Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы
1.1. Краткая характеристика бактерий рода Azospirillum 19
1.2. Свойства и функции бактериальныхлектинов
1.2.1. Современные представления о пектинах 24
1.2.2. Пили (фимбрии), лектины энтеробактерий 28
1.2.3. Фимбрии, агглютинины, лектины азотфиксирующих бактерий 45
1.3. Роль лектинов в проблемах специфичности и молекулярных механизмах взаимодействия азотфиксирующих бактерий с корнями растений 59
2. Материалы и методы исследования
2.1. Штаммы микроорганизмов и среды, используемые для их культивирования. 65
2.2. Методы исследования 66
2.2.1. Реакция гемагглютинации 66
2.2.2. Определение углеводной специфичности 67
2.2.3. Гель-фильтрация 67
2.2.4. Электрофорез в полиакриламидном геле 67
2.2.5. Изучение влияния протеаз и ионов двухвалентных металлов на активность лектинов 68
2.2.6. Анализ аминокислотного состава 68
2.2.7. Определение углеводного состава 68
2.2.8. Получение антител к лектинам
2.2.9. Установление локализации лектинов 70
2.2.10. Оценка адгезивных свойств бактериальных клеток на модели эритроцитов 71
2.2.11. Получение мутанта , brasilense Sp7 по лектиновой активности 72
2.2.12. Выделение полисахаридсодержащих соединений с поверхности азоспирилл 74
2.2.13. Количественная оценка образования бактериальных агрегатов 75
2.2.14. Выявление бактерицидной и фунгицидной активности лектинов 75
2.2.15. Получение фракций корней проростков пшеницы 76
2.2.16. Метод иммунодота 76
2.2.17. Изучение адгезии бактерий к корням растений 77
2.2.18. Получение гистологических препаратов корней проростков пшеницы и лука 78
2.2.19. Реакция бласттрансформации лимфоцитов 79
2.2.20. Определение противоопухолевого действия лектина 80
2.2.21. Цитологические и иммуноморфологические реакции иммунокомпетентных клеток мезентериальных лимфатических узлов 80
2.2.22. Исследование взаимодействий лектинов с компонентами плазмы крови и мембран эритроцитов 81
3. Результаты и обсуждение
3.1. Выделение, свойства и локализация лектинов азоспирилл 82
3.1.1. Скрининг бактерий рода азоспирилл на присутствие лектинов на поверхности клеток 82
3.1.2. Выделение и очистка лектинов 87
3.1.3. Характеристика лектинов азоспирилл 90
3.1.4. Определение локализации лектинов на поверхности клетки 104
3.2. Зависимость лектиновойактивности от условий выращивания бактерий 107
3.2.1. Оптимизация условий культивирования A. lipoferum 59b и A. brasilense Sp7, связанных с их лектиновой активностью 107
3.2.2. Воздействие неблагоприятных факторов на лектиновую активность A brasilense Sp7 и A. lipoferum 59b 131
3.2.3. Зависимость лектиновой активности азоспирилл от количества азотсодержащих веществ в среде культивирования 137
3.2.4. Связь адгезивных свойств бактерий с активностью лектинов на модели эритроцитов 148
3.3. Получение и характеристика мутанта A. Brasilense Sp7 по лектиновой активности 151
3.4. Значение лектинов азоспирилл в микробных ассоциациях 156
3.4.1.Изучение участия лектинов азоспирилл в агрегации бактерий 156
3.4.2. Определение возможной бактерицидной и фунгицидной активности лектина A brasilense Sp7 167
3.5. Роль лектинов азоспирилл в процессе взаимодействия с растениями 173
3.5.1. Роль лектинов в адгезии азоспирилл на корнях растений 173
3.5.2. Взаимодействие лектинов азоспирилл с компонентами корней пшеницы 178
3.5.3. Влияние лектинов азоспирилл на способность семян к прорастанию 185
3.6. Действие лектинов в отношении некоторых гидролитических ферментов 193
3.6.1. Влияние лектинов азоспирилл на активность гетерогенной Р-глюкозидазы 194
3.6.2. Изучение а, 3-глюкозидазной и {З-галактозидазной активностей на разных этапах выделения и очистки лектинов 200
