Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Коллекции микроорганизмов как способ сохранения биоразнообразия 12
1.2. Методы консервации микроорганизмов 15
1.3. Характер и особенности повреждений микроорганизмов при консервации 19
1.4. Экологические факторы, влияющие на сохранение жизнеспособности микроорганизмов при переводе их в анабиотическое состояние 26
1.4.1. Биотические факторы 26
1.4.2. Абиотические факторы 27
1.5. Синтез и химические реакции активных форм кислорода 31
1.6. Экологические аспекты действия антиоксидантов 37
1.7. Методические подходы к оценке влияния антиоксидантов на микроорганизмы 49
Глава 2. Материалы и методы 54
2.1. Экспериментальная модель 54
2.2. Химические соединения, использованные в работе 54
2.3. Изучение биологической активности соединений 57
2.4. Определение роли синтетических антиоксидантов в защите бактериальных клеток в условиях стресса, вызванного действием абиотических факторов 59
2.5. Определение влияния синтетических антиоксидантов на выживаемость грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов при стрессовом действии абиотических факторов 61
2.6. Методы консервации микроорганизмов и определения продолжительности их хранения 63
2.7. Изучение морфологических изменений бактериальных клеток на фоне действия абиотических факторов 64
2.8. Оценка действия антиоксидантов на клеточную поверхность бактерий и определение их локализации 66
2.9. Статистическая обработка результатов 68
Глава 3. Изучение биологической активности синтезированных веществ, относящихся к различным видам гетероциклических соединений 69
3.1. Определение антифаговой активности исследуемых соединений..69
3.2. Определение антиоксидантной активности исследуемых соединений 74
3.3. Зависимость биологической активности соединений от их химической структуры на примере ряда кумаринов 80
3.4. Изучение влияния синтетических антиоксидантов на собственные антиокислительные системы бактериальных клеток 83
Глава 4. Использование синтетических антиоксидантов для стабилизации популяционного состава бактерий на фоне действия различных абиотических факторов 86
4.1. Роль синтетических антиоксидантов в повышении выживаемости различных групп микроорганизмов 85
4.2. Испытание новых сред защиты для повышения выживаемости бактериальных клеток в условиях стресса, вызванного процессом лиофилизации 94
4.3. Морфологические изменения в бактериальных клетках, находящихся в условиях стресса 99
Глава 5. Изучение взаимодействия антиоксидантов с поверхностными структурами бактериальных клеток 105
5.1. Оценка влияния синтетических антиоксидантов на бактериальные клетки по изменению их электроповерхностных свойств 105
5.2. Определение локализации синтетических антиоксидантов на бактериальных клетках с использованием электронноконтрастных веществ 117
Заключение 120
Выводы 124
Список использованных литературных источников 126
- Характер и особенности повреждений микроорганизмов при консервации
- Определение роли синтетических антиоксидантов в защите бактериальных клеток в условиях стресса, вызванного действием абиотических факторов
- Определение антиоксидантной активности исследуемых соединений
- Роль синтетических антиоксидантов в повышении выживаемости различных групп микроорганизмов
Введение к работе
Актуальность темы. Микроорганизмы являются одним из наиболее существенных компонентов биосферы. Создание и поддержание коллекций микроорганизмов как способы сохранения биоразнообразия является актуальной экологической проблемой. В настоящее время хранение микроорганизмов в жизнеспособном состоянии осуществляется в коллекциях культур, которые создаются в большинстве микробиологических лабораторий и на биотехнологических производствах и используются как в промышленных, так и в исследовательских целях. Главной задачей консервации микроорганизмов является обеспечение их долгосрочного хранения с подержанием высокой жизнеспособности и предупреждением мутационных изменений, то есть в состоянии максимально близком к естественному (Литвин, Гинцбург, 1998).
