Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Общая характеристика молочнокислых бактерий 11
1.1. Классификация молочнокислых бактерий 12
1.2. Источники молочнокислых бактерий
1.2.1. Распространение молочнокислых бактерий в ризосфере 14
1.2.2. Распространение молочнокислых бактерий в эпифитной микрофлоре
1.3. Молочнокислые бактерии - антагонисты грибов и бактерий 25
1.4. Бактерии семейства Lactobacillaceae, синтезирующие фитогормоны и способствующие росту и развитию растений 30
Глава 2. Микробиологические процессы, протекающие при хранении влажного зерна, и роль молочнокислых бактерий в этих процессах 39
2.1. Микробиологические процессы, протекающие во влажном зерне при хранении 40
2.2. Роль грибов-продуцентов микотоксинов в порче влажного зерна при хранении 43
Глава 3. Применение молочнокислых бактерий 46
3.1. Использование гетероферментативных молочнокислых бактерий для консервирования влажного плющеного зерна 46
3.2. Применение биопрепаратов на основе молочнокислых бактерий в растениеводстве и животноводстве 49
Экспериментальная часть
Глава 4. Материалы и методы 55
4.1. Объекты исследований 55
4.2. Отбор и подготовка образцов ризосферы, филлосферы и плющеного зерна для исследования 62
4.3. Методы культивирования и количественного учета микроорганизмов. Выделение чистых культур 62
4.4. Изучение антимикробной активности штаммов молочнокислых бактерий в лабораторных экспериментах 64
4.5. Изучение ростстимулирующей активности штаммов молочнокислых бактерий и продуктов их метаболизма в лабораторных экспериментах 64
4.6. Изучение способности к колонизации растений штаммом Lactobacillus buchneri 600 65
4.7. Выделение и хроматографический анализ антифунгальных метаболитов штамма L. buchneri 600 66
4.8. Выделение и хроматографический анализ фитогормонов штамма L. buchneri 600 67
4.9. Изучение ростстимулирующей активности штаммов (L. buchneri 600, ТІ23, Т133, Б157) и продуктов их метаболизма в условиях вегетационных и полевых опытов 68
4.10. Изучение ростстимулирующей активности штамма L. buchneri на посевах льна в условиях полевого опыта 71
4.11. Оценка эффективности применения штамма L. buchneri против возбудителя фузариоза томатов в условиях вегетационного опыта 74
4.12. Консервирование плющеного зерна в производственных условиях...75
4.13. Анализ качества плющеного зерна. Определение микотоксинов 75
4.14. Математическая и статистическая обработка результатов 76
Результаты исследований.
Глава 5. Выделение и изучение свойств штаммов молочнокислых бактерий в опытах in vitro 77
з
5.1. Численность молочнокислых бактерий в ризо- и филлосфере растений 77
5.2. Выделение и фенотипическая характеристика штаммов молочнокислых бактерий, обладающих антагонистическими свойствами 80
5.3. Продуцирование антимикробных метаболитов штаммом L. buchneri 600 89
5.4. Ростстимулирующая активность молочнокислых бактерий и продуктов их метаболизма 93
5.5. Продуцирование ауксинов штаммом L. buchneri 600 96
5.6. Колонизация прикорневой зоны растений штаммом L. buchneri 600 104
Глава 6. Оценка эффективности применения штаммов молочнокислых бактерий для защиты от болезней и повышения урожайности сельскохозяйственных культур ... 108
6.1. Эффективность применения молочнокислых бактерий на посевах
сельскохозяйственных культур в условиях вегетационных опытов 108
6.1.1. Эффективность применения штамма L. buchneri 600 на посевах овощных культур 108
6.1.2. Результаты применения молочнокислых бактерий и продуктов их метаболизма на посевах льна 114
6.1.3. Эффективность использования штамма L. buchneri 600 на сое 121
6.1.4. Особенности применения штамма L. buchneri 600 на салате и пшенице 125
6.1.5. Использование штамма L. buchneri 600 против фузариоза томатов 130
6.2. Применение штамма L. buchneri 600 на посевах кормовых культур в условиях микрополевых опытов , 134
6.3. Эффективность L. buchneri 600 при использовании на льне в условиях полевого опыта 136
Глава 7. Консервирование плющеного зерна штаммом L. biichneri 600 в производственных условиях 146