3.7 Медико-биологические свойства лектинов 204
3.7.1. Митогенная активность лектина A. brasilense Sp7 204
3.7.2. Противоопухолевое действие лектина A brasilense Sp7 215
3.7.3. Влияние лектина A. brasilense Sp7 на кинетику клеточных популяций мезентериальных лимфатических узлов и динамику цитокинового статуса in vivo 218
3.7.4. Взаимодействие лектинов с компонентами плазмы крови и мембран эритроцитов 227
3.8. Некоторые биотехнологические а спекты получения бактериальных лектинов 244
Заключение 249
Выводы 260
Литература
- Пили (фимбрии), лектины энтеробактерий
- Изучение влияния протеаз и ионов двухвалентных металлов на активность лектинов
- Определение локализации лектинов на поверхности клетки
- Изучение а, 3-глюкозидазной и {З-галактозидазной активностей на разных этапах выделения и очистки лектинов
Пили (фимбрии), лектины энтеробактерий
В последние годы во всех ведущих странах мира появилось и успешно разрабатывается направление в изучении биологической азотфиксации, не предполагающей тесных связей между партнерами по типу бобово-ризобиального симбиоза и получившей название ассоциативной азотфиксации. По определению [1] ассоциативная азотфиксация рассматривается как азот-фиксация, осуществляемая несимбиотическими гетеротрофными бактериями при взаимодействии с высшими растениями. По мнению других авторов [2] предлагается рассматривать ассоциативную азотфиксацию как азотфиксацию, осуществляемую гетеротрофными бактериями на поверхности и в тканях высшего растения без образования морфологически выраженной структуры при взаимном прижизненном обмене продуктами Сі - и N2- фиксации. Повышенный интерес ученых к этой проблеме объясняется появлением возможности использования этого явления в практике сельского хозяйства [3-5].
Начало изучению ассоциативной азотфиксации положили работы Д. Дебе-рейнер [6-8]. Количество родов и видов бактерий, отнесенных к ассоциативным, постоянно увеличивается. К ним относятся Azospirillum, Herbaspirillum, Enterobacter, Acetobacter, Azotobacter и Pseudomonas, а также многие неиден-тифицированные ризосферные изоляты [9].
Особое положение среди ассоциативных азотфиксирующих бактерий занимают бактерии рода Azospirillum, которым в последние годы ученые уделяют пристальное внимание как микроорганизмам, потенциально способным активно влиять на рост и развитие сельскохозяйственных культур [10-14]. Результатам изучения влияния инокуляции чистыми культурами азоспирилл и их комбинациями с другими бактериями на урожайность злаковых растений - пшеницы, ячменя, сорго, кукурузы, проса, риса, кормовых трав, а также овощных культур посвящен ряд обзоров [15-18]. Исследователи [19-22] достаточно у бе 20 дительно подтвердили важность ассоциативной азотфиксации азоспирилл в обеспечении растений азотом. Содержание общего азота в злаковых культурах коррелирует с числом клеток Azospirillum, выделенных из корней [18], и с их азотфиксирующей активностью [20]. Однако отмечается, что положительное влияние инокуляции азоспириллами, по-видимому, связано не только с азот-фиксацией, но также с гормональной регуляцией [23, 24], улучшением минерального питания [25] и некоторыми другими факторами [26, 27]. По мнению [4] определенное значение в реакции растений на инокуляцию имеют генотипы бактериальных штаммов и сортовые особенности растений.
Несмотря на то, что впервые азоспириллы выделены из ризосферы тропических злаковых трав, на сегодняшний день они обнаружены в больших количествах практически по всему миру, включая зоны умеренного климата [28-31], разнообразные типы почв [32], в том числе и почвы с высоким содержанием солей [33], водные источники [34].
