далее происходит перенос серы от роданезы-s2 к дигидроли-поату, который в свою очередь распадается на липоат и сульфид:
Роданеза (тиосульфат: цианидсульфуртрансфераза) была впервые открыта Лэнгом (Lang, 1933). В кристаллическом виде этот фермент был получен в 1953 г. Сорбо (sorbo, 1953). Основная реакция, катализируемая роданезой - цианолизис тиосульфата.
Роданеза была обнаружена во многих бактериях (viiiarejo and Westley, І963Б, 1966; Smith and Lascells, 1966; Layh et al. 1982). Бактериальная роданеза проявляла как тиосульфат-цианид-ную активность, так и тиосульфат-редуктазную. Так что, видимо, физиологическая роль роданезы не сводится только к дегонсикации цианида. Она является важным ферментом в метаболизме тиосульфата, принимает участие как в ассимиляционных, так и в диссимиля-ционных процессах, а также выполняет функцию переносчика восстановленной серы (Koj et al. 1962; Schneider and Westley, 1963; Smith and bascells, 1966; Yoch and Lindstrem, 1971). Открытие механизма тиосульфат-редуктазной реакции подтвердило предположение о том, что тиосульфат не является интермедиатом пути ассимиляционной сульфатредукции.
Транспорт сульфата Первым шагом ассимиляции сульфата является его перенос че - зо рез мембрану. Для всех микроорганизмов, у которых изучался этот процесс,- бактерий, дрожжей, грибов и водорослей показано, что потребление сульфата происходит путём активного транспорта. Перенос сульфата осуществляется против градиента концентрации, требует затраты энергии, сильно зависит от температуры. Кинетика транспорта сульфата у всех изученных микроорганизмов описывается законом МихаЭЛИса-МентеН. (Segel and Johnson, 1961; Dreyfuss, 1964-; Marzluf, 1970; Springer and Huber, 1973; Dean and O Brien, 1975; Utkilen et al. 1976; Horak et al. 1981). Для переноса сульфата в клетку существует специальная транспортная система. Дрейфусе (Dreyfuss, 1964) показал, используя ЦИСТраНС-тесТ, ЧТО ГеНОМ Salmonella typhimurium содержит не менее 3 цистронов, необходимых для проникновения so в клетку. Некоторые микроорганизмы обладают двумя различными сульфат-транспорт ирующими системами, которые кодируются отдельными генетическими локусами. У Neurospora crassa показано наличие двух пермеаз (Marzluf, 1970): пермеаза I, обладающая высоким сродством к сульфату % = 8 мкМ и пермеаза II, обладающая низким сродством Код = 50 мкМ. Кинетические исследования выявили, В потреблении SO Saccharomyces cerevisiae участвуют, также, две пермеазы, которые, возможно, взаимодействуют между собой. Пермеаза I имеет высокое сродство к субстрату % = 5 мкМ, пермеаза II имеет более низкое сродство К = 35 мкМ (Breton and Surdin-Kerjan, 1977). Две независимые сульфатпермеазы обнаружены у цианобактерии Spirulina platensis (Menon and Varma, 1982), одна из которых конститутивна и обладает низким сродством к 2 so. , а другая индуцибельна и обладает высоким сродством. Транспорт сульфата зависит от рН среды и внутриклеточного рН, который в свою очередь зависит от некоторых компонентов ере - зі ды и от состояния клеток (Borst-Pauweis, 1981). Влияние реакции среды на транспорт, скорей всего, объясняется воздействием рН на переносчик, так как сульфат существует в одной и той же ионной форме во всем диапазоне изменения рН. Переносчик, чтобы связаться с субстратом, должен существовать в определенной ионной форме и, иногда, именно этим можно объяснить наличие оптимального для транспорта интервала рН. Кроме того, известно, что Км, характеризующая процесс транспорта сульфата, зависит от рН среды И рН клетки (Cuppoietti and Segel, 1975; Roomans et al, 1979), что означает, что сульфат связывается только с протони-рованным переносчиком. Это подтверждается тем фактом, что транспорт сульфата В мембранные везикулы Parococcus denitrificans, у дрожжей и у Penniciiium notatum идёт по механизму протонного СИМПОрта (Burnell and Whatley, 1975; Cuppoietti and Segel, 1975;
Borst-Pauwels, 1981).