В основе всех методов консервации, предлагаемых на сегодняшний день, лежит перевод клеток в состояние анабиоза, что ведет к снижению или прекращению всех метаболических процессов (Сидякина, 1985). Основными методами длительного хранения микроорганизмов являются высушивание, лиофилизация, L-высушивание, хранение при низких температурах, криоконсервация, хранение на носителях органической и неорганической природы. При консервации вышеизложенными методами клетки подвергаются действию экологических факторов абиотической природы. Так высушивание приводит к потере биологически активной воды, при криоконсервации и низкотемпературном замораживании клетки претерпевают действие замораживания - оттаивания. В процессе лиофилизации микроорганизмы подвергаются воздействию отрицательных температур и вакуума. В результате перечисленных процессов происходит гибель части клеточной популяции. Еще одной из причин гибели микроорганизмов является окислительный стресс, в результате которого образуются активные формы кислорода, которые оказывают губительное
7 действие на клетки (Фатеева, 1983). Поэтому совершенствование методов консервации является актуальной проблемой в прикладной микробиологии (Осадчая, Кудрявцев, Сафронова, 2002).
Инактивация микроорганизмами активных форм кислорода достигается с помощью собственных антиокислительных систем, в результате чего содержание продуктов свободнорадикального окисления находится на крайне низком уровне (Куликов и др., 1995). Результаты исследований показали, что ферменты, обеспечивающие защиту клеток от окислительного стресса, локализуются преимущественно на наружной мембране, в цитоплазме микроорганизмов, а также обнаруживаются во фракции периплазмы (Дробков, Погорельский, Дармов, 1997; Брюханов, Тауэр, Нетрусов, 2002).
В последнее время появилось большое количество синтетических антиоксидантов - веществ различной химической природы, обладающих антиокислительными свойствами. Одним из перспективных направлений использования этих соединений является применение их в составе сред стабилизации при консервации микроорганизмов, так как некоторые высокоэффективные синтетические антиоксиданты оказывают выраженное защитное действие и стабилизируют состав популяции (Плотников, Шведун, Гусева, 1995; Липатова, Сотников, Федотова, 1995).
Однако на настоящий момент механизмы взаимодействия антиоксидантов с бактериальной клеткой изучены недостаточно, в частности, нами не обнаружены в литературе данные о локализации синтетических антиоксидантов в бактериальных клетках. Практически отсутствуют сведения о компенсации синтетическими антиоксидантами собственных антиокислительных ферментов при стрессовом воздействии на микробные популяции абиотических экологических факторов.
Цель и задачи исследования. Цель работы заключается в поиске и отборе синтезированных гетероциклических соединений и их предшественников с антиоксидантной активностью и применении их для
8 поддержания стабильности популяционного состава коллекционных культур микроорганизмов на фоне действия абиотических экологических факторов.
Для реализации указанной цели были поставлены и решены следующие задачи:
Изучить биологическую активность новых синтетических веществ группы гетероциклических соединений и их предшественников с целью отбора перспективных антиоксидантов.
Определить влияние отобранных синтетических антиоксидантов на стабилизацию свойств исследуемых популяций бактерий на фоне действия экологических факторов абиотической природы.
Выявить взаимоотношение синтетических антиоксидантов нового ряда с собственными антиокислительными ферментами бактериальных клеток.
Установить морфологические изменения в бактериальных клетках при действии различных экологических факторов абиотической природы в сравнительном аспекте с применением отобранных синтетических антиоксидантов.
Изучить влияние синтетических антиоксидантов нового ряда на электроповерхностные свойства бактерий и определить их локализацию. Научная новизна. Впервые была изучена биологическая активность
новых синтетических веществ группы гетероциклических соединений и их предшественников и отобраны перспективные антиоксиданты для практического применения. Показана высокая эффективность применения синтетических антиоксидантов нового класса для стабилизации свойств популяции и увеличения сроков хранения бактерий в процессе консервации (лиофилизации), а также повышение жизнеспособности грамположительных и грамотрицательных бактерий на фоне действия других абиотических факторов (замораживание-оттаивание, ультрафиолетовое излучение). Установлены морфологические изменения в бактериальных клетках при действии различных экологических факторов абиотической природы и
9 сохранение структуры бактерий при использовании отобранных синтетических антиоксидантов.