7.1. Качество плющеного зерна 147
7.2. Численность основных групп микроорганизмов и содержание микотоксинов в плющеном зерне 148
Заключение 151
Выводы 168
Список литературы 171
- Распространение молочнокислых бактерий в эпифитной микрофлоре
- Роль грибов-продуцентов микотоксинов в порче влажного зерна при хранении
- Применение биопрепаратов на основе молочнокислых бактерий в растениеводстве и животноводстве
- Изучение антимикробной активности штаммов молочнокислых бактерий в лабораторных экспериментах
Введение к работе
Актуальность проблемы. Молочнокислые бактерии играют большую
роль в ряде отраслей промышленности и сельского хозяйства. Эти
микроорганизмы поделены исследователям (Orla-Jensen, 1919; Nilsson et al,
1956; Langston et al, 1960; Whittenbury, 1965; Whittenbury, 1966; Axelsson et al,
2004) на две основные категории: гомо- и гетероферментативные. В отличие от
гомоферментативных гетероферментативные молочнокислые бактерии
обладают более широким набором ферментов и, как следствие, более выраженной способностью к синтезу разнообразных биологически активных веществ (летучих кислот, этилового спирта, углекислоты, диацетила, перекиси водорода, антибиотиков) (Shtitz et al, 1984; Nissen-Meyer, et al, 1997; Lavermicocca et al., 2003; Strom et al., 2005). Многие виды молочнокислых бактерий распространены в почвах и, что особенно важно, в ризосфере растений (Квасников 1948, 1956, 1960; Chen et al.; 2005). К настоящему времени в литературе описано множество штаммов молочнокислых бактерий, обладающих антагонистическими свойствами в отношении различных микроорганизмов, в том числе фитопатогенных (Квасниковым, 1956; Dodd et al, 1994; Vescovo et al, 1996; Valerio et al., 2004). Более того, ряд исследователей (Квасников, 1960; Ташпулатов и др., 2005; Kuwaki et al., 2004) обнаружили положительное воздействие на рост и развитие растений со стороны молочнокислых бактерий. Отмечено также стимулирующее влияние карбоновых кислот - продуктов метаболизма молочнокислых бактерий - на всхожесть семян и развитие проростков растений (Kuwaki et al., 2004).
Все вышеперечисленное открывает возможность широкого внедрения в растениеводство микробных препаратов, основой для которых могут являться молочнокислые бактерии, особенно гетероферментативные. Их способность во многих случаях активно заселять ризосферу, а также антимикробные и фитостимулирующие свойства могут быть реализованы наиболее полно в этой отрасли сельского хозяйства. Кроме того, современное направление развития растениеводства ориентировано на сокращение объемов применения азотных и фосфорных удобрений и отказ от пестицидов, небезопасных для здоровья человека и приводящих к проблеме резистентности микроорганизмов.
Аналогичная обстановка, связанная с тенденцией уменьшения применения химических консервантов, складывается и в кормопроизводстве. Как известно, зеленые корма, предназначенные для силосования, содержат большое количество спонтанных молочнокислых бактерий, которые быстро размножаются в силосе и синтезируют молочную кислоту, поэтому процесс силосования может протекать зачастую и без внесения биологических заквасок и химических консервантов (Лаптев, 2005). Однако при хранении влажного зерна протекающие в нем микробиологические процессы отличаются от таких же процессов при силосовании зеленых кормов: анаэробные условия в первом случае создаются только через 1-2 дня (Киров, 1982), поэтому возникают благоприятные условия для роста нежелательной микрофлоры. Особенно опасно присутствие в корме плесневых грибов, которые не только существенно снижают содержание сухого вещества в зерне, но и способны продуцировать микотоксины, негативно влияющие на здоровье животных и человека. В связи с
этим актуальными представляются исследования, направленные на поиск молочнокислых бактерий с широким спектром антимикробной активности для борьбы с нежелательной микрофлорой и накоплением микотоксинов при хранении влажного зерна для получения качественного продукта.