Развитие пропионовокислых бактерий на среде с различными источниками серы
Использование различных соединений серы пропионовонислыми бактериями. 5.1. Развитие пропионовокислых бактерий на среде с различными источниками серы. На начальном этапе работы нами были изучены потребности в сере представителя пропионовокислых бактерий Propionibacte-rium shermanii и принципиальные возможности этого организма использовать различные её соединения.
Этот вопрос для пропионовокислых бактерий практически не изучался. Известно только, что лропионовокислые бактерии хорошо растут на синтетической среде с произвольно выбранной концентрацией сульфата 0,3% (Воробьёва, 1976). Оказалось, что потребности пропионовокислых бактерий в сере намного ниже. Из результатов, представленных в таблице I видно, что при росте культуры p. shermanii на среде с сульфатом нонечный выход биомассы практически не менялся при варьировании концентраций от 2 до 30 мМ.
В этой не таблице представлены данные о росте p. shermanii на ореде с другими источниками серы. Установлено, что концентрация сульфита 2,5 мМ не подавляла рост и была достаточна для нормального развития бактерий. Концентрации сульфита выше 2,5 мМ ингибировали рост культуры p. shermanii. При концентрации сульфита 30 мМ и выше рост был полностью подавлен, p. shermanii в качестве источника серы могут использовать сульфид, проявляя к нему высокую устойчивость. Хороший рост культуры наблюдался вплоть до концентрации 6 мМ. Культура p. shermanii хорошо росла на среде с тиосульфатом, причём варьирование концентрации от 5,5 до 13,5 мМ не влияло на скорость
Таблица I. Накопление биомассы propionibacterium ahermanii на среде К 2 с различными источниками серы. Начальная плотность засева 0,1 мг/мл В таблице приведены средние значения для серии аналогичных экспериментов. кСера присутствовала в виде твердой фазы. роста культуры и конечный выход биомассы.
Б работе была установлена способность p. ahermanii расти на элементарной сере. Элементарная сера поддерживала хороший рост культуры, выход биомассы составлял 60-65$ от выхода биомассы, выращенной на сульфате. Таким образом, было показано, что p. ahermanii обладает широкими возможностями относительно использования соединений серы различной степени окисленности. Выяснив возможность роста p. shermanii на том или ином источнике серы, мы изучили динамику потребления серосодержащих субстратов из среды в ходе развития культуры. 5.2
Динамика потребления серосодержащих субстратов в ходе развития культуры Propionibacterium shermanii. На рис. 8, 9 представлено потребление из среды сульфита и тиосульфата в ходе развития культуры p. shermanii. Сульфит и тиосульфат начинали интенсивно потребляться из среды в период между 24 и 72 часами роста. В этот период скорость потребления максимальная и составляет для сульфита 33 мкМ/час/мг сух. биомассы и для тиосульфата 20 мкМ/час/мг сух. биомассы. На рис. 10 изображена динамика потребления сульфида из среды в ходе развития культуры p. ahermanii. Сульфид интенсив 2V 8 72 $6 час. Рис. 8. Потребление сульфита и накопление биомассы в ходе развития культуры p. shermanii. 1 - содержание сульфита в среде 2 - сухая биомасса - 56 (/ У& 73 $6 v#e. Рис. 9. Потребление тиосульфата и накопление биомассы в ходе развития культуры P. shermanii. 1 - содержание тиосульфата в среде 2 - сухая биомасса нее всего потребляется в первые 24 часа развития культуры с высокой скоростью 67 мкМ/час мг сух. биомассы. Б последующие часы развития культуры потребление сульфида было незначительно.
По-видимому, высокая начальная скорость потребления сульфида иыеет для культуры ещё и защитное значение, заключающееся в быстром установлении такой концентрации сульфида, при которой допускается экспоненциальный рост клеток.