Согласно 9-му изданию определителя Берги, бактерии рода Azospirillum принадлежат к классу Eubacterial и семейству Spirillaceae [35]. Клетки бактерий имеют округлые, виброидные или палочковидные формы, часто с заостренными концами, грам-отрицательные или грам-вариабельные. Благодаря наличию полярного жгутика характеризуются штопорообразным движением в жидких средах. На твердых средах некоторые штаммы имели многочисленные боковые жгутики [36]. Известны азоспириллы, имеющие по пучку жгутиков на каждом полюсе [37]. Бактерии рода Azospirillum подробно описаны в ряде работ [36, 38, 39]. По данным литературы [39, 40] известны и описаны 5 видов бактерий рода Azospirillum . A. brasilense, A. lipoferum, A. amazonense, A. halopraeferens и A. irakense. Наиболее изучены первые два вида.
Значительное количество работ связано с исследованием пищевых потребностей азоспирилл, с подбором сред для выращивания бактерий. Для выделения азоспирилл из смеси культур или из почвы используют селективные среды с добавлением конго красного [41], аскорбиновой кислоты, глутатиона [42], а также стрептомицина, хлорамфеникола [43]. Подобраны и другие различные питательные среды для выращивания азоспирилл [8, 44-46].
Показано, что культивирование азоспирилл может осуществляться на средах с различными источниками углерода. Ими могут быть соли органических кислот (яблочной, молочной, янтарной, пировиноградной и др.), многие сахара [39, 47] и даже Сі -соединения (формиат, метан, метанол) [48]. Наиболее часто используемыми источниками углерода при выращивании азоспирилл являются малат натрия, лактат или сукцинат [49, 50], фруктоза [51].
Отмечены межвидовые различия между A. brasilense и A. lipoferum по способности метаболизировать глюкозу. Клетки штаммов A. brasilense не растут на среде с глюкозой, в отличие от A. lipoferum [47, 52, 53]. Хотя имеет место исключение для некоторых штаммов как A. brasilense, так и A. lipoferum [39, 54].
По данным [47], бактерии A. brasilense Sp7 и A. brasilense Cd не способны расти на средах с глюкозой, маннозой, сорбозой, маннитом, сахарозой и а-кетоглютаратом, но имеют высокую нитрогеназную активность на средах с глюконатом и фруктозой. Клетки A. lipoferum росли и фиксировали азот на всех выше названных субстратах.
Полисахариды [39, 55], полигалактуроновая кислота, пектин [55] также не используются бактериями A. brasilense в качестве источников углерода.
Источниками азота для азоспирилл являются соли аммония и нитраты [49, 56]. Проведенные нами ранее исследования по азотфиксирующей способности клеток Azospirillum, результаты которых не вошли в данную диссертационную работу, показали зависимость ацетилен-редукции от концентрации и форм азотистых соединений [57]. Присутствие в питательной среде органических добавок (дрожжевой экстракт в конц. 0,05-0,025 %) резко снижало интенсивность азотфиксации бактерий. В случае минеральных добавок (NaNCb) в тех же концентрациях происходило увеличение нитрогеназной активности. Содержание органических и минеральных добавок в среде культивирования ниже 0,01 % ингибировало азофиксацию, хотя степень ингибирования в присутствии органического азота была выше. Нитрогеназная активность отсутствовала у бактерий A. brasilense Sp7, прикрепленных к 4- и 7-суточным корням проростоков пшеницы. Как одну из возможных причин отсутствия азотфиксирующей способности клеток азоспирилл мы рассматриваем присутствие в корнях пшеницы значительных концентраций органического азота. Доказательством послужили эксперименты, проведенные с клетками азоспирилл, иммобилизованными на препарате клеточной стенки корней пшеницы, содержание общего азота в котором было значительно меньше, чем в корнях. Иммобилизованные на препарате клеточной стенки азоспириллы обладали нитрогеназной активностью, которая возрастала в процессе инкубации.