На сегодняшний день зарубежный и отечественный опыт свидетельствует о перспективности практического использования молочнокислых бактерий в качестве основы ряда коммерческих биопрепаратов для консервирования влажного зерна («Биотроф-600», «Biocrimp», «Biograin» и др.). Однако в литературе практически отсутствуют сведения о разработке биопрепаратов антифунгального и одновременно фитостимулирующего действия для комплексного использования в растениеводстве и кормопроизводстве, что инициирует проведение исследований в этом направлении.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось получение штамма молочнокислых бактерий с высоким спектром антимикробной и фитостимулирующей активности и изучение его физиолого-биохимических свойств с целью создания основы биопрепарата для комплексного использования в растениеводстве и кормопроизводстве.
В соответствии с поставленной целью выполнялись следующие задачи:
Исследование филло- и ризосферы растений как природного местообитания молочнокислых бактерий;
Выделение из филло- и ризосферы растений и осуществление скрининга штамма молочнокислых бактерий с высоким спектром фитостимулирующей активности и антимикробных свойств в отношении патогенных микроорганизмов;
Выяснение возможных механизмов антимикробной и фитостимулирующей активности отобранного штамма;
Оценка биологической эффективности отобранного штамма в лабораторных и производственных условиях.
Научная новизна работы. Впервые установлено, что эпифитный штамм гетероферментативной молочнокислой бактерии L. buchneri 600 обладает выраженной антагонистической активностью, подавляя рост многих условно патогенных и патогенных бактерий, а также фитопатогенных грибов.
В условиях вегетационных, микрополевых и полевых опытов экспериментально доказано, что обработка различных сельскохозяйственных культур штаммом L. buchneri 600 позволяет значительно увеличить их урожайность. Этот факт дает возможность предположить, что молочнокислые бактерии, обитающие в ризо- и филлосфере, находятся в мутуалистических взаимоотношениях с растениями. Кроме того, впервые в результате производственных испытаний установлено, что штамм-антагонист L. buchneri 600 эффективно борется с накоплением микотоксинов при хранении влажного плющеного зерна. Все это в совокупности определяет перспективность использования исследуемого штамма в качестве основы нового биопрепарата комплексного действия.
Изучено влияние интродуцированного штамма L. buchneri 600 на ризосферную микрофлору под посевами различных сельскохозяйственных
культур. При этом наблюдалась зависимость увеличения урожайности в вариантах с инокуляцией семян некоторых культур от снижения содержания грибов.
С использованием хроматографического метода выявлены антимикробные метаболиты, продуцируемые штаммом L. buchneri 600. По результатам тестирования обнаружены три фракции с антимикробной активностью, в том числе масляная и валериановая кислоты. Помимо этого, с использованием аналогичного метода показано, что L. buchneri 600 способен к синтезу фитогормонов - ауксинов. При этом показана зависимость биосинтеза фитогормонов от присутствия в среде L-триптофана.
Установлено, что штамм L. buchneri 600 обладает способностью к заселению ризосферы растений.
Практическое значение работы. В результате исследований создана коллекция молочнокислых бактерий из рода Lactobacillus, для формирования которой в качестве ключевого критерия была использована антагонистическая активность этих бактерий в отношении условно патогенных и патогенных микроорганизмов.
Помимо этого, результаты исследований, освещенные в диссертационной работе, нашли применение в трех хозяйствах Ленинградской и Новгородской областей, что подтверждено актами о внедрении научных исследований.
Кроме того, полученные данные позволяют рекомендовать штамм L. buchneri 600 в качестве основы препарата, стимулирующего рост определенного набора сельскохозяйственных культур, для комплексного использования в растениеводстве, а также в кормопроизводстве - для борьбы с нежелательной микрофлорой и накоплением микотоксинов во влажном плющеном зерне при хранении.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Международном конгрессе "Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические аспекты", Санкт-Петербург, 15-16 мая 2007 г., на IV межрегиональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой», Саратов, 14-16 октября 2008 г., на научной конференции профессорско-преподавательского состава, Санкт-Петербург, Пушкин, 29, 30 января 2009 г., на Postgraduate Course «Applied and fundamental aspects of responses, signaling and developmental process in the root-microbe systems», Saint-Petersburg, June 25 - July 2, 2007 г. и на Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы заготовки, хранения и рационального использования кормов», Москва, 19, 20 августа 2009 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, 2 из них - в изданиях, входящих в рекомендованный ВАК список.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, экспериментальной части с обсуждением результатов, заключения, выводов и списка литературы (297 источников). Работа изложена на 201 странице, содержит 16 рисунков и 37 таблиц.
