Содержание к диссертации
Введение
Глава I. МЕТИЛОТРОПИЯ У HYPHOMICROBIUM 12
1.1. Гифомикробы как основной агент метилотрофной денитрификации 12
1.2. Родовые признаки Hyphomicrobium ІЗ
1.3. Субстраты роста Hyphomicrobium 14
1.4. Ассимиляция Сj-единиц гифомикробами 15
1.5. Катаболизм метанола у аэробных бактерий 15
1.5.1. Метанолдегидрогеназа 17
1.5.2. Ферменты, окисляющие формальдегид 19
1.5.3. Формиатдегидрогеназы 22
Глава 2. ДЕНИТРИФИКАЦИЯ '. 23
2.1. Агенты денитрификации 23
2.2. Интермедиаты денитрификации 26
2.2.1. її20 - облигатный свободный интермедиат ....
денитрификации 26
2.2.2. Является ли N0 облигатным свободным
интермедиатом денитрификации? 28
2.3. Ферменты денитрификации 29
2.3.1. Диссимшгяционные нитратредуктазы 29
2.3.2. Диссимшгяционные нитритредуктазы денитрификаторов 32
2.3.3. N0 -редуктазы 34
2.3.4. н20-редуктазы 35
2.4. Перенос электронов при денитрификации 37
2.5. Перенос электронов.при.метилотрофной. денитрификации 39
2.6. Влияние внешних факторов на денитрификацию 4І
2.6.1. Возможные механизмы влияния аэрации на состав продуктов денитрификации в почвах.. 41
2.6.2. Влияние аэрации на ферменты денитрификации 42
2.6.3. Влияние концентраций окисленных соединений азота на денитрификацию 45
2.6.4. Токсическое влияние интермедиатов денитрификации на продуцентов 46
2.7. Денитрификация и охрана окружающей среды 49
2.7.1. Антропогенное влияние на цикл азота 49
2.7.2. Роль закиси азота в атмосфере 50
2.7.3. Денитрификация как составная часть геохимического барьера на границе природного ландшафта 52
2.7.4. Метилотрофная денитрификация как метод . ОЧРІСТКИ сточных вод от соединений азота... 53
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 54
Глава 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 54
3.1. Микроорганизмы - объекты исследований ......... 54
3.2. Условия выделения и культивирования метилотрофных денитрификаторов 55
3.3. Методы определения субстратов и продуктов
. метилотрофной денитрификации 57
3.4. Методы работы с суспензиями клеток 60
3.5. Методы определения ферментов в
. бесклеточных экстрактах 61
Глава 4. ВЫДЕЛЕНИЕ МЕТИЛОТРОФНЫХ ДЕНИТРИФИКАТОРОВ И ИССЛЕДОВАНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ ИХ РОСТА 65
4.1. Выделение метилотрофных денитрификаторов, относящихся к роду Hyphomicrobium 65
4.2. Способность гифомикробов к росту с различными акцепторами электрона , 71
4.3. Субстраты роста и денитрификации у Hyphomicrobium Z-3 И ZV 76
4.4. Динамика роста и образования продуктов при анаэробном росте Hyphomicrobium Z-Зи ZV на среде 337 с 0,5$ СН30Н и 50 мМ Ш~
(без дополнительного внесения микроэлементов)... 77
4.5. Влияние концентраций нитрата и метанола на метилотрофную денитрифшшцию у Hyphomicrobium Z-3 и ZV 80
4.6. Влияние рН на метилотрофную денитрификацию у штамма Hyphomicrobium Z-3 8^
4.7. Влияние микроэлементов на метилотрофную денитрификацию у Hyphomicrobium Z-3 и ZV .... 87
4.8. Сравнение аэробного и анаэробного роста Hyphomicrobium Z-3 И ZV 93
4.9. Выделение метилотрофных денитрификаторов,
не относящихся к роду Hyphomicrobium 98
Глава 5. НАКОПЛЕНИЕ НИТРИТА ПРИ МЕТИЛОТРОФН0Й ДЕНИТРИФИКАЦИИ 106
5.1. Влияние нитрита на метилотрофных.денитрификаторов Hyphomicrobium Z-3 И ZV 107
5.2. Перенос электронов от.метанола к нитрату у
Hyphomicrobium Z-3 ***
5.3. Возможные причины накопления нитрита
Hyphomicrobium z-3 и возможный механизм
влияния Си2+ на этот процесс 120
Глава 6. ВЛИЯНИЕ АЭРАЦИИ НА СОСТАВ ПРОДУКТОВ МЕТИЛ0ТР0ФН0Й ДЕНИТРИФИКАЦИИ 125
6.1. Влияние аэрации на активность ферментов денитрификации в клетках Hyphomicrobium Z-3 ...126
