Введение к работе
Актуальность темы. Молекулы белков и ДНК являются важными объектами в изучении морфогенетических процессов растений на молекулярном и клеточном уровнях. Результаты этих исследований представляют большой интерес не только для развития фундаментальной науки, но и для биотехнологии, создавая основу для совершенствования селекционного процесса с использованием современных клеточных технологий. Исследования подобного рода на уровне целого растения затруднены интегральным характером морфогенетических процессов и зависимостью их от многих внутренних и внешних факторов (Бутенко, 1999; Батыгина, 1999).
Изолированные культуры органов, тканей и клеток, помещенные в контролируемые условия (минеральное питание, температура, освещенность и экзогенные гормональные добавки), являются удобными моделями для изучения морфогенетических процессов у растений. В частности, принципиально важным моментом в исследованиях соматического эмбриогенеза является анализ самых ранних его этапов, когда отдельные клетки в каллусной массе или суспензии приобретают способность развиваться в эмбриоид. Прежде всего, представляют интерес сигналы и индукторы этого процесса, заставляющие недифференцированную клетку in vitro переключаться на определенный путь развития (Бутенко, 1999; Лутова, 2003).
Выяснение молекулярных основ морфогенеза растений привлекает внимание довольно большого числа исследователей. Особое внимание уделяется, например, генам-переключателям развития (Хавкин, 1998; Smith et ah, 2004; Sablowski, 2007) и продуктам их экспрессии (Карабаев и Джардемалиев, 1994; Bommert et ah, 2005; Cole et ah, 2006), которым отводится основная роль в пространственно-временной регуляции процессов морфогенеза. Несмотря на это, еще недостаточно изученными остаются гены, контролирующие наиболее общие процессы деления и последующей дифференциации клеток (Reddy and Meyerowitz, 2005; Dewitte and Murray, 2003). Именно они определяют судьбу индивидуальной клетки: продолжать ли ей делиться или переходить к растяжению и дифференциации.
Кроме того, закономерности морфогенеза, установленные для конкретного генотипа в полевых экспериментах in vivo, могут значительно измениться при культивировании эксплантов в культуре in vitro (Батыгина, 1999; Соболева и Логинов, 2004). Учитывая, что решение задач повышения эффективности морфогенеза имеет большое значение для развития соответствующих биотехнологий с использованием методов клеточной селекции растений, представляется актуальным сравнительный анализ особенностей протекания соответствующих процессов, происходящих in vivo и in vitro. Их решению может способствовать выявление надежных биохимических и/или морфологических маркеров, отражающих общие закономерности развития растений в условиях in vivo и in vitro и позволяющих отбирать генотипы с высоким морфогенетическим потенциалом.
К началу наших работ по данной теме в исследованиях, начатых в группе
иммунохимии растительных клеток ИФР РАН (г. Москва) под руководством А.Д. Володарского и продолженных совместно в Лаборатории физической химии клеточных структур ИБФРМ РАН, был выявлен молекулярный маркер ме-ристематических клеток пшеницы, названный пролиферативным антигеном инициалей (ПАИ). Разработаны теоретические и экспериментальные основы технологии создания иммунодиагностикума к ПАИ и исследовано его распределение в тканях и органах растения. Установлена целесообразность использования ПАИ в качестве белкового маркера меристематических клеток пшеницы для оценки селекционного растительного материала на устойчивость к действию неблагоприятных факторов внешней среды (Володарский с соавт., 1996; Евсеева с соавт., 2004; Evseeva etal, 2004).
Целью настоящей работы было изучение субклеточной локализации ПАИ с использованием усовершенствованной иммунохимической тест-системы, анализ гомологичности антигенных детерминант ПАИ соответствующим структурам белков растений других таксономических групп и оценка его информативности в качестве молекулярного маркера меристематических клеток в исследованиях морфогенетических процессов в культуре in vitro пшеницы. В ходе исследования решали следующие задачи:
Усовершенствовать методику получения и очистки моноспецифических антител к ПАИ.
Исследовать субклеточную локализацию ПАИ с использованием усовершенствованной иммунохимической тест-системы.
Оценить иммунохимическую гомологию ПАИ цитоплазматическим белкам меристем растений различных таксономических групп.
Исследовать динамику содержания ПАИ в соматических каллусах почти изогенных линий пшеницы, альтернативных по генам короткостебельности Rht, в процессе каллусогенеза и вторичной дифференциации.