Распространение молочнокислых бактерий в эпифитной микрофлоре
По мнению Квасникова (Квасников, 1992), молочнокислые бактерии являются одной из широко распространенных в биосфере групп микроорганизмов.
Наличие молочнокислых бактерий на надземных частях растений установлено уже давно (Burri, 1903; Duggeli, 1904). Здесь содержание молочнокислых бактерии варьирует в широких пределах в зависимости от ряда факторов, в частности, от вида, места произрастания и фазы развития растения.
Молочнокислые бактерии, обитающие на растениях, играют определенную роль в формировании микрофлоры пищеварительного тракта животных. В верхней части пищеварительного тракта жвачных животных в значительном количестве встречаются виды, типичные для эпифитной микрофлоры растений. В нижней же части в большом количестве встречаются виды, более специфичные для животного организма.
Количественное содержание гетероферментативных молочнокислых бактерий в фекалиях животных варьируется в значительных пределах: от сотен до десятков тысяч в 1 г.
Помимо этого, значительное количество исследований было посвящено молочнокислым бактериям, обитающим в кишечнике и ротовой полости человека. В ротовой полости человека выявляются L. oris, L. fermentum и Streptococcus salivarius (Farrow et al., 1988). В желудке и верхних отделах тонких кишок при нормальной секреции обнаруживается весьма скудная микрофлора. В толстом кишечнике представлены в основном разновидности Str.faecalis.
Кроме того, в большом количестве молочнокислые бактерии в сообществе с протеолитическими бактериями или дрожжами содержатся в молоке и различных молочных продуктах (сметана, кефир, молоко, творог, сыр, масло и др.).
Впервые в 1954 году Квасниковым и Мисориной (Квасников и др., 1954) установлено, что естественной средой обитания молочнокислых бактерий является почва и ризосфера растений. В пресной и морской воде молочнокислые бактерии не содержатся, обитают они в основном в сточных водах (Weiss et al. 1981).
Необходимо отметить, что развитие хозяйственной деятельности человека приводит к увеличению содержания молочнокислых бактерий в биосфере. Это происходит в процессе биологического консервирования овощей, фруктов, рыбы, силосования и переработки различных растительных материалов.
Понятие ризосфера впервые было предложено Хилтнером в 1904 году и описывалось как контактная зона между почвой, корнями и микроорганизмами (Hiltner, 1904). Первоначально под ризосферой понимали пространство около корней бобовых растений, в пределах которого удается выявить стимулирующее действие корневых выделений на микроорганизмы. Сейчас область применения данного понятия намного шире и включает микробные местообитания вблизи корней различных растений (не только бобовых) в разных условиях. Толщина ризосферного слоя может составлять от нескольких миллиметров до нескольких сантиметров в зависимости от почвенных условий и типа растений. Взаимосвязь в системе растение-микроорганизмы-почва осуществляется за счёт выделения в области корней широкого спектра соединений (Rovira et al., 1979). Как сами корни, так и экссудаты, выделяемые молодыми тканями близ корневых чехликов, являются для микроорганизмов источником питательных веществ (Rovira, 1973; Oades, 1978; Bowen et al., 1991; Waisel et al., 1996; McCully, 1999). О том, что метаболиты корней успешно потребляются ризосферной микрофлорой, свидетельствуют данные о закреплении меченых атомов азота I5N и углерода 14С корневых выделений в микробной биомассе (Мергель и др., 1996; Domanskietal., 2001).