Впервые установлено влияние синтетических антиоксидантов на электроповерхностные свойства бактерий и отдельные структуры бактериальных клеток и показана локализация синтетических веществ на примере таллийорганических соединений, обладающих антиоксидантной активностью.
Полученные нами данные об изменениях, происходящих в процессе перевода микроорганизмов в состояние анабиоза, позволяют углубить знания о механизмах выживания бактериальных клеток в экстремальных условиях.
Практическая значимость. Изученные и отобранные нами синтетические антиоксиданты предложены как дополнительные компоненты сред защиты, и в дальнейшем могут быть использованы для поддержания стабильности популяционного состава бактерий и повышения их выживаемости в условиях стресса, вызванного действием различных абиотических факторов. Применение разработанного нами методического подхода позволит оптимизировать процедуру поддержания специализированных национальных коллекций, повысить эффективность, безопасность и экономичность их функционирования.
На основании полученных данных разработаны методические рекомендации для студентов, аспирантов и сотрудников микробиологических лабораторий «Методы отбора синтетических антиоксидантов для поддержания коллекционных культур микроорганизмов», утвержденные Ученым советом биологического факультета СГУ (протокол № 9 от 12.04.04 г.).
Полученные нами данные о влиянии синтетических антиоксидантов на собственные антиокислительные системы бактерий и электроповерхностные свойства клеток используются в учебном процессе при чтении общих курсов микробиологии и биотехнологии, а также в специальных курсах при
10 подготовке специалистов-микробиологов в Саратовском государственном университете им. Н.Г. Чернышевского.
Основные положения, выносимые на защиту:
Синтезированные соединения нового ряда группы гетероциклических соединений и их предшественников, обладающие низкой антифаговой и высокой антиоксидантной активностью, могут быть успешно использованы для повышения жизнеспособности и стабилизации свойств популяций коллекционных культур микроорганизмов на фоне стрессовых воздействий различных абиотических факторов.
Взаимодействие новых синтетических антиоксидантов циклического ряда с бактериальными клетками ведет к изменению уровня собственных антиокислительных ферментов, отражающих стабильность состава популяции.
Синтетические антиоксиданты нового ряда из группы гетероциклических соединений и их предшественников, локализуясь на поверхности бактериальных клеток, влияют на их электроповерхностные свойства и повышают целостность мембранных и внутриклеточных структур при стрессовом действии различных абиотических факторов.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и представлены на региональной научной конференции «Молодежь и наука на пороге XXI века» (Саратов, 1998 г), XXVI межвузовской научно-практической конференции по проблемам биологии и медицинской паразитологии, посвященная памяти академика Е.Н. Павловского (Санкт-Петербург, 1999), научной конференции учреждений по борьбе и изучению природно-очаговых инфекций Министерства Здоровья и Социальной Защиты (Улан-Батор, Монголия, 1999) и симпозиуме «Свободные радикалы в биологии и медицине» (Лодзь, Польша, 2000).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, состоящей из 4 глав,
заключения, выводов и списка 174 использованных литературных источников, включающих 101 отечественную и 73 зарубежных работы. Работа изложена на 143 страницах, включает 22 рисунка и 8 таблиц.
