Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современное состояние проблемы, микроорганизмы как индикаторы антропогенных воздействий на экосистемы водоемов 8
1.1. Современная классификация источников водоснабжения по микробиологическим показателям 11
1.2. Влияние антропогенного фактора на качество питьевой воды.... 15
1.3. Изменчивость численности микроорганизмов и трофности озер при антропогенных нагрузках 19
1.4. Микробиологические исследования на Байкале 21
1.5. Принцип организации мониторинга за состоянием экосистемы озер 26
Глава 2. Штаммы- продуценты ферментов рестрикции для биотехнологии 28
2.1. Ферменты рестрикции, их номенклатура и классификация 29
2.2. Распространение рестриктаз 33
2.3. Характеристика субстратной специфичности рестриктаз 36
2.4. Ферментативные свойства рестриктаз 41
2.5. Ферменты рестрикции их поиск и применение 43
Глава 3. Объекты, методы и объем выполненных исследований 46
3.1. Объем и объем выполненных исследований 47
3.2. Микробиологические методы 50
3.3. Методы определения ферментов рестрикции 55
Глава 4. Влияние антропогенного фактора в районе Южного Байкала 60
4.1. Количественная характеристика микробных сообществ в воде Южного Байкала 61
4.2. Чувствительность бактериальных штаммов к антибиотикам.... 75
Глава 5 Выявление таксономической принадлежности и некоторых биохимических свойств микроорганизмов 86
Глава 6. Микроорганизмы воды и донных осадков оз. Байкал как потенциальные источники получения ферментов рестрикции 94
Глава 7. Обсуждение полученных результатов 106
Заключение, выводы 113
Литература 115
- Современная классификация источников водоснабжения по микробиологическим показателям
- Ферменты рестрикции, их номенклатура и классификация
- Объем и объем выполненных исследований
Введение к работе
Рациональное использование природных ресурсов, таких как экосистема оз. Байкал, а также разработка водо-охранных мероприятий невозможна без выявления роли микроорганизмов и их изменчивости в процессах превращения веществ и микрофлоры антропогенной природы, поступающих в озеро. Оценка антропогенного воздействия на качество воды на начальной, наиболее быстро релаксирующей части трофической цепи -микроорганизмах. Это перспективно и общественно значимо, поскольку позволяет оперативно выявить нарушения и принимать управленческие решения по регулированию интенсивности всех видов человеческой деятельности на экосистемы. Антропогенное вмешательство в экосистемы крупнейших поверхностных водоемов, таких как оз. Байкал, связано с возможностью необратимых последствий для ныне живущих и будущих поколений, что находится в противоречии с устойчивым экономическим развитием.
Многие исследователи всего мира давно пытаются найти способ выявления влияния человека на экосистемы, в частности, на водные объекты. В данной работе, мы попытались объединить традиционные методы микробиологических исследований с методами физико-химической биологии. При помощи внутриклеточных ферментов рестриктаз определить характеристику бактерий, которые являются продуцентом этого фермента.
Поиск штаммов новых продуцентов эндонуклеаз рестрикции (рестриктаз) обусловлен в первую очередь той ролью, которую эти ферменты сыграли и продолжают играть в молекулярно-генетических исследованиях вообще и генной инженерии в частности. Дальнейшее развитие этих ведущих направлений современной биологической науки и их прикладных значений, имеют самое непосредственное отношение к решению биотехнологических проблем. Во многом это зависит от доступности широкого ассортимента рестриктаз различной субстратной специфичности. Все это стимулировало
интенсивный поиск продуцентов новых специфических эндонуклеаз и организацию их промышленного выпуска.
Эндонуклеазы рестрикции II типа (рестриктазы), благодаря способности фрагментировать ДНК по строго определенным последовательностям нуклеотидов, нашли широкое применение в решении научных и прикладных задач (Smith Н. С. Nathans D., 1973; Murrey К., Hughes S., G., 1976; Акулин и др., 1988; Roberts R.J., 1990). Анализ специфичности рестриктаз предполагает существование неоткрытых прототипов этих ферментов (Янулайтис А.А., 1989). Водные микроорганизмы относительно плохо изучены как возможные продуценты рестриктаз, хотя среди них были выявлены ферменты с новой специфичностью (Дегтярев и др., 1987). Поиск эндонуклеаз рестрикции обусловлен тем, что выявленные новые штаммы бактерий, продуцирующие эти ферменты новые, редкие или более технологичны, чем известные. Таким образом, все вышеуказанное определило актуальность темы диссертационной работы.