Экссудаты - водорастворимые соединения, выделяемые без привлечения метаболической энергии. К ним относятся сахара, аминокислоты, органические кислоты, гормоны и витамины (Rovira et al., 1983; Lynch, Whipps, 1990; Guckert et al., 1991). Другой органический материал является производным корней: партикулярный материал — отслоившиеся калиптроклетки (клетки поверхности точки роста корня) и клетки эпидермиса (Guckert et al., 1991); секреты, такие, как полимерные карбогидраты и ферменты, выделение которых зависит от метаболических процессов; лизаты, выделяемые при автолизе клеток, и слизи (Rovira et al., 1983; Lynch et al., 1990; Bowen et al., 1991; Waisel et al., 1996; Hawes et al., 1998; McCully, 1999). Слизеобразные выделения растения (mucilage), часто представленные галактозой, фукозой и уроновыми кислотами (Paul et al., 1975, 1976), способствуют образованию на корнях, корневых волосках и особенно чехликах внешнего слизистого слоя, именуемого муцигелем (mucigel), или слизегелем (толщина 1-10 мкм) (Кожевин, 1989; Andrews, Harris, 2000). Муцигель является веществом, сохраняющим влагу и питательным резервом (Andrews, Harris, 2000). Муцигель также может сорбировать некоторые ионы, в частности, ионы СГ, Р04 ", Са" , Fe , Fe (El-Shatnawi et al., 2001), которые являются необходимыми элементами питания как для растений, так и для микроорганизмов.
Спектр и количество корневых выделений существенным образом зависят от условий выращивания (освещённость, температура, концентрация С02, обеспеченность растения минеральными веществами, эдафический стресс и т.п.) (Кожевин, 1989; Мергель и др., 1996; Beauchamp et al., 1993; Yang et al., 2001), а также в значительной степени находятся под генетическим контролем растения (Hawes et al., 1992). Существенные различия в составе корневых выделений обнаруживаются не только у разных видов растений (Кравченко и др., 2004; Gukert et al., 1991; Perez et al., 1991; Beauchamp et al., 1993; Gieslinski et al., 1997; Gransee et al., 2000; Pieta et al., 2001), но и у разных сортов (Кравченко и др., 1993; Тихонович, 2000; Пузик, 2002; Beauchamp et al., 1993). Так, в корневых экссудатах пшеницы одних сортов содержится до 140 нг/раст. триптофана, активно трансформируемого некоторыми ризосферными бактериями в ИУК, тогда как у других его нет вообще (Тихонович, 2000).
Итак, у поверхности корня возникают специфические экохимические условия для почвенных микроорганизмов, качественно отличающиеся от условий в удаленной от корней почвы (Кравченко, 2000). В связи с этим, содержание бактерий в ризосфере растений превышает в десятки и сотни раз количество их в почве, удаленной от растений.
Роль грибов-продуцентов микотоксинов в порче влажного зерна при хранении
При силосовании зеленых кормов при хорошем уплотнении и изоляции анаэробные условия могут возникать уже через несколько часов. При хранении влажного зерна и особенно при его низкой влажности анаэробные условия создаются через 1-2 дня.
Отмеченные различия во влажности и скорости создания анаэробных условий обусловливают определенные различия в динамике микробиологических процессов. Однако эти процессы однотипны. Как при силосовании зеленых кормов, так и при хранении влажного зерна наблюдаются три основные фазы процессов брожения: смешанной микрофлоры, основного брожения и покоя.
Влажное зерно богато аминокислотами, витаминами, сахарами, поэтому является хорошей средой для роста микроорганизмов. При помещении в хранилище зерновая масса не сразу освобождается от воздуха, поэтому в начале фазы смешанной микрофлоры имеются условия для роста аэробных микроорганизмов. По данным Хессера с соавторами (Hesser et al., 1967), при хранении кукурузного зерна влажностью 25-30% численность аэробных микроорганизмов в первую неделю может достигать 108.
Особенно нежелательная микрофлора корма представлена плесневыми грибами. Обычно в фуражном зерне они растут более энергично, чем в силосах из зеленых кормов.