6.2. Влияние аэрации на синтез ферментов денитрификации у Hyphomicrobium Z-3 и ZV 131
6.3. Образование закиси и окиси азота при переходе от аэробиоза к анаэробиозу 135
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 144
ВЫВОДЫ 151
ЛИТЕРАТУРА
- Гифомикробы как основной агент метилотрофной денитрификации
- Агенты денитрификации
- Микроорганизмы - объекты исследований
- Выделение метилотрофных денитрификаторов, относящихся к роду Hyphomicrobium
- Влияние нитрита на метилотрофных.денитрификаторов Hyphomicrobium Z-3 И ZV
Введение к работе
Постановка проблемы и ее актуальность. Процесс денитрифика-ции с использованием одноуглеродных соединений на чистых культурах был впервые продемонстрирован в 1971 году у двух представителей рода Hyphomicrobium (Sperl, Hoare, 1971). ГифОМИКробы - морфологически характерные организмы, легко опознаваемые под световым микроскопом по моно- или биполярным нитевидным выростам клеток (гифам), на концах которых почкованием образуются дочерние клетки (Hirsch, 1974а). По-видимому, именно гифомикробы являются основным агентом денитрификации с метанолом и метиламинами. При анаэробной инкубации самых различных образцов с этими субстратами и нитратом наблюдается развитие накопительных культур, в
КОТОРЫХ ДОМИНИРУЮТ ГифОМИКробы (Attwood, Harder, 1972; Harder, Attwood, 1978).
Единственным не относящимся к гифомикробам организмом, для которого показана денитрификация с метанолом, является Рагасос-cus denitrificans (Bamforth, Quayle, 1978b).
Метилотрофные денитрификаторы способны сочетать два процесса, которые по отдельности интенсивно изучаются последние 10-15 лет: метилотрофию и денитрификацию. Метилотрофная денитрификация остается мало изученной, хотя представляет значительный практический и теоретический интерес.
В настоящее время в индустриально развитых районах, небогатых водными ресурсами, встает проблема защиты водоемов и грунтовых вод от усиливающегося поступления в них соединений азота.
Одним из экономичных способов очистки сточных вод от соединений азота является сочетание бактериального аэробного процесса нитрификации с последующей анаэробной стадией, в ходе которой микроорганизмы восстанавливают образованный при нитрификации нитрат в и2 за счет экзогенного метанола, который сравнительно дешев, и не дает токсичных побочных продуктов. Практическим достоинством денитрификации с использованием метанола является и ограниченность осуществляющей процесс группы организмов, так как такой процесс легче изучить и контролировать.
Таким образом, исследования денитрификации с метанолом и влияния внешних условий на интенсивность процесса и состав продуктов имеют практическое значение. При денитрификации нередко происходит накопление нитрита, окиси и закиси азота. Состав продуктов при метилотрофной денитрификации и его зависимость от внешних условий практически не изучены. В то же время накопление окисленных продуктов денитрификации (во всяком случае нитрита и окиси азота) в очистных сооружениях нежелательны. Нитрит ввиду высокой токсичности не должен содержаться в сбросах. Кроме того, он может ингибировать деятельность микрофлоры очистного сооружения. Усиленное выделение окиси азота может вызывать локальную опасность отравления людей, так как этот газ высоко токсичен. Условия, влияющие на образование закиси азота микроорганизмами, заслуживают изучения с позиций глобальной микробиологии, так как
Чатыбсферы/ этот газ влияет на озоновый слой1, защищающий Землю от ультрафиолетового излучения ' (Crutzen, 1981).