Изучение влияния протеаз и ионов двухвалентных металлов на активность лектинов
Бактериальные скрещивания проводили на плотной среде LB при 37С в течение 18 ч. В скрещиваниях использовали культуры донора и реципиента, выращенные на жидкой питательной среде в течение 18 ч в соотношении 1:2 или 1:3. Смесь смывали, делали разведения и высевали на агаризованную среду Д с канамицином.
Трансконъюганты отбирали двухэтапно. На первом этапе отбор мутантов, дефектных по агглютинирующей активности, проводили с помощью реакции ГА с самопроизвольным оседанием эритроцитов [263]. На втором этапе отбора мутантов использовали иммуноферментный метод. Для метода иммунодота на нитроцеллюлозе использовали антитела против иммуноглобулинов кролика, меченые пероксидазой (НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, Москва). В качестве субстрата для пероксидазы использовали 5-аминосалициловую кислоту. Антитела к лектинам азоспирилл были получены по методу [276].
Для анализа плазмидного состава бактериальных клеток использовали метод Экхардта [275]. Мобилизацию на перенос ставили с использованием штамма С600, содержащего плазмиду-помощник RP4-4. Соотношения донор: помощник: реципиент - 1:1:2. Реципиентом служил штамм Agrobacterium tumefaciens GMJ 9023. Трансконъюганты отбирали на плотной среде, содержащей канамицин, тетрациклин и рифампицин.
Выделение тотальной ДНК из штаммов Azospirillum проводили по методу, предложенному Н.М. Meade с соавт. [277], из 100 мл культуры, выращенной до поздней логарифмической фазы роста с аэрацией.
Гидролиз тотальной ДНК осуществляли ферментом рестрикции EcoR\. ДНК-ДНК-гибридизацию проводили следующим образом: рестрикцион-ные фрагменты переносили на мембранные фильтры типа ВА 0,45 мкм "Schleicher Schuell" (Германия). В качестве зонда использовали центральный Gill-фрагмент транспозона Tn5-Mob, меченый дигоксигенином. Блот 74 гибридизацию проводили согласно рекомендациям фирмы "Boehringer Mannheim".
Полисахаридсодержащие материалы с поверхности азоспирилл смывали 0,15 М раствором NaCl при механическом перемешивании в течение 72 часов. От низкомолекулярных примесей освобождались посредством дализа полученных растворов через диализную мембрану с пределом исключения 12-14 кДа. Далее смесь подвергали гель-фильтрации на колонке с Sepharose CI-4B. Условия проведения хроматографии осуществлялись в соответствии с работой [273]. Дополнительную очистку полисахарид-липидных комплексов (ПСЛК) от слабосвязанного белка проводили посредством обработки полученных препаратов катионообменником КУ-2 в КҐ - форме, а также с помощью ионообменной хроматографии на колонке с DEAEoyopearl 650М ("Toyo Soda", Япония). Липополисахариды (ЛПС) получали фенольной экстракцией бактериальных клеток. Очистку препаратов и получение гомологичных ЛПС проводили хро-матографическими методами. Полученные препараты полисахаридсодержащих комплексов лиофилизировали.