В фазе смешанной микрофлоры наблюдается активное размножение представителей группы кишечной микрофлоры и дрожжей. Их присутствие нежелательно при хранении фуражного зерна, так как они снижают его питательную ценность и качество. При процессах брожения, вызванных этими микроорганизмами, теряется 50% и более энергии сбраживаемых углеводов. Наличие этих микроорганизмов в зерне указывает на неправильный ход процессов брожения. Устранение представителей группы кишечной микрофлоры при хранении зерна достигается в основном путем быстрого снижения рН, то есть создания благоприятных условий для активного молочнокислого брожения. Дрожжи способны расти при гораздо более низком значении рН, чем обычно создается при хранении зерна. Их рост ограничивают анаэробные условия, то есть низкий окислительно-восстановительный потенциал (гН2). При молочнокислом брожении в силосах гН2 снижается до 5,0-6,0, что останавливает развитие дрожжей.
Рост маслянокислых и анаэробных аммонифицирующих бактерий при правильном хранении зерна ограничен. Вначале он подавляется присутствием кислорода, а позднее, когда создаются анаэробные условия, он ограничивается сильной кислотностью.
Фаза смешанной микрофлоры непродолжительна. После создания анаэробных условий во влажном зерне рост аэробных бактерий прекращается.
Вторая фаза - фаза основного брожения, где главную роль играют молочнокислые бактерии, продолжающие снижать окислительно-восстановительный потенциал зерна за счет образования большого количества органических кислот. Активный рост этих бактерий начинается уже в первые часы засыпки зерна в силосохранилище. Постепенное снижение окислительно-восстановительного потенциала ускоряет развитие этих микроорганизмов. Молочнокислые бактерии, вследствие образования ими органических кислот и специфических бактерицидных веществ, прекращают рост многих бактерий и грибов.
Вследствие активного их роста и подавления других микроорганизмов молочнокислые бактерии быстро становятся доминирующей микрофлорой. Преобладающие в начале кокковидные формы сменяются палочковидными бактериями, отличающимися большей кислотоустойчивостью. В фазу молочнокислого брожения наблюдается развитие как гомо-, так и гетероферментативных молочнокислых бактерий. При гомоферментативном молочнокислом брожении сахар практически полностью превращается в молочную кислоту. При сбраживании Сахаров, вызванном гетероферментативными молочнокислыми бактериями, около 50% Сахаров превращается в молочную кислоту, до 16% - в уксусную, 10-20% - в спирт и до 30% - в двуокись углерода.
Третья, конечная фаза обусловлена низким значением рН и низким окислительно-восстановительным потенциалом зерна. В этой фазе практически не происходит развития каких-либо микроорганизмов и изменений в физико-химическом составе и питательной ценности зерна.
При несоблюдении условий хранения в зерне может наблюдаться вторичное брожение. Такое брожение нежелательно, поскольку в этом случае активно размножаются клостридии и аммонифицирующие бактерии.
Клостридии чаще всего вызывают маслянокислое брожение и придают зерну крайне неприятный запах. Эти микроорганизмы могут использовать молочную кислоту, в результате чего повышается рН зерна и создаются условия для развития других нежелательных микроорганизмов, особенно аммонифицирующих бактерий.
Аммонифицирующие (гнилостные) бактерии {Bacillus, Pseudomonas, Proteus и другие) также могут использовать молочную кислоту. Кроме того, аммонифицирующие бактерии разлагают белки до аммиака. Иногда развитие этих микроорганизмов может привести к возникновению щелочной реакции во влажном зерне при хранении. Развитие плесневых грибов при вторичном брожении связано с проникновением воздуха в хранилище и нарушением анаэробности зерна.
Применение биопрепаратов на основе молочнокислых бактерий в растениеводстве и животноводстве
В современных условиях функционирования отечественного земледелия при резком сокращении внесения минеральных и органических удобрений использование в агротехнологиях дополнительных источников минерального питания растений получило в настоящее время особую актуальность. Это может быть достигнуто в результате применения биопрепаратов, изготовленных на основе активных штаммов микроорганизмов, продуцирующих необходимые для растения физиологически активные вещества, осуществляющих контроль развития патогенов. Поэтому интерес к использованию молочнокислых бактерий в растениеводстве неуклонно возрастает. Это происходит потому, что положительное влияние этих бактерий на растения многосторонне. Оно обуславливается как активным синтезом ауксинов, витаминов и антибиотиков, так и усилением поглощения фосфора из почвы.