\
Характер и особенности повреждений микроорганизмов при консервации
При всех рассмотренных методах консервации имеет место дегидратация. Удаление из клеток воды, необходимой для жизнедеятельности, происходит по-разному: при высушивании вода испаряется, при низкотемпературном хранении и криоконсервации свободная и непрочно связанная с гидрофильными веществами клеток вода замерзает и остается в клетках в виде льда, при лиофилизации внутриклеточная вода вначале замерзает, а затем удаляется из клеток в виде пара при сублимации в вакууме (Сидякина, 1988). Для обеспечения высокого уровня жизнеспособности популяций микроорганизмов при консервации необходимо определить оптимальный способ перевода организма в состояние анабиоза и восстановления культуры при выводе из анабиотического состояния (Аксенов, 1982; Актуальные проблемы...,1981; Аркадьева, 1983; Голдовский, 1981; Калакуцкий, Сидякина, 1984; Пушкарь, Белоус, Цветков, 1984). Стрессы, которым подвергаются живые клетки при консервации, возникают на различных этапах: дегидратация - хранение — регидратация при высушивании, замораживание - хранение - оттаивание при низкотемпературном замораживании и криоконсервации, замораживание — высушивание - хранение - регидратация при лиофилизации. Повреждения клеточных структур могут возникать на каждом из этих этапов, и они могут проявлять себя по-разному в зависимости от природы организма, состава защитной среды, режимов дегидратации и условий восстановления (Белоус, Бондаренко, 1982; Бронштейн, Розанов, 1977; Вопросы криоконсервирования...,1978; Игнатов, Красников, 1981; Иткин, Бронштейн, Розанов, 1977). До настоящего времени механизмы повреждений клеток при консервации точно не установлены. Однако известны некоторые общие закономерности и определены факторы, приводящие к потере жизнеспособности микроорганизмов. Наиболее распространена следующая классификация повреждений микроорганизмов: 1. Дегидратация биомакромолекул и биологических мембран в пределах, вызывающих выпадение их компонентов в осадок и повреждение компонентов. 2. Повышение концентрации электролитов и изменение рН, отклонение рН растворов от физиологических значений, вызывающие денатурационные изменения биомакромолекул, субклеточных структур и других компонентов клетки. 3. Пространственное сближение биомакромолекул и субклеточных частиц, вызывающее их необратимые структурные перестройки. 4. Образование вне- и внутриклеточных кристаллов льда, которые могут вызывать механические повреждения структурных компонентов клеток (мембранные структуры, каталитические белки и др.) (Белоус, Бондаренко, 1982; Механизмы криоповреждения..., 1977; Пушкарь, Белоус, 1977). Согласно современным представлениям считают, что мембранный аппарат всех типов живых клеток является основной «мишенью» повреждений при дегидратации (Игнатов, Красников, 1981). Нарушения структурно-функциональной организации мембранного аппарата клеток, в первую очередь, определяют жизнеспособность микроорганизмов при консервации (Белоус, Бондаренко, 1982; Вопросы криоконсервирования..., 1978; Механизмы криоповреждения..., 1977; Пушкарь, Белоус, Цветков, 1984). Известно, что при охлаждении клеточных структур наблюдается ослабление гидрофобных связей в биологических мембранах, что приводит к их нестабильности (Белоус, Бондаренко, 1982; Пушкарь, Белоус, Цветков, 1984; Effect of ..., 1981). Также считают, что одной из причин нарушения мембранного аппарата микроорганизмов при замораживании является дегидратация клеток, приводящая к перестройкам в липид-белковых комплексах биомембран. Основное проявление повреждения мембран бактерий - нарушение барьера проницаемости, которое носит, в основном, функциональный характер (Пучков, Говорунов, 1983). Предполагается, что в основе повреждения мембран лежит дезорганизация их компонентов (Белоус, Бондаренко, 1982; Игнатов, Красников, 1981). Установлено, что повреждения мембран микроорганизмов при лиофилизации, высушивании и замораживании могут приводить к регистрируемым нарушениям клеточного барьера проницаемости, которые приводят к вытеканию содержимого клетки в окружающую среду, в том числе к выходу мембранных белков, липидов, полисахаридов. Также могут происходить изменения в функционировании мембраносвязанных ферментов (Игнатов, Красников, 1981; Пушкарь, Белоус, Цветков, 1984).