Цель работы - поиск и идентификация новых наиболее перспективных штаммов, выделенных из различных экологических ниш озера Байкал, исследование влияния антропогенного фактора на распределение и биологические свойства бактерий, а также отбор наиболее технологичных штаммов-продуцентов. Основные задачи:
Выделение бактериальных штаммов из различных экологических ниш оз. Байкал и исследование их биологических свойств: ферментов эндонуклеаз рестрикции и антибиотикорезистентности.
Поиск культур микроорганизмов, продуцентов новых эндонуклеаз рестрикции как потенциальных источников получения промышленных ферментов.
Выявление таксономической принадлежности и некоторых биохимических свойств микроорганизмов
4. Разработка алгоритма степени устойчивости экосистемы по микробиологическим показателям, позволяющим выявить риск воздействия на экосистему оз. Байкал.
Теоретической значение и научная новизна работы. Впервые разработан и реализован новый эколого-биотехнологический подход к оценке антропогенного влияния на олиготрофные водоемы. Проверено 650 штаммов микроорганизмов, выделенных из различных районов оз. Байкал, в 10% которых обнаружена рестриктазная активность. Проведена идентификация по морфологическим и физиолого-биохимическим признакам. Создан алгоритм степени устойчивости экосистемы оз. Байкал по микробиологическим показателям. Установлено, что в районах антропогенного влияния появляются бактериальные штаммы, устойчивые к широкому спектру антибиотиков и выявляются штаммы бактерий, с новыми ферментами рестриктазами, которые используются в биотехнологических разработках.
Практическая значимость. В работе показана целесообразность использования ферментов эндонуклеаз рестрикции, выделенных в бактериальных штаммах хемоорганоторофных бактерий как индикаторов антропогенного воздействия. Рекомендовано использование разработанного алгоритма устойчивости озера Байкал Ангаро-Байкальским Бассейновым Водным Управлением при рассмотрении «Норм допустимых воздействий на экосистему оз. Байкал» (приложение). Результаты будут необходимы при мониторинговых исследованиях за качеством воды, а также всей экосистемы Байкала - участка мирового природного наследия - с целью сохранения уникального озера.
Создана коллекция из 650 бактериальных штаммов, включающих 5 штаммов-продуцентов новых эндонуклеаз рестрикции. Байкальские штаммы-продуценты уникальных и редких ферментов, используются в НПО «Вектор» и ООО «СибЭнзим» (г. Новосибирск) при получении сайт-специфических
эндонуклеаз рестрикции: Acal, Bsil, FanI, Sse9D, Cci N1. Штаммы микроорганизмов Acinetobacter calcoaceticus B-7 и Flavabacterium aquatil B-l зарегистрированы во всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов. Коллекционные штаммы микроорганизмов используются при изучении качества воды по бактериальным показателям.
Результаты исследований использованы при выполнении Гранта РФФИ-Байкал (№ 01-04-97209) и хоздоговорных работ с Администрацией Иркутской области (Влияние антропогенного фактора на качественный состав микроорганизмов и эколого-эпидемиологическую ситуацию в районе Южного Байкала, 2001-2003 гг.). Материалы диссертации использованы в учебных курсах Иркутского государственного технического университета по дисциплинам: "Биотехнология», "Техническая микробиология" и "Микробиология".
Апробация работы. Основные защищаемые положения диссертационной работы докладывались и обсуждались на международном семинаре "Гомеостатика живых, природных, технических и социальных систем" (Иркутск, 2001); на международном совещании проекта бурения Байкала и Хубсугула (Улан-Батор, 2001); на второй школе-семинаре молодых ученых России «Проблемы устойчивого развития региона» (Улан-Удэ, 2001); на Молодежной научной школе «Нефть и газ в современном мире: геолого-экономические и социально-культурные аспекты» (Иркутск, 2001); на научно- практической конференции «Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточно-Сибирском регионе» (Иркутск, 2002), на 2-ой международной научно- практической конференции «Энергосберегающие и природоохранные технологии» (Улан-Удэ, 2003); на третьей республиканской школе-конференции «Молодежь и пути России к устойчивому развитию» (Красноярск, 2003), На Всероссийской гидрогеохимической научной конференции «Проблемы поисковой и экологической геохимии Сибири» (Томск, 2003).