Для определения моносахаридного состава комплексов препараты гидро-лизовали 4н CF3COOH в запаянных ампулах при 105С в течение 4 часов. Гид-ролизаты упаривали с водой для удаления кислоты. Тонкослойную хроматографию проводили на пластинках с целлюлозой в восходящем варианте в системе растворителей: "пиридин-этилацетат-уксусная кислота-вода (5:5:1:3 по объему). Хроматограммы проявляли опрыскиванием раствором анизидин-фталата в бутаноле с последующим подогреванием до 115С. Аликвоты жидкой культуры, содержащие агрегаты, переносили в конические колбы и оставляли на 15 мин. Агрегаты осаждались на дне колб, а большинство свободных клеток оставались в суспендированном состоянии. Отбирали супернатант и измеряли его мутность на спектрофотометре СФ-26 при 420 нм. Оставшуюся культуру механически диспергировали обработкой в тканевом гомогенизаторе в течение 1 мин и измеряли общую оптическую плотность. Процент агрегации расчитывали по следующей формуле:
Бактерицидные свойства лектинов изучали, используя метод газонного посева [262], заключающийся в следующем: питательную среду в количестве 20 мл разливали в чашки Петри, затем подслаивали 2 мл 1%-ного голодного агара (Bacto), содержащего 0,2 мл соответствующей бактериальной взвеси (106 кл/мл). После застывания в агаре вырезали лунки или накладывали бумажные диски. В лунки или на диски наносили растворы лектинов различной концентрации от 1 до 0,05 мг/мл. Инкубировали в термостате при 37С. О наличии бактерицидных свойств судили по образованию стерильных зон вокруг дисков или лунок. При определении фунгицидных свойств в чашки Петри разливали по 20 мл питательной среды. После застывания агара в центр чашки засевали культуру грибов соответствующего штамма. Затем в лунки, сделанные в агаре, вносили по 20 мкл взвеси клеток или растворов лектина разной концентрации от 2 до 0,05 мкг/мл и инкубировали при 26С в течение 10 суток.
Фракцию экзокомпонентов и мембранную фракцию корней пшеницы получали из 4-х суточных корней проростков пшеницы Саратовская 29, выращенных в асептических условиях в чашках Петри на стерильной дистиллированной воде. Фракция экзокомпонентов представляла собой мягкий фосфатно-солевой (рН 7,2) смыв с проростков корней. Мембранную фракцию получали путем растирания проростков корней с помощью кварцевого песка, удаления водорастворимых белков промыванием дистиллированной водой и дальнейшей экстракцией 1%-ным раствором тритона Х-100 [279]. Тритон удаляли методом гель-центрифугирования [280]. Белок определяли по методу Бредфорда [281].
Один мкл взвеси клеток (в работе использовали серию двукратных разведений) наносили на мембрану, расчерченную на квадраты размером 5x5 мм, подсушивали и фиксировали в сушильном шкафу при 60С в течение 15 мин. Для предотвращения специфической сорбции метки как на образце, так и на поверхности носителя, мембрану инкубировали в растворе следующего состава: фосфатный буфер, рН 7,2; 0,2% BSA; 0,02% Твин-20 в течение 15 мин при комнатной температуре. Затем инкубировали в растворе иммуноглобулина (концентрация 10 у/мл) в течение 4 ч при комнатной температуре либо в течение 12 ч при 4С, затем отмывали фосфатным буфером (рН 7,2) с 0,02% Твин-20. Иммунодоты проявляли при помощи коллоидного золота, имеющего частицы диаметром 10-30 нм, конъюгированного с протеином А в течение 1-24 ч в зависимости от концентрации и активности метки [283].
Изучение адгезии A. lipoferum 59b на корнях растений проводили изотопным методом с использованием Б-(1-14С)-глюкозы на изолированных корнях 4-суточных проростков пшеницы сорта Саратовская 29, выращенных в асептических условиях. Для экспериментов использовали корни длиной 25-30 мм. Од-носуточную культуру бактериальных клеток азоспирилл, отмытую физиологическим раствором, помещали в 20 мл синтетической среды с D-(l- С)-глюкозой (5-7 мкКи/мл) и инкубировали при 37С 1-2 ч при встряхивании. Затем бактериальные клетки (106-10ш кл/мл), отмытые и ресуспендированные в 0Д4М NaCl инкубировали с корнями растений 1,5-2 часа при комнатной температуре (1 мл культуры клеток на 0,5 г корней) при встряхивании. После инкубации корни отмывали 0,14М NaCl, измельчали, подсушивали. По величине радиоактивности корней судили о количестве прикрепившихся к корням клеток. Счет радиоактивности вели в толуол-тритоновом сцинтилляторе жидкостным сцинтилляционным счетчиком Rack-Beta 1211 (LKB-Wallas). Истинную величину радиоактивности адсорбированных бактериальных клеток на корнях определяли, исходя из разности радиоактивности продуктов метаболизма после инкубации клеток.