Существует предположение, что мембранные структуры с высоким содержанием насыщенных жирных кислот отличаются высокой способностью сохраняться при обезвоживании, так как содержат липиды с линейными жирнокислотными цепями, что способствует более сильному сжатию монослоев (Пушкарь, Белоус, 1981)
Помимо нарушений мембранного аппарата при консервации могут происходить нарушения, которые не восстанавливаются при реактивации: необратимые повреждения ядерного аппарата, ДНК, РІЖ, белков.
Установлено, что сублимация в препаратах и клетках вызывает обратимый разрыв водородных связей, поддерживающих вторичную и третичную структуры в белковых молекулах. При повреждении гидратационной оболочки нарушаются и внутримолекулярные водородные связи (Бекер, Рапопорт, Калакуцкий, 1987; Демина, Лысенко, 1987; Пушкарь, Белоус, Цветков, 1984). Мембранные белки содержат SH-группы, которые играют важную роль в регулировании транспорта ионов через плазматическую мембрану.
Определение роли синтетических антиоксидантов в защите бактериальных клеток в условиях стресса, вызванного действием абиотических факторов
Баланс и взаимодействие между антиокислительными ферментными системами бактериальных клеток (СОД, продукты окисления гидроперекиси) и синтетическими антиоксидантами, применяемыми в составе сред стабилизации при лиофилизации, изучался нами на модели вакцинного штамма Y.pestis EV НИИЭГ.
Белок в клетках бактерий (как интактных, так и разрушенных) определяли по методу Лоури (Lowry et al., 1951) в модификации М. А. К. Markwell et al. (1978) для определения белка в мембранах. В работе использовали реактив А, состоящий из 2,0 % Na2S04,0,4 % NaOH, 0,16 % Na-тартрата и 1 % SDS (Pierce), реактив В (4 % CuS04- 5Н20), реактив С (100А:1В) и реактив Фолина, который в день использования разводили 1:1 дистиллированной водой. К 1 мл образца, содержащему 10-100 мкг белка, добавляли 3 мл реактива С и оставляли при комнатной температуре в течение 10-60 минут. Затем вносили 0,3 мл реактива Фолина и инкубировали при комнатной температуре 45 минут. Измерения проводили при Х,=660 нм.
Активность СОД определяли в тесте изменения интенсивности окрашивания исследуемых образцов. Данная методика основана на изменении окраски красителя NBT- 2НС1 - нитротетразолиевого синего при освещении и образовании перекисных радикалов, которые приводят к переходу в синий формазан, а наличие СОД гасит синюю окраску. Супероксидный радикал генерируется фотохимическим способом в 50 мМ фосфатном буфере рН 7,8 с добавлением рибофлавина (0,1 мл 5 мМ раствора) и метионина (0,1 мл 150 мМ раствора). В изучаемый образец вносили тетразолиевый краситель и облучали его в стеклянных кюветах при 560 нм в течение 7 минут. После внесения пробы регистрировали снижение интенсивности окрашивания на спектрофотометре марки Beckman-25 (Beyer, Fridovich, 1987).
Определение продуктов окисления липидов (гидроперекисей) проводили по методу, который основан на способности гидроперекисей липидов окислять двухвалентное железо до трехвалентного, которое можно обнаружить при помощи цветной реакции с тиоционатом аммония (Summer, 1943):
Для этого к 2 мл клеток (концентрация белка 7-8 мкг/мл) добавляли 0,2 мл 50% трихлоруксусной кислоты (ТХУ) (конечная концентрация 50%) и центрифугировали при 4000 g. Затем отбирали надосадочную жидкость, к 2 мл которой добавляли 96% этанол до 27 мл, 0,2 мл концентрированной соляной кислоты и 0,025 мл 5% соли Мора в 3% соляной кислоте. Пробу интенсивно встряхивали в течение 30 минут. Далее добавляли 1 мл 20% тиоцианата аммония, в результате чего в течение 10 минут развивалась интенсивная малиновая окраска. В качестве контроля использовали пробы, содержащие 96% этанол вместо надосадочной жидкости. Измерения проводили в стеклянных кюветах при X = 480 нм.