Одним из теоретических стимулов для изучения метилотрофной денитрификации является недостаточная изученность осноеных агентов процесса - представителей Hyphomicrobium, что отражается в отсутствии детальной систематики рода. Представляют в частности интерес вопросы, насколько широко распространена среди гифомик-робов способность к денитрификации и насколько однородна по свой- ствам группа гифомикробов, способных к денитрификации.
Метилотрофия - свойство, обнаруживаемое среди ряда таксонов (Кондратьева, 1983). Весьма широко распространена и способность К денитрификации (Jeter, Ingraham, 1981). В ТО же время денитри-фикация с метанолом обнаружена только у гифомикробов и Pcdenitri-ficans. Причиной редкости сочетания окисления метанола с восстановлением нитрата могут быть особенности функционирования электрон-транспортной цепи (ЭТЩ при осуществлении этих процессов. Для ряда метилотрофов показано, что метанол (и иногда формальдегид) передают электроны в ЭТЦ на уровне цитохрома с, минуя цито-хром Ъ (Anthony, 1975; Hetrusov et al., 1977; Bamforth, Quayle,
1978b). Для ряда денитрификаторов известно, что нитрат принимает электроны от ЭТЦ на уровне цитохрома b (John, whatley, 1970; Miyata, 1971). Таким образом, перенос электронов от метанола к нитрату может быть затруднен.
Разветвленные бактериальные электрон-транспортные цепи (ЭТЦ), то есть ЭТЦ, принимающие электроны на разных уровнях и отдающие их на разных уровнях, в том числе ЭТЦ метилотрофов и денитрифика торов, привлекают внимание исследователей. В то же время метилотрофные денитрификаторы, обладающие весьма разветвленной ЭТЦ, почти не изучались и с этой точки зрения. Многочисленные исследования, посвященные ЭТЦ Pc.denitrifleans, почти не затрагивали ее функционирования при денитрификации за счет метанола у этого организма.
Практические соображения делают изучение денитрификации с метанолом более важным, чем с другими Сj-субстратами. В то же время именно денитрификация с метанолом как с субстратом, отдающим, по-видимому, электроны в ЭТЦ на уровне цитохрома с, наиболее интересна и с точки зрения функционирования ЭТЦ при метило- трофной денитрификации.
Одновременно с нашей работой группа Хардера в Голландии проводила исследование физиологии и биохимии метилотрофной денитрификации, уделяя основное внимание метиламинам (Meiberg, Harder, 1978, 1979; Meiberg et al., 1980; Meiberg, 1979).
Эти причины побудили нас в нашей работе по денитрификации с С-г-соединениями уделить основное внимание денитрификации с метанолом.
Цель и задачи исследования. Целью работы было изучение особенностей микробиологии, физиологии и биохимии возбудителей денитрификации с метанолом и выяснение влияния различных факторов на интенсивность процесса и состав продуктов.
Конкретно задачи исследования состояли в следующем.
Получить накопительные и чистые культуры метилотрофных денитрификаторов. Проверить, действительно ли в накопительных культурах доминируют гифомикробы, и не способна ли сопутствующая микрофлора к метилотрофной денитрификации.
Проверить способность ряда штаммов гифомикробов, выделенных другими авторами в анаэробных условиях, на способность к денитрификации с целью оценить распространенность этого свойства среди гифомикробов. Сравнить гифомикробов-денитрификаторов по ряду признаков (возможность роста с различными акцепторами, образуемые продукты и т.д.) с целью оценить однородность свойств группы гифомикробов, способных к денитрификации.
3) Выявить влияние внешних факторов - рН, аэрации, концент рации нитрата, нитрита, метанола, наличия микроэлементов на ин тенсивность процесса метилотрофной денитрификации и на состав образуемых продуктов.
4. Установить у метилотрофных денитрификаторов тип ферментов, окисляющих метанол и восстанавливающих нитрат. Выяснить, возможен ли перенос электронов от метанолдегидрогеназы к нитрат-ре дуктазе.