Современная классификация источников водоснабжения по микробиологическим показателям
Для характеристики воды различных водоемов пользуются многими критериями и классификациями, в которые включаются микробиологические, гидрохимические показатели (Галазий, 1982). Существующие классификации воды, как правило, разработаны к местным условиям (Драчев, 1964; Амбразене, 1973). Наиболее полно классификация качества поверхностных вод построена по экосистемному принципу (Жукинский и др., 1981). Это означает, что показатели состава и свойства воды, характеризующие в совокупности ее природные качества, рассматриваются в классификации как индикаторы структурно-функционального состояния водных экосистем, т.к. многие из них являются их составным или производными.
Эколого-санитарная классификация поверхностных вод суши отражает структурно-функциональное состояние водных экосистем. Численность бактериопланктона, гетеротрофных бактерий, бактерий группы кишечной палочки входят в набор обязательных показателей качества вод. Все градации показателей эколого-санитарных категорий, соответствующие определенным классам и разрядам качества вод, сохраняют свое значение в графах классификации вод по степени минерализации и ионному составу (табл. 1).
Подобный подход реализован при разработке системы санитарно-гигиенического контроля воды (Kaddu-Mulindwa, Filip, 1986). Вместе с тем, оценивая качество вод по различным микробиологическим тестам, нередко можно получить для одной и той же воды различные характеристики. Например, (Юрковская, 1979) при исследовании воды (на одной и той же станции отбора проб) получила разную степень ее загрязнения по общей численности бактерий и количеству сапрофитов.
Бактерии группы кишечной палочки (исключая фекальные кишечные палочки), по данным последних исследований, являются непрямыми индикаторами фекального загрязнения. Они являются не столько показателем неблагоприятной эпидемиологической ситуации, связанной с фекальным загрязнением, сколько свидетельствует о повышенном содержании органических веществ, поступающих в воду в результате антропогенного воздействия (Мамонтова, 2000).
По мнению О.В. Бухарина, Б.Я. Усвяцова (1996), количественные изменения в динамике соответствующих санитарно-показательных микроорганизмов изучаемой внешней среды нередко не отражают ее истинной потенциальной опасности для здоровья человека, так как не учитываются сдвиги в качественных характеристиках бактерий. В связи с этим предложено учитывать уровень антибиотикорезистентности и цитопатогенности естественной микрофлоры и их изменение под влиянием антропогенных факторов. Полученные результаты позволят оценить степень потенциальной опасности водной среды для здоровья человека.
В табл. 2 приведены стандарты питьевой воды, принятые некоторыми международными организациями и отдельными странами на 1985 год (World drinring. ..., 1985). Очевидно, что как отдельные требования, так и перечень нормируемых компонентов постоянно пересматриваются, уточняются и дополняются по мере развития аналитической техники и накопления знаний. Так, согласно данным работы (Water Quality, 1992), требования Европейского сообщества лимитированы концентрация никеля в воде (менее 0,05 мг/л), общее содержание пестицидов (менее 0,5 г/л), нефтепродуктов (менее 0,01 мг/л). В нашей стране дополнительно нормированы концентрации растворенного в воде кислорода (менее 4 мг/л) и кобальта (неболее 0,1 мг/л). Всемирная Организация Здравоохранения (ВОЗ) рекомендовала дополнительно ограничить содержание ДДТ (не более 1 мкг/л), пентахлорфенола (не более 10 мкг/л), коли-индекс (0-3/100 мл) и т. д.
Ферменты рестрикции, их номенклатура и классификация
Развитие молекулярной биологии за последние годы ознаменовалось рядом событий, имеющих кардинальное значение. В том числе, были открыты ферменты рестрикции, разрезающие ДНК на небольшое число специфических сайтов (частей). Таким образом, появилась единственная реальная возможность получения генов из природных источников и использование их для создания биологических моделей в генной инженерии.
Изучение энзиматических основ феномена микроорганизмов реализовались в открытии специфических эндодезоксирибонуклеаз, известных под названием рестриктаз.
Рестриктазы являются ферментами, использование которых впервые дало возможность специфически расщеплять ДНК на строго определенные фрагменты с размерами, доступными для препаративного выделения, анализа и соединения в рекомбинантные молекулы in vitro. Любая нативная ДНК может быть "измельчена" с помощью ферментов эндонуклеаз (рестриктаз). Биологическая роль их в клетках прокариот заключается в гидролизе чужеродной ДНК, проникающей в клетку извне. Собственная хромосомная ДНК при этом остается незатронутой рестриктазами, что обусловлено наличием ферментов, называемых модификационными метилазами, узнающими одинаковые с рестриктазами сайты.