В качестве экспериментальной модели использовали клетки вакцинного штамма Yersinia pestis EV НИИЭГ. Бактерии выращивали в течение 48 часов при 28 С во флаконах на скошенном агаре Хоттингера (рН 7,2) и отмывали фосфатным нейтральным буфером, достигая концентрации п 1014"15 кл/мл. Разрушенные клетки получали 4-5-кратной обработкой в УЗ-дезинтеграторе тип UD-20 (фирмы Techpam) в течение 40 секунд каждого цикла с интервалом в 3 минуты.
Определение влияния синтетических антиоксидантов на выживаемость грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов при стрессовом действии абиотических факторов В качестве экспериментальной модели использовали клетки Escherichia coli 58 и Staphylococcus aureus 209 Р, выращенные на плотной питательной среде (агар Хоттингера, рН 7,2) при 37 С в течение 24 часов. Суточную культуру засевали в жидкую питательную среду (бульон Хоттингера, рН 7,2) и помещали в термостат на 2 часа при температуре 37 С для получения контрольного результата. Для получения опытного результата в одну пробирку вносили исследуемый АО в концентрации 25 мкг/мл, а в другую пробирку - 0,1 % растворитель АО (например, диметилсульфоксид (ДМСО), этанол). Затем посевы микроорганизмов подвергали действию стрессовых факторов, в качестве которых нами были выбраны: 1. замораживание - оттаивание; 2. ультрафиолетовое излучение. Результаты по замораживанию-оттаиванию наблюдали в двух режимах: - действие температуры -18 С в течение 1 часа; - действие температуры -18 С в течение 1 суток. При изучении действия УФ излучения также использовали два режима: - облучение взвеси микроорганизмов в течение 1 минуты; - облучение взвеси микроорганизмов в течение 5 минут. После проведенных манипуляций производили посев 0,1 мл взвеси микроорганизмов на чашки Петри с плотной питательной средой (агар Хоттингера, рН 7,2) и инкубировали в термостате в течение 24 часов при 37 С. Для учета результата подсчитывали количество колоний в опытных и контрольных образцах и определяли процент выживаемости клеток по формуле: 2.6. Методы консервации микроорганизмов и определения продолжительности их хранения Консервацию микроорганизмов проводили методом лиофильного высушивания на базе Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ «Микроб». Лиофильное высушивание осуществляли на коллекторном аппарате системы К.Е. Долинова (вакуум на разных этапах технологического процесса составлял 4 - 10 Па) (Инструкция по лиофильному высушиванию..., 1979). Культуру вакцинного штамма чумного микроба для лиофилизации выращивали на скошенном агаре Хоттингера (рН 7,2) при 28 С в течение 48 часов. Выращенную культуру смывали средой высушивания - сахарозо-желатиновой средой (среда Файбича), состоящей из 10% сахарозы, 1,5 % желатины и 0,1% агара (рН 7,1-7,2) - СЖА. Приготовленную взвесь микробов разливали в стерильные ампулы по 0,2 мл и лиофилизировали. Оценка антиоксидантных свойств тестируемых соединений проводилась при лиофилизации вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ. Удобным подходом для решения задачи по определению продолжительности хранения лиофилизированных препаратов бактерий является методика ускоренного определения сроков хранения вакцинного штамма чумного микроба (Методика определения термостабильности..., 1985). В каждой серии опытов испытывалось 6 образцов (ампул): 3 ампулы служили контролем (температура хранения 0-4С) и их жизнеспособность определяли сразу, а другие 3 ампулы (опытный образец) хранили 14-15 суток при температуре 37 С. Расчеты проводили по формуле:
Определение антиоксидантной активности исследуемых соединений
Для изучения роли синтетических антиоксидантов в защите грамположительных и грамотрицательных бактериальных клеток при различных стрессовых воздействиях абиотических факторов использовали диметилциклогександион.