Научная новизна работы. Впервые описан состав продуктов, образуемых метилотрофными денитрификаторами, и влияние на него внешних факторов. Показано, что на состав продуктов денитрифика-ции с метанолом большое влияние оказывают ионы Си , в присутствии которых в стабильных анаэробных условиях единственным продуктом становится н2. Показано, что переход метилотрофных денитрификаторов от аэробного линейного роста к денитрификации в анаэробных условиях способствует образованию ими закиси азота ввиду большей чувствительности N2o -редуктазы к репрессии аэрацией по сравнению с другими редуктазами денитрификации.
Установлено, что гифомикробы, способные к денитрификации, представляют собой гетерогенную группу. Они значительно различаются по скорости и эффективности анаэробного роста с нитратом и метанолом, по составу продуктов, образуемых в отсутствие ионов Си , по способности к росту с метанолом и N2o.
Обнаружено, ЧТО Hyphomicrobium Z-3 В определенных УСЛОВИЯХ осуществляет процесс, не укладывающийся в рамки существующих представлений об ЭТЦ метилотрофных денитрификаторов (Bamforth, Quayle, 1978b; Meiberg, 1979) - практически стехиометрическое восстановление нитрата в нитрит за счет метанола. Проведено энзи-мологическое исследование обнаруженного явления.
Практическая ценность исследования. Полученные данные по зависимости интенсивности денитрификации с метанолом и состава ее продуктов от внешних условий могут иметь значение для практики соответствующих очистных сооружений. Показано, что для избежания - II - образования нежелательных промежуточных продуктов (нитрит, окись азота, закись азота) могут быть существенны наличие ионов Си и стабильные анаэробные условия.
Выделен штамм Hyphomicrobium z-З, дающий при анаэробном росте с метанолом и нитратом высокий урожай биомассы в расчете на потребленный метанол, сравнимый с наиболее высокими урожаями, которые удается получить при аэробном культивировании бактерий и дрожжей на метаноле. Выявлены условия анаэробного культивирования Hyphomicrobium z-З, способствующие высокому урожаю, высокому содержанию белка и низкому содержанию поли-б-оксимасляной кислоты в клетках. Метанол может быть экономичным субстратом для получения кормового микробного белка. При аэробном культивировании существенными проблемами производства являются расход энергии на аэрирование культуры и происходящее при аэрировании улетучивание метанола. При условии наличия штамма, дающего высокий урожай в анаэробных условиях, замена кислорода на нитрат может быть экономически выгодной.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на
Всесоюзной конференции " Термофильные микроорганизмы в природе и практшсе народного хозяйства", г. Москва, 1983 г. и на Всесоюзном семинаре "Закономерности роста микроорганизмов", г. Пушино, 1983 г.
Место проведения работы. Работа проводилась в Институте микробиологии АН СССР в отделе Литотрофных миіфоорганизмов (заведующий отделом - член-корреспондент АН СССР, профессор Г.А.Заварзин). Часть экспериментальной работы проведена совместно с канд. биол. наук И.Я. Ведениной.
Гифомикробы как основной агент метилотрофной денитрификации
Основным агентом денитрификации с одноуглеродными соединениями (иными, чем формиат) являются, по-видимому, представители рода Hyphomicrobium. По данным голландских исследователей, при анаэробном инкубировании самых различных образцов с нитратом и Су-соединениями (метанол, метиламин, диметиламин, триметиламин) наблюдается развитие накопительных культур, в которых доминируют гифомикробы (Attwood, Harder, 1972; Harder, Attwood, 1978). Фор миат, в отличие от других Cj-соединений, в присутствии нитрата обеспечивает доминирование в накопительных культурах Peeudomonas spp. (Attwood, Harder, 1972), ХОТЯ Денитрифицирующие ГИфОМШфОбы СПОСОбНЫ ОСущеСТВЛЯТЬ ЭТОТ процесс И С формиаТОМ (Attwood, Harder, 1978). Для среды с метанолом селективность метода в отношении гифомикробов проверяли в диапазоне рН 5,0-8,5 и при различных концентрациях метанола и нитрата. Потеря специфичности накопительной процедуры по отношению к гифомикробам наблюдалась лишь при низкой концентрации метанола и нитрата и то лишь в случаях,
КОГДа ИНОКУЛЯТ был богат органическими веществами (Attwood, Harder, 1972). Метод позволил авторам выделить ряд чистых культур Hyphomicrobium, способных к метилотрофной денитрификации. Ранее (Speri, Hoare, 1971) с нитратом и метанолом был выделен штамм Hyphomicrobium wc и показана способность к денитрификации с метанолом у выделенного аэробно Hyphomicrobium В522.