Применение препаратов на основе молочнокислых бактерий позволяет получить положительный эффект в увеличении урожайности растений. Эти препараты оказывают на растения не только стимулирующий эффект, но и подавляют жизнедеятельность фитопатогенных грибов и бактерий, способствуют разложению пожнивных остатков в почве. Молочнокислые бактерии применяются как отдельно, так и совместно с органическими удобрениями в качестве добавок.
К числу коммерческих препаратов на основе молочнокислых бактерий относится препарат «Акрам», применяемый для активирования компостирования растительного материала и разложения стерни. Основа препарата - консорциум кислотообразующих (в том числе молочнокислых -Lactobacillus plantariim, L. acidophilus, Streptococcus thermophilus) почвенных бактериальных культур, отобранных методом аналитической селекции. Молочнокислые бактерии, используемые в его составе, подавляют развитие фитопатогенной микрофлоры (Verticilhim dahliae, Helminthosporium sativum, Fusarium sp. и др.), многократно ускоряют компостирование растительных отходов, образование гумуса, обогащают почву дополнительными питательными веществами. Препарат эффективен в применении после уборки зерновых, картофеля, зернобобовых, хлопчатника, льна для ускорения разложения корней, травяного покрова, при подготовке к вспашке новых, неокультуренных земель.
Подобные препараты: «Активатор почвенной микрофлоры» и «Активатор фотосинтеза» - разработаны в АО «Биофлора».
Биопрепарат «Активатор почвенной микрофлоры» создан на основе консорциума молочнокислых бактерий {Streptococcus thermophilus Str. bovis, L. salivarius var salicinicus, L. acidophilus). В качестве стабилизатора культуры молочнокислых бактерий в препарат входят сухие водоросли, такие как Spirulina, Chlorella, Fucus, а также натрий бензоат, кальций пропионат, мочевина и аскорбиновая кислота. Полученный препарат используют для предпосевной обработки почвы или в качестве подкормки растений в начальный период вегетации растений. Действие препарата основано на способности содержащихся в нем микроорганизмов синтезировать ростстимулирующие вещества, следствием чего является не только увеличение урожая сельскохозяйственных культур на 15,0 - 35,0%, но и повышение устойчивости растений к различным заболеваниям.
Аналогичным действием обладает биопрепарат «Активатор фотосинтеза», в состав которого входит консорциум молочнокислых бактерий Lactobacillus salivarius var salivarus, L. acidophilus, L. lactis.
Препарат «Биофит-1», созданный OOO «Зеленая долина», предназначен для защиты и стимуляции роста растений. В его состав, помимо азотфиксирующих и фотосинтезирующих, входят молочнокислые бактерии. Он эффективно борется с корневыми гнилями, мучнистой росой, септориозом, фузариозом, альтернариозом, пиренофорозом, ржавчиной зерновых культур, корневыми гнилями, бактериозами овощных культур, в частности аскохитозом, альтернариозом, антрактнозом огурцов, фитофторозом томатов и картофеля, мучнистой росой плодовых и ягодных культур.
В животноводстве молочнокислые бактерии, являясь продуцентами ряда витаминов, незаменимых аминокислот и антимикробных веществ, находят широкое применение в качестве основы пробиотических препаратов (Ивановский и др., 1992).
Изучение антимикробной активности штаммов молочнокислых бактерий в лабораторных экспериментах
Для анализа продуцирования штаммом L. buchneri 600 фитогормонов (производных ауксина) бактерии выращивали стационарно в пробирках при 28С в течение 4 и 7 суток на разбавленной в 20 раз жидкой среде LC, содержащей (г/л): триптона - 10,0; дрожжевого экстракта - 5; NaCl - 8; MgS04 х7НгО - 2,46; ЇМ TRIS - 1 мл с добавлением 5 г/л глюкозы и L-триптофана в количестве 10 и 100 мкг/мл.