Определение локализации лектинов на поверхности клетки
Из моно- и дисахаридов следует отметить специфичность к лактозе, фруктозе, рибозе. Наблюдаемая широта углеводной специфичности агглютининов азос-пирилл предположительно может быть обусловлена наличием нескольких лектинов, как поверхностных, так и внутриклеточных, обладающих способностью выделяться в окружающую среду.
Полученные результаты, кроме свидетельства наличия лектинов на поверхности клеток практически у всех взятых в эксперимент штаммов азоспи-рилл, показали отсутствие каких-либо закономерностей углеводной специфичности лектинов, связанных с видовой и штаммовои принадлежностью, а также источником выделения культур.
Для дальнейших исследований лектинов азоспирилл были выбраны два типовых штамма, относящихся к видам brasilense и lipoferum {A. brasilense Sp7 и A. lipoferum 59b), а также два диких штамма, принадлежащих к этим же видам - A. brasilense 75 и A. lipoferum 43 (таблица 5).
Было показано, что обработка клеток всех 4-х штаммов некоторыми про-теолитическими ферментами (проназой, папаином, трипсином, химотрипси-ном) приводила к ингибированию гемагглютинирующей активности бактерий при действии трипсина. Клетки A. lipoferum 59b теряли свою эритроагглюти-нирующую активность и под действием папаина (таблица 6).
Полученные данные свидетельствуют о белковой природе гемагглютини-нов азоспирилл, что не делает их исключением из ряда бактериальных лектинов, поскольку последние как правило, представляют собой протеины или гли-копротеины [121,153,290]. Выделение белков - лектинов осуществляли методом так называемой "стрижки", "бритья" клеток, описанным в работе Eshdat et al. [ 112]. Примечание : + ингибирование ГА — отсутствие ингибирующего эффекта максимум лектиновой активности клеток азоспирилл приходится на конец экспоненциальнойфазы роста. В связи с этим для выделения лектинов с поверхности азоспирилл использовались 18-ти часовые культуры бактерий, выращенные на жидкой синтетической питательной среде при 37С, при встряхивании.
Бактериальные клетки отделяли от культуральной жидкости центрифугированием при 3000 g в течение 30 мин. После осаждения клетки отмывали 0,9%-ным раствором NaCl. Затем клетки суспендировали в буферно-солевом растворе следующего состава (г/л): NaCl - 49,3; Na2HP04 2Н20 - 1,34; NaH2P04 2Н20 - 0,39; рН 7,4; из расчета 100 мл на 10 г биомассы Суспензию перемешивали на магнитной мешалке 30 мин. Биомассу отделяли центрифугированием (10000 g, 20 мин) и отбрасывали. К 100 мл полученного супернатанта добавляли 82 мл насыщенного раствора (NH4 )2SC 4 Выпавший хлопьевидный осадок отделяли центрифугированием и растворяли в 20 мл 0,9%-ного раствора NaCl. К раствору добавляли 40 мл 96%-ного этилового спирта или ацетона и оставляли на два часа при 4С. Образовавшийся осадок отделяли центрифугированием, растворяли в 15 мл дистиллированной воды, диализовали в течение 18 часов при 4С, лиофилизировали.
Последующие исследования предусматривали необходимость получения с применением метода гель-фильтрации чистых препаратов лектинов, отделения лектинов от балластных белков, которые в значительных количествах присутствуют в грубой белковой фракции клеточной поверхности азоспирилл.
Попытка отделить лектин от балластных белков с помощью хроматографии на Toyopearl HW-50F и HW-55F не увенчалась успехом. Не удалось подобрать условий элюции, которые позволили бы получить удовлетворительное разделение агглютининов и сопутствующих белков.
