Введение к работе
Актуальность работы. Одним из наиболее активно развивающихся направлений современной биотехнологии является использование широкого круга ферментов в технологических процессах. Среди таких ферментов важную роль играют протеиназы. Они используются в медицине, косметологии, индустрии моющих средств, пищевой и кожевенной промышленности, а также для ферментативного синтеза пептидов. Однако, несмотря на большое разнообразие природных ферментов, их свойства часто не оптимальны для технологических процессов. Для решения этой проблемы могут быть использованы два основных подхода. Первый заключается в поиске новых природных ферментов с подходящими характеристиками, а второй - в направленной модификации уже известных и хорошо охарактеризованных белков. Второй подход кажется более привлекательным, поскольку позволяет конструировать ферменты оптимальные для данного биотехнологического процесса. Фундаментом для реализации этого подхода является изучение структурно-функциональной организации белков.
В лаборатории белковой инженерии Института молекулярной генетики РАН в
результате широкомасштабного скрининга микроорганизмов, добытых из необычных
природных и промышленных источников, был отобран штамм Serratia proteamaculans 94,
который способен с высокой эффективностью гидролизовать нативный коллаген при низких
положительных температурах. Ферменты, которые определяют такую способность данного
штамма, перспективны для использования в пищевой промышленности, так как могут
избирательно разрушать соединительную ткань в составе мясного сырья. С целью
клонирования генов протеолитических ферментов была создана геномная библиотека
Serratia proteamaculans 94, при анализе которой был охарактеризован ген новой
металлопротеиназы (протеализина), относящейся к семейству пептидаз
М4 - термолизинподобных протеиназ. Изучение структурно-функциональной организации протеализина представляет интерес как с прикладной, так и с фундаментальной точки зрения. С одной стороны, этот фермент перспективен для использования в мясоперерабатывающей промышленности для улучшения качества низкосортного мясного сырья. А с другой стороны, структурные особенности предшественника протеализина делают его удобной моделью для изучения механизмов действия пропептидов пептидаз семейства М4.
Работа поддержана грантами РФФИ № 03-04-48754-а «Структурные основы низкотемпературной активности ферментов. Новая психрофильная коллагеназа», №06-04-48678-а «Пропептиды как модуляторы функциональной активности белков» и № 06-04-08123-офи «Создание активного при пониженных температурах коллагенолитического ферментного препарата для мясной промышленности».
Цели исследования. Целями данной работы являются исследование структуры и свойств протеализина, а также оценка возможности применения рекомбинантного фермента в пищевой промышленности для улучшения качества мясного сырья.
Научная новизна. В ходе данной работы впервые очищен и охарактеризован протеализин - новая протеиназа Serratia proteamaculans. Проведен анализ первичной структуры протеализина и показано, что протеиназы, имеющие структуру, сходную с предшественником протеализина, образуют отдельную группу внутри семейства термолизинподобных протеиназ. Впервые детально изучен механизм созревания предшественника фермента, относящегося к этой группе. Получены кристаллы предшественника протеализина и впервые решена пространственная структура предшественника ТИП.
Практическая значимость. Данные, полученные в ходе работы, показали, что на основе протеализина может быть создан препарат для улучшения качества низкосортного мясного сырья. Эти результаты позволяют перейти к конструированию промышленных продуцентов протеализина.
Информация о структурно-функциональной организации предшественника протеализина может быть использована для создания на основе этого белка ферментов с направленно модифицированными свойствами.
Положения, выносимые на защиту
Анализ первичной структуры, очистка и изучение свойств рекомбинантного протеализина.
Оценка возможности использования рекомбинантного протеализина в пищевой промышленности для улучшения качества низкосортного мясного сырья.
Изучение механизма созревания предшественника протеализина.
Кристаллизация предшественника протеализина и установление его пространственной структуры.
Анализ пространственной структуры предшественника протеализина.
Апробация работы. По результатам работы опубликовано три статьи в научных рецензируемых журналах. Результаты работы были представлены на конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2004), на 9, 10 и 11 -ой международных Пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI» (Пущино, 2005, 2006 и 2007), на Международной школе - конференции молодых ученых «Биотехнология будущего» (Санкт-Петербург, 2006), на VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 2007), на Международной конференции «Протеолиз, механизмы его регуляции и роль в физиологии и патологии клетки» (Минск, 2007), на VI Национальной конференции по применению рентгеновского синхротронного излучения нейтронов и электронов для исследования материалов (Москва, 2007). А также на семинаре
лаборатории белковой инженерии Института молекулярной генетики РАН и на заседании кафедры биотехнологии Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, списка сокращений, обзора литературы, посвященного структурно-функциональной организации термолизинподобных протеиназ, материалов и методов исследования, обсуждения