В качестве стресса были выбраны замораживание-оттаивание (действие температуры -18 С в течение 1 часа и 1 суток) и действие УФ излучения (режимы облучения 1 и 5 минут). Выбор в качестве стрессового воздействия «переход бактерий в состояние анабиоза под действием низких температур с последующим оттаиванием» был обусловлен, прежде всего, тем, что хранение при низких температурах является одним из способов поддержания коллекционных культур микроорганизмов. А стрессовое действие УФ излучения микроорганизмы испытывают в естественных условиях обитания. Результаты по влиянию диметилциклогександиона на выживаемость бактерий в условиях стресса представлены в таблице 7. Анализ полученных данных показал, что к действию УФ излучения более чувствительны клетки грамотрицательной Е. coli, чем пигментообразующие клетки грамположительного S. aureus. Однако увеличение длительности воздействия снижало количество выживших клеток в контроле. Результаты с использованием ДМСО недостоверно отличались от контроля. В тоже время внесение в среду культивирования бактерий синтетического АО сопровождалось увеличением числа жизнеспособных клеток не зависимо от длительности действия УФ излучения. Изучение морфологических особенностей клеток Е. coli 58 на фоне действия абиотических факторов позволило выявить изменения в популяционном составе. На рис. 3-а представлена фотография мазка полиморфной культуры после стрессового действия «замораживание — оттаивание», где отчетливо видно большое число клеток с измененной морфологией (коккоподобные формы, клетки с бифуркацией и разрушенные). При внесении в среду культивирования исследуемого синтетического антиоксиданта отмечено сохранение большинством клеток исходной морфологии (однотипные удлиненные палочки - рис. З-б).
На рис. 4, 5, 6, 7 представлены графики влияния ДМСО и диметилциклогександиона (АО) на выживаемость клеток E.coli 58 и S. aureus 209Р, подвергнутых действию стрессовых факторов.
Анализ полученных данных показал, что внесение в состав среды культивирования исследуемого соединения в условиях действия УФ излучения приводило к повышению выживаемости Е. coli 58 в 1,4-2,9 раз (в зависимости от длительности действия стрессового фактора), a S. aureus 209-Р в 1,9 раз по сравнению с контролем.
Действие стрессового фактора, связанного с замораживанием -оттаиванием, сопровождалось угнетением жизнеспособности как грамотрицательных, так и грамположительных бактерий. При этом % выживших клеток зависел от длительности пребывания в замороженном состоянии. Внесение в среду культивирования бактерий ДМСО незначительно повышало устойчивость клеток. Применение в аналогичных условиях синтетического АО способствовало сохранению большего числа жизнеспособных клеток и грамотрицательных, и грамположительных бактерий. Следовательно, в условиях стрессового действия низких температур выживаемость Е. coli возрастала в 4,1 - 8,5 раз, a S. aureus - в 4,4-6,8 раз (соответственно длительности действия) по сравнению с контролем.
Таким образом, диметилциклогександион, применяемый нами в качестве синтетического АО, повышал жизнеспособность микроорганизмов в условиях стрессовых воздействий различного характера.
Роль синтетических антиоксидантов в повышении выживаемости различных групп микроорганизмов
Одним из проявлений стрессового состояния, переживаемого бактериальной клеткой в процессе лиофилизации, являются повреждения аппарата ДІЖ, клеточной стенки, мембранных структур, которые выявляются методами электронной микроскопии.