Более успешным оказалось разделение агглютининов и других белков азоспирилл на Sephadex G-75. Путем варьирования элюирующих буферных растворов с разными значениями рН и ионной силы удалось подобрать опти 90 мальные условия элюции белков. При этом для агглютининов A. brasilense Sp7 оптимальным оказался вариант, при котором с колонки вначале элюировались сопутствующие белки (0,1М СНзСООН), а затем при промывании колонки фосфатно-солевым буфером (PBS, рН7,2, с 0,85 М NaCl) выходила белковая фракция с гемагглютинирующей активностью (рис. 2). Агглютинин А. brasilense 75 выходил сразу после элюирования ОДМ СН3СООН (рис. 3). Подбор оптимальных условий очистки белков A. lipoferum выявил видовые особенности. Так, при хроматографировании поверхностных белков A. lipoferum 59b и 43 агглютинин связывался с носителем при промывании колонки PBS и снимался с колонки ОДМ СН3СООН (рис. 4, 5). Данная схема очистки позволила получить очищенные в 4 раза для A. brasilense и в 60 раз для A. lipoferum препараты агглютининов, о чем свидетельствовало соответствующее увеличение титра ГА. Гомогенность препаратов агглютининов оценивали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ).
Функционирование и проявление биологических эффектов лектинов определяется физико-химическими свойствами и структурными особенностями молекул этих белков. В частности, такими как молекулярная масса, субъединичное строение, наличие в составе молекулы углеводного компонента, углеводная специфичность, аминокислотный состав углеводсвязывающих сайтов, чувствительность к ионам двухвалентных металлов и ряд других свойств.
С помощью метода диск-электрофореза в 10 %-ном ПААГ с SDS определены молекулярные массы лектинов. Молекулярная масса лектина штамма А. brasilense Sp7 составила 36 кДа (рис. 6), штамма A lipoferum 59b - около 38 кДа (рис. 7). Молекулярная масса лектинов штаммов A. brasilense 75 и A. lipoferum 43 составила 43 кДа (рис.8).
Изучение а, 3-глюкозидазной и {З-галактозидазной активностей на разных этапах выделения и очистки лектинов
Вторая стадия адгезии происходит за счет экстрацеллюлярных полисахаридов. Этот вид адгезии осуществляется в течение более длительного времени -8-16 ч инкубации. Вполне возможно, данные, полученные в наших исследованиях, могут свидетельствовать о том, что именно лектины обеспечивают специфическое прикрепление азоспирилл на первой стадии адсорбции бактерий на корнях пшеницы.
Таким образом, результаты проведенных исследований показали, что лектины азоспирилл, ассоциированные с самой внешней мембраной, подобно фимбриям и пилям других бактерий, принимают участие в адгезии к корням пшеницы и, в конечном счете, в формировании азотфиксирующей ассоциации.
При изучении прикрепления A. brasilense Sp7 к корням проростков гороха, не родственного для азоспирилл растения, было показало, что бактерии прикрепляются к корням проростков, но в меньших на порядок количествах. Наблюдается разница и в количестве прикрепленных клеток родительского и мутантного штаммов: 3,64% и 1,67% соответственно.
На основании полученных данных мы не можем определенно говорить об адгезии с участием лектинов в связи с наличием хозяйской специфичности у азоспирилл, но тем не менее мы должны признать значительное преимущество корней проростков пшеницы перед корнями проростков гороха в избирательной эффективности адсорбции.
Большое значение имеет изучение молекулярных механизмов взаимодействия бактериальных и растительных клеток на ранних этапах образования ассоциаций, их специфичности.
Обнаружение лектинов на клеточной поверхности некоторых штаммов азоспирилл, участие лектинов в проявлении адгезивных свойств бактерий по 179 зволили предположить определенную роль бактериальных лектинов в процессах межклеточных взаимодействий.