Для выделения ауксинов культуральную жидкость центрифугировали, супернатант экстрагировали этилацетатом, подкисленным 1н НС1 до рН = 3,0. Полученный экстракт выпаривали досуха на вакуумном роторном испарителе и растворяли в 0,5 мл метанола с последующей фильтрацией через нейлоновый мембранный фильтр (диаметр пор 0,45 мкм). Анализ ауксинов в пробах проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на системе серии JASCO LC-900 HPLC (Jasco International CO., LTD). Для идентификации ауксинов использовали комбинированный анализ с использованием УФ-детектора UV-975 и флуоресцентного детектора FP-920. Ауксины разделяли на колонке с обращенной фазой Ci8 uBondapak СІ8 (Waters, USA) с размерами 300x3,9 мм, используя изократическое разделение в буфере ацетонитрил: вода: уксусная кислота - 18 : 82 : 0.1 (об/об/об) в течение 30 мин. Скорость подачи буфера составляла 1,0 мл/мин, температура колонки - 33С, длина волны УФ детектора - 220 нм, длины волн флуоресцентного детектора -280 нм возбуждающая (Ех) и 350 нм эмиссионная (Em).
Идентификацию ауксинов проводили сравнением времени удерживания (мин.) стандартных веществ и пиков, определяемых в экстрактах культуральных жидкостей штамма L. buchneri 600. Расчет концентраций проводился по результатам хроматографического анализа при использовании УФ-детектора для определения индолил-альдегида и при использовании флуоресцентного детектора для индолил-3 -молочной кислоты, индолил-3-карбоновой кислоты и индолил-3-уксусной кислоты.
Для выявления биологической активности штамма L. buchneri 600 была проведена серия вегетационных и микрополевых экспериментов (Журбицкий, 1968; Методические указания..., 1983). Подготовленные проростки томатов высевали в торфопитательные горшки (Брызгалов, 1982). Посадку калиброванной по размеру и состоянию рассады томатов, выращенной из семян, посев семян салата, свеклы, пшеницы и редиса производили в вегетационные сосуды, содержащие 3,8 кг грунта. Семена льна высевали в вегетационные сосуды, которые заполняли почвой, отобранной с опытного поля Псковского ВНИИСХМ, где предварительно выращивался лен бессменно в течение двух лет. В сосудах выращивали по 1 растению томата, 3 растения салата, 4 растения редиса и свеклы, 20 растений пшеницы, 100 растений льна, 8 растений сои (рис. 2А, Б, В).
Микрополевые опыты с тимофеевкой и ежой заложены на территории опытного поля ГНУ ВНИИСХМ (рис. ЗА). Опытные делянки имели площадь 2 м", повторность опыта четырехкратная. Норма высева - 1,4 г/м". Глубина заделки семян 3 см (Неринг и др., 1974; Растениеводство, 1975; Фирсов, 1989). Посев производили тракторной сеялкой СН-1.6. Применяли различные способы внесения штамма/,, buchneri 600.
Инокуляция семян. Трехсуточные проростки томатов, семена редиса, салата листового, свеклы столовой, льна обыкновенного, пшеницы перед посевом замачивали в течение 1-4 часов в культуральной жидкости штамма L. buchneri 600 из расчета по 10s клеток/семя. Во всех случаях, когда в опытных вариантах проводилось предпосевное замачивание семян в культуральной жидкости штаммов, в контрольных вариантах проводилось аналогичное замачивание семян в питательной среде эквивалентной концентрации без бактерий. Семена льна дополнительно замачивали в культуральных жидкостях штаммов Т 123, Т 133, Б 157, а также смесью валериановой и масляной кислот в концентрации 10"10 М/л. Семена сои инокулировали штаммом L. buchneri 600 из расчета по 105 клеток/семя во время посева без замачивания семян. Пролив почвы. В опытах с салатом и льном во время посева семян проводили пролив почвы культуральной жидкостью штамма L. buchneri 600 из расчета по 10 клеток/м", а в контрольных вариантах аналогичный пролив почвы питательной средой эквивалентной концентрации без бактерий. В опытах со льном дополнительно осуществляли пролив почвы смесью валериановой и масляной кислот в концентрации 10"10М/л.
Похожие диссертации на Гетероферментативные молочнокислые бактерии и перспективы их использования в растениеводстве и кормопроизводстве