Единственным не относящимся к гифомикробам организмом, дня которого показана денитрификация с Су-соединением иным, чем фор-МИЭТ (с метанолом), является Рагасосcus denitrificans (Bamforth, Quayle, 1978b).
Агенты денитрификации
Физиология и биохимия метйлотрофной денитрификации мало изучена. Даже такой всесторонне изученный микроорганизм, как Para-coccus denitrificans, мало изучен как метилотрофный денитрифика-тор. Основной агент метйлотрофной денитрификации - гифомикробы -изучены в основном как аэробные метилотрофы. Сказанное делает необходимым рассмотреть литературные данные, касающиеся денитрифи-кации, полученные на организмах, не являющихся метилотрофами.
Денитрификациеи принято называть восстановление нитрата или нитрита в молекулярный азот и другие газообразные продукты (но и N2O).
В последнее время открыты новые биологические восстановительные процессы, ведущие к образованию газообразных соединений азота, которые тем не менее денитрификациеи предпочитают не называть. Это образование закиси азота при восстановлении нитрита нитрификаторами первой фазы (Nicholas, 1978) и образование закиси азота организмами, осуществляющими диссимиляционное восстановление нитрита В аммоний (Smith, Zimmerman, 1981; Smith, 1982, 1983). В связи с этим более полезным представляется другое определение денитрификации, интуитивно принимаемое и употребляемое большинством специалистов, но четко не сформулированное: денитрификациеи называется восстановление соединения азота (в том числе газообразного) в газообразный продукт (ж , н2о, н2), имеющее энергетическое значение для осуществляющего его организма.
Микроорганизмы - объекты исследований
В работе наряду с выделенными нами штаммами гифомикробов использованы штаммы гифомикробов, полученные из других лабораторий.
Штамм Hyphomicrobium z-з был выделен нами из низового болота (Абрамцево, Подмосковье), штаммы Hyphomicrobium Z-III И z-ііз, различающиеся морфологически, - из поймы реки Сетунь.
Штамм Hyphomicrobium zv был выделен Г.А.Заварзиным (Завар-зин, I960).
Штаммы Hyphomicrobium G3, G4, G5, G7, G8 И G10 получены от Б.В.Громова (Белони, 1981).
Штаммы Hyphomicrobium UP-20I и NA-I60 получены от Д.И.Никитина .
Штамм Hyphomicrobium 3 получен от Ю.А.Троценко (Шишкина, Троценко, 1974).
Мы приносим благодарность авторам, предоставившим нам культуры.
Кроме того, в работе были использованы накопительные культуры термофильных нитрификаторов, любезно предоставленные нам Р.С.Головачевой. В этих культурах, инкубируемых при 40-50, стабильно присутствовал Hyphomicrobium sp. (Головачева, 1976).
В работе мы использовали также образцы активного ила из аэротенков Люблинокой станции и из очистных сооружений, осуществляющих метанольную денитрификацию промстока п/о "Азот" в г.Щёки-ио. Из Щёкинских образцов активного ила нами были выделены штаммы z-ioo и z-121 - метилотрофные денитрификаторы, не относящиеся к Hyphomierobium. При их изучении для сравнения нами была использована коллекционная культура Paracoccus denitrificans штамм Vogt.
Выделение метилотрофных денитрификаторов, относящихся к роду Hyphomicrobium
Шесть проб, взятых в низовых болотах в Абрамцево (Подмосковье), а также из поймы р.Сетунь, были инокулированы в среду 337 с метанолом (0,5% v/v) и KNO3 (5 г/л), без дополнительного внесения микроэлементов. Через несколько суток во всех сосудах наблюдалось помутнение среды, появление пузырьков газа, повышение давления. Микроскопия показала, что доминирующей формой везде были гифомикробы. После недельной инкубации был сделан пересев в среду того же состава.