С этой целью были проведены исследования по изучению возможности взаимодействия лектинов гомологичных (A. brasilense 75, A. lipoferum 43) и негомологичных (A. brasilense Sp7, A. lipoferum 59b) штаммов азоспирилл с экзо-компонентами и компонентами мембранной фракции корней проростком пшеницы Саратовская 29. Фракция экзокомпонентов представляла собой мягкий фосфатно-солевой смыв с проростков корней. Мембранную фракцию получали путем растирания проростков корней с помощью кварцевого песка, удаления водорастворимых белков и дальнейшей экстракцией 1%-ным раствором Triton Х-100 [279]. Связывание очищенных бактериальных лектинов с фракциями корней проростков пшеницы определяли методом золотого блота, используя для детекции иммунных комплексов на нитроцеллюлозе конъюгат протеина А с коллоидным золотом.
Результаты проведенных исследований показали, что лектины негомологичных штаммов азоспирилл связывают компоненты корней проростков пшеницы довольно слабо, особенно A. lipoferum 59b (рис. 45). В противоположность этому лектины гомологичных штаммов взаимодействуют с этими компонентами гораздо более интенсивно. Эти данные свидетельствуют о том, что в отмеченных рядом исследователей специфических взаимоотношениях злаковых растений с гомологичными штаммами азоспирилл, возможно, принимают участие и бактериальные лектины.
Однако нами замечены различия в характере связывания корневых фракций лектинами гомологичных штаммов азоспирилл. Так, лектин A. brasilense 75 проявлял более выраженную реакцию с экзокомпонентами корней, и реакция связывания ингибировалась при добавлении специфических Сахаров (рис. 46). Напротив, лектин A. lipoferum 43 связывался с мембранной фракцией, и это связывание частично ингибировалось углеводными гаптенами, в то же время
Серия двукратных разведений (слева направо) фракции экзокомпонентов (1а) и мембранной фракции (16) + лектин. Серия двукратных разведений (слева направо) фракции экзокомпонентов (2а) и мембранной фракции (26) + лектин, заблокированный L-арабинозой и L-рамнозой (100 тМ). взаимодействие этого лектина с экзокомпонентами корней проявлялось слабее и не ингибировалось соответствующими сахарами, что указывает на неспецифический характер связывания, отличающийся от углевод-белкового взаимодействия (рис. 47). Многими исследователями [21, 240] отмечена высокая степень специфичности, проявляемой популяциями бактерий, выделенных из поверхностно-стерилизованных корней, в отличие от популяций, присутствующих в ризоплане необработанных корней. Объяснение этому находят в проявлении штаммовой специфичности на уровне инвазивности, а не на уровне прикрепления, так как специфическая деформация корневых волосков под влиянием азоспирилл коррелирует со способностью штаммов проникать в корень. Кроме того, нами обнаружено ярко выраженное взаимодействие между лектином A. brasilense Sp7 и лектином корней пшеницы. Указанное взаимодействие ингибировалось N-ацетилглюкозамином, являющимся углеводным гаптеном лектина корней пшеницы. Вероятно, взаимодействие происходит за счет N-ацетилглюкозамина, присутствующего в углеводной части бактериального лектина (рис. 48).
Полученные в нашем исследовании данные свидетельствуют как о специфическом, так и о неспецифическом связывании с компонентами корней проростков пшеницы. Селективность в связывании тех или иных компонентов, возможно, отражает функциональные особенности лектинов разных штаммов. Так, преимущественное взаимодействие лектина A. lipoferum 43 с мембранной фракцией может указывать на определенную роль в проявлении бактериями способности проникать в корень, так как известно, что связывание лектинов с мембранами клеток вызывает изменение их свойств, в частности, проницаемости. Не исключена возможность того, что бактериальный лектин в подобном случае функционирует как эффектор гидролитических ферментов. Подобное свойство показано для некоторых растительных лектинов, активирующих гомологичные гидролазы [346].