Провести сравнительный анализ содержания ПАИ в меристематических зонах in vivo и каллусных клетках in vitro почти изогенных линий пшеницы, альтернативных по ряду генов короткостебельности Rht.
Научная новизна работы. Впервые проведено исследование внутриклеточной локализации ПАИ. Показано, что ПАИ является цитозольным белком. Впервые обнаружена иммунохимическая гомология ПАИ цитоплазматическим белкам растений различных таксономических групп. Выявлена общая закономерность динамики содержания ПАИ в процессе каллусогенеза и вторичной дифференциации в культуре in vitro на генетической модели, включающей 7 генотипов яровой мягкой пшеницы. На примере трёх генов короткостебельности RhtBlc, Rht 14 и RhtBlb показано их влияние на содержание ПАИ в каллус-ных клетках пшеницы. Впервые установлено, что содержание ПАИ в меристематических клетках узлов кущения почти изогенных линий пшеницы in vivo в целом отражает морфогенетический потенциал соматических каллусов тех же линий в культуре in vitro. Впервые показано, что уровень содержания ПАИ в каллусных клетках пшеницы позволяет оценить их морфогенетическую способность на более ранних этапах по сравнению с морфометрическим анализом.
Научно-практическая значимость. Полученные результаты позволяют рекомендовать ПАИ для исследований морфогенетических процессов в растениях, что открывает перспективу его использования в соответствующих отраслях агробиотехнологии в качестве дополнительного критерия морфогенетической способности тестируемых линий пшеницы в селекционной работе.
Кроме того, предложенная нами стратегия получения высокоспецифических поликлональных антител может быть использована в иммунохимических исследованиях белков эукариотических и прокариотических клеток.
Результаты работы используются в учебном процессе при подготовке курсовых и дипломных работ студентов в Саратовском государственном университете им. Н.Г.Чернышевского и в Саратовском государственном аграрном университете им. Н.И.Вавилова.
Апробация работы. Материалы исследований, изложенные в диссертации, были представлены на 9-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века» (Пущино, Россия, 2005), на 4-й Всероссийской конференции молодых ученых «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Саратов, Россия, 2003), на Всероссийской конференции «Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты» (Саратов, Россия, 2005), на Всероссийской конференции «Стрессовые белки растений» (Иркутск, Россия, 2004), на международной конференции «Физиология растений - основа фитобиотехнологии» (Пенза, Россия, 2003), на межрегиональной конференции молодых ученых и специалистов системы АПК Приволжского федерального округа «Вавиловские чтения - 2003» (Саратов, Россия, 2003), на Всероссийских конференциях «Вавиловские чтения - 2004, - 2005, - 2006» (Саратов, Россия, 2004-2006).
Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании лаборатории физической химии клеточных структур ИБФРМ РАН.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 2 статьи в отечественных рецензируемых научных изданиях.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
ПАИ выявляется только в цитозоле меристематических клеток пшеницы и не обнаружен в ядрах, хлоропластах, митохондриях, плазмалемме и мембранных фракциях ряда клеточных органелл.
Цитоплазматические белки ржи, сорго, подсолнечника и вольфии содержат антигенные детерминанты, гомологичные детерминантам ПАИ.
Гены короткостебельности RhtBlc, Rhtl4 и RhtBlb оказывают влияние на динамику содержания ПАИ в процессе каллусогенеза и вторичной дифференциации соматических каллусов почти изогенных линий пшеницы, альтернативных по этим генам.
Содержание ПАИ в меристематических клетках узлов кущения почти изогенных линий пшеницы в полевых экспериментах in vivo в целом отражает морфогенетическую способность каллусной ткани тех же линий в культуре in vitro.
5. Определение содержания ПАИ в соматических каллусах пшеницы позволяет оценить их морфогенетическую способность на более ранних этапах по сравнению с морфометрическим анализом, что открывает перспективу его использования в агробиотехнологии в качестве дополнительного критерия в селекционной работе.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 292 источника, в том числе - 219 зарубежных. Работа изложена на 119 страницах машинописного текста, содержит 30 рисунков.
Работа выполнена в лаборатории физической химии клеточных структур ИБФРМ РАН в соответствии с плановой темой НИР «Разработка эффективных тест-систем к антигенным структурам клеток микроорганизмов и растений» (№ гос. регистрации 01890017743). Научный руководитель - зав. лаб., д.х.н., профессор СЮ. Щеголев.