Нами изучалось изменение ультраструктуры бактериальных клеток Y. pestis EV НИИЭГ. Процессы, сопутствующие стрессовому состоянию бактериальной клетки во время лиофилизации, были смоделированы на различных этапах технологического процесса: 1. до начала лиофилизации; 2. через 1 час экспозиции в СОг (-70 С); 3. через 2 часа вакуума (4-7 Па) в С02 (-70 С); 4. через 2 часа лиофилизации в вакууме (6-10 Па) без ССЬ; 5. завершение лиофилизации - через 8-9 часов. На каждом этапе лиофилизации были изготовлены ультратонкие срезы контрольных и опытных образцов Ypestis EV НИИЭГ. Изучение исходной культуры Y. pestis EV НИИЭГ показало, что большинство клеток имело характерные для чумного микроба, как морфологические (длина клетки 1,5-2,0 мкм, ширина 0,5 мкм), так и ультраструктурные образования: трехконтурную внешнюю мембрану толщиной 9 нм (два электронноплотных слоя, а между ними электроннопрозрачный). Цитоплазматическая мембрана по структуре и размерам была аналогична внешней мембране. Между клеточной стенкой и цитоплазматической мембраной располагалось периплазматической пространство, ширина которого равна 2,5-3,0 нм в неполярных участках бактериальной клетки. Общая толщина мембран у клеток исходной культуры вместе с периплазматической зоной составляла 21 нм.
Содержимое цитоплазмы представлено электронноплотным материалом с включенными в нее рибосомами диаметром 20 нм и фибриллярными структурами. Между этими компонентами цитоплазмы диффузно расположена электроннопрозрачная зона нуклеоида. В некоторых участках цитоплазмы нуклеоид находился в контакте с цитоплазматической мембраной (рис 11).
При часовой экспозиции исходной культуры чумного микроба в углекислоте (-70 С) на электроннограмме было видно, что защитное вещество СЖА покрывает всю или часть поверхности клеточной стенки. При этом ее толщина увеличивалась до 12-14 нм, а периплазматическое пространство —до 9-10 нм. Общая толщина мембран бактериальной клетки достигала 35-40 нм. Нуклеоид концентрировался в центральной части клетки.
На следующем этапе лиофилизации бактериальные клетки подвергались действию вакуума в условиях низкой температуры (-70 С) в течение 2 часов. По истечении этого времени обнаруживалось, что защитное вещество располагалось более компактно, обвалакивая каждую клетку или группу клеток. Просматривалось увеличенное периплазматическое пространство, а у некоторых клеток в цитоплазме появлялись вакуоли. Нуклеоид занимал центральную часть клетки, и в нем просматривалась сетка, состоящая из фибриллярных структур с электронноплотными включениями неправильной формы. В некоторых клетках цитоплазма, окружающая нуклеоид, имела высокую электронную плотность. Здесь же обнаруживались разрушенные клетки, у которых наблюдался выход цитоплазмы (рис. 12).
Ультраструктура клеток Y.pestis EV НИИЭГ после двухчасовой экспозиции в условиях вакуума без углекислоты (4-й этап лиофилизации) представляла картину аналогичную 3-му этапу лиофилизации. При этом количество СЖА в межклеточном пространстве было меньше. Однако на поверхности бактерий она просматривалась в виде фибриллярных структур вплоть до конца процесса лиофилизации.
Поскольку было выявлено максимальное действие экстримальных факторов на 3 этапе, а 4 и 5 этапы практически не меняли картины происходящих изменений, то опытные образцы исследовались до начала лиофилизации и на ее конечном этапе.
При исследовании препаратов с добавлением АО была выявлена следующая закономерность. На рисунке 13 представлена электронная микрофотография клеток вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ, лиофилизация которых проходила с добавлением метоксифени-гексагидрохинолина. В опытных образцах, по сравнению с контролем, в большем числе случаев в полях зрения фиксировались неповрежденные бактериальные клетки, как отдельные, так и их скопления. Это свидетельствовало об успешной реализации механизмов защиты бактериальной клетки с помощью использованных АО. Здесь же отмечалось сохранение тонких структур клеток: нуклеоида, рибосомального аппарата.
Сопоставляя данные размеров всех клеточных образований (внешней и цитоплазматической мембраны, периплазматического пространства), мы не выявили различий в опытных и контрольных образцах, но наличие большего числа неповрежденных клеток, сохранение тонких структур свидетельствовало о преимуществе использования новых типов АО в составе сред защиты в процессе лиофилизации коллекционных штаммов.