Динамика потребления серосодержащих субстратов при развитии культуры
Кинетика потребления so представлена на рис. 14. Характер потребления сульфата нерастущей суспензией клеток напоминает процесс» происходящий при развитии культуры. Скорость потребления сульфата в первые две минуты очень высока, наблюдается резкое увеличение радиоактивности клеток, затем уровень радиоактивности снижается, видимо, за счёт выделения сульфата в среду, после чего вновь начинает возрастать. Аналогичная кинетика транспорта сульфата описана в литературе для salmonella typhimurium И Anacystis nidulans (Dreyfuae and Pardee, 1966; tttkilen et al. 1976). В нашей работе показано, что транспорт сульфата в клетки p. ehermanii описывается кинетикой Михаэлиса-Ментен. Из графика в координатах Лайнуивера-Бэрка, представленного на рис. 15, следует, что потребление сульфата осуществляется одной пермеазой \ 13,3 мнМ. Транспорт сульфата у p. shermanii энергозависим (Табл. 2). Отмытые клетки, лишенные источника энергии, через 30 минут голодания потребляли за 15 минут инкубации в среде, несодержа-щей источника энергии, в 3,5 раза меньше сульфата, чем аналогичные клетки, но инкубированные в среде с лактатом {!%). Начальная скорость потребления сульфата при отсутствии источника энергии снижалась в 5 раз. Значительное влияние на процесс потребления сульфата оказывала температура. Как видно из рисунка 16, оптимальный интервал температур для потребления сульфата 28-33С. При температуре - 64 да?- ІО лин. 35 2 Рис. 14. Потребление . so. суспензией клеток P. shermanii. SMM M- U .2 Рис. 15. Зависимость снорости транспорта от концентрации Лайнуивера-Бэрка. 304 в координатах - 66 Таблица 2. Поглощение сульфата p. shermanii в зависимости от наличия источника энергии в среде. без источника на среде с $ от энергии лактатом ыа контроля (контроль) Потребление 137 № 29 за 15 мин инкубации ИМП/мин мг сух.биом. Начальная скорость 15 70 21% потребления 2-3 С транспорт сульфата практически не наблюдается. Изложенные выше данные дают основания заключить, что поступление сульфата в клетки p. shermanii осуществляется путём активного транспорта, как и у всех других микроорганизмов, для которых описан этот процесс. Величина рН тоже оказывала влияние на потребление сульфата клетками p. shermanii. Из данных, представленных на рисунке 17, 35 2 видно, что количество . so , аккумулированное клетками за 3 минуты инкубации, возрастает в интервале рН 5,5-7,0, а затем быстро снижается. Оптимальным для поглощения сульфата оказывается интервал рН 6,8-7,1. Выделение сульфата в среду. Потребление сульфата, описанное выше, клетками p. shermanii сопряжено с его выделением в среду. Если клетки во время выращивания не испытывали недостатка в сульфате, то его выделение из клеток происходило во всех случаях, независимо от наличия сульфата во внешней среде (Рис. 18). Выделение сульфата в среду, так же как и потребление, носило осцилляторный характер, т.е. выделив сульфат, клетки могли его снова потребить. Б клетках с истощенным запасом эндогенной серы выделение сульфата происходило после периода его интенсивного поглощения при условии достаточного содержания сульфата (больше 50 мкМ) в среде. Если концентрация сульфата в среде была ниже 50 мкМ, то выхода сульфата в среду не наблюдалось. Совершенно очевидно, что сульфат у p. shermanii может двигаться в обоих направлениях через мембрану. Направление перемещения сульфата в клетку ИЛИ из клетки зависит от его внутриклеточного содержания, что согласуется с данными, полученными в ростовых экспериментах при развитии культуры P. shermanii (См. 5.2.). В ходе развития культуры p. shermanii на среде с лактатом На Б первые 24 часа происходит некоторое подкисление среды. Исходный рН 6,9-7,2 падает до 6,5-6,6. Затем величина рН начинает расти и к концу развития культуры (96 час. роста) достига 2 ет значения 7,1-7,2. Максимальное выделение 30. при развитии культуры происходит в период между 24 и 48 час. роста, что совпадает с минимальным значением рН среды (Рис. 19). В связи с этим возникла необходимость проверить влияние рН среды на выделение сульфата из клеток, тан как изменение рН среды ыожет приводить к изменению внутриклеточного рН, что может являться фактором, обусловливающим переключение потребления сульфата на выделение. Выделение сульфата в среду изучали при значениях рН 6,4, 6,85 и 7,25, выбор которых определялся тем интервалом, который создается в ходе развития нультуры. Как видно из рисунка 20, значительной разницы в характере процесса выделения при данных значениях рН не наблюдалось, но прослеживалась тенденция к уве -