Из первого пересева был сделан рассев на чашки с картофельным агаром (к/а), который показал наличие небольшого количества сопутствующих гифомикробам организмов. Сами гифомикробы на к/а не вырастали.
Микроскопия препаратов из колоний на к/а показала, что это были коринеподобные бактерии и бактерии,напоминающие Biastobacer. Ни те, ни другие не были способны расти в чистых культурах на среде 337 с метанолом и нитратом (в том числе при добавлении 100 мг/л дрожжевого экстракта).
Таким образом, во всех шести накопительных культурах доминировали гифомикробы, а обнаруживаемая рассевом на к/а сопутствующая микрофлора была неспособна в чистых культурах денитрифицировать с метанолом.
Лишь в одном из наших образцов и только после двух недельной инкубации микроскопия обнаружила, наряду с гифомикробами, также значительное количество клеток метаносарцины. Это, по-видимому, объяснялось сукцессией бактериальных процессов: после исчерпания нитрата начиналось метанообразование из метанола, находившегося в среде в избытке.
Attwood и Harder (1972) показали доминирование гифомикро-бов при посеве различных образцов на среду указанного состава, но они не проверяли сопутствующую микрофлору на способность к метилотрофной денитрификации.
После нескольких пересевов накопительных культур мы проводили выделение чистых культур гифомикробов методом рассева предельных разведений на чашки с агаризованной средой 337 (с метанолом) с последующим клонированием отдельных колоний. Чистоту культур проверяли методом микроскопии и рассева на чашки с МПА, картофельным агаром и сусло-агаром. Рост гифомикробов на этих средах отсутствовал.
Были выделены три чистые культуры метилотрофных денитрифи-каторов: Hyphomicrobium z-3 (рис.1) (исходная проба - низовое болото, Абрамцево, Подмосковье), Hyphomicrobium Z-III И Hyphomicrobium z-из. Оба последних штамма выделены из поймы р.Сетунь, однако различаются морфологически: z-из образует розетки, z-iil - нет. (Не образует розеток и штамм z-3).
Гифомикробы являются характерными спутниками в накопительных культурах нитрификаторов (Заварзин, 1961). Головачевой (1976)
Было отмечено стабильное присутствие термофильного Hyphomicrobium sp. в инкубируемых при 40-50 накопительных культурах термофильных .нитрификаторов, выделенных из гидротерм Камчатки, Таджикистана и Забайкалья, а также из почвы термальной зоны горы Янган-Тау (Южный Урал).
Влияние нитрита на метилотрофных.денитрификаторов Hyphomicrobium
В разделе 4.4 указывалось, ЧТО При анаэробном развитии Hyphomicrobiura z-З с 50 мМ же в отсутствие Си происходит накопление нитрита. Прирост мутности и белка в культуре происходит до исчерпания нитрата. Дальнейшее медленное восстановление накопленного нитрита не сопровождается приростом мутности и белка.
Влияние NOg На развитие Hyphomicrobium Z-З особенно ОТ-четливо проявляется при росте культуры с 100 мМ НО3 (рис.8). В этом случае накопление 30-50 мМ iJOg достигается до исчерпания NOZ. После этого восстановление жц продолжается с той же скоростью, однако прирост белка прекращается. В то же время медленное возрастание оптической плотности суспензии продолжается вплоть до полного исчерпания иоГ. После накопления 70 мМ lOg прекращается образование ш2, и единственным газообразным продуктом становится и2о.
Противоречивые взгляды на механизм ингибирующего действия нитрита на рост денитрификаторов излагались в разделе 2.6.3 литературного обзора. Мы попытались в простом опыте получить свидетельства В ПОЛЬЗУ ТОГО ИЛИ ИНОГО механизма ДЛЯ Hyphomicrobium z-З. Для этого мы решили определить, как влияет присутствие накапливаемого или экзогенно внесенного нитрита на урожай биомассы (в расчете на использованный метанол) и на содержание в клетках белка и ПОМК.
Мы провели культивирование Hyphomicrobium Z-З На среде 337 с начальной концентрацией метанола 0,16$ v/v= 40 мМ (выбранной с расчетом, чтобы акцептор электронов заведомо находился в избытке)