Исключительная значимость рестриктаз как аналитических реагентов на долгое время определило развитие исследований в этой области в основном в сторону решения прикладных задач, которые реализовывались путем поиска новых продуцентов, очистки и характеристики субстратной специфичности открытых ферментов. В ходе этих экспериментов, вне зависимости от поставленных целей, были накоплены данные, касающиеся вопросов распространения рестриктаз и вариабильности характеристик проявления их специфичности.
Эти ферменты сыграли и продолжают играть в молекулярно-генетических исследованиях и генной инженерии. Дальнейшее развитие ведущих направлении современной биологической науки и их прикладных приложений, имеют самое непосредственное отношение к решению биотехнологических проблем, что во многом зависит от доступности широкого ассортимента рестриктаз различной субстратной специфичности. Все это стимулировало интенсивный поиск продуцентов новых специфических эндонуклеаз и организацию их промышленного выпуска.
Значительная часть исследований в области изучения рестриктаз посвящена экпериментам, имеющим более выраженное прикладное значение: поиск продуцентов, выделение и характеристика открытых ферментов. В качестве конечных продуктов биотехнологии производится значительное количество рестриктаз, например такими компаниями как Sigma (США), Pharmacia (Швеция), Serva (Германия) и др.
В настоящее время для многих рестриктаз определены узнаваемые последовательности. Эти ферменты способны узнавать специфические места (сайты) и расщеплять нуклеотидные последовательности в ДНК, индуцируя формирование тупых или липких концов.
Рестриктазы вначале подразделяли на 3 группы в зависимости от длины узнаваемой последовательности:
I-узнают тетрануклеотиды, например Alu I из Arthrobater luteus,
П-узнают пентануклеотиды, например Eco RI из Е. coli,
Ш-узнают гексануклеотиды, например Eco RII из Е. coli;
Alu I катализирует расщепление последовательности AG /" СТ с образованием тупых концов во фрагменте ДНК, EcoRII и EcoRI расщепляют последовательности t/ CC(A/T)GG и G AATTC соответственно с образованием липких концов во фрагментах ДНК
В настоящее время рестриктазы подразделяют на три класса с учетом RMS-системы, в которой RMS-белки рестрикции, метилирования (модификации) и посадки соответственно. К первому из них относят те рестриктазы, которые расщепляют ДНК в произвольных точках с образованием различных фрагментов ДНК (для обеих нитей ДНК известны системы R2M2S); ко второму классу (их известно около 500) относят ферменты, для которых сайты рестрикции и посадки совпадают - RS и MS. Образующиеся при этом фрагменты (рестрикты) воспроизводятся по длинне. Рестриктазы этого класса, объединяющие рестриктазы вышеуказанных трех групп, преимущественно используются на практике.
Рестриктазы III класса (например из фага Р1, системы 2R MS) объединяют все прочие рестрикционные эндонуклеазы. Отдельные из них, например, не узнают сайтов посадки. Их редко используют на практике.
По предложению X. О. Смита и Д. Натанса (Smith, Nathans, 1973) номенклатура рестриктаз строится по следующему принципу:
1. Название рода и вида микроорганизма обозначается тремя латинскими буквами-первой буквой названия рода и первыми двумя буквами названия вида, например, Escherichia coli - Eco, Bacillus amyloliquefaciens - Bam.
2. За родо-видовым обозначением следует обозначение штамма, например: ЕсоВ, ЕсоК. В том случае, если система рестрикции-модификации контролируется генами вируса или плазмиды, указывается символ нехромосомного элемента, например, EcoR. Если необходимо указать и штамм, и нехромосомный элемент , обозначение штамма приводится в скобках, например, Есо (В) Р.
Объем и объем выполненных исследований
Объектами исследования являлись бактериальные штаммы, выделенные из различных экологических ниш оз. Байкал: воды в прибрежной части (район п. Листвянка) и глубоководных проб и кернов донных осадков.
Пробы воды были отобраны с помощью батометра Нансена, предварительно обработанного 96-градусным спиртом. Этот прибор, при соблюдении правил инструкции, не только не уступает в отношении стерильности отбора проб воды (Крисе А.Е. и др., 1964) микробиологическим батометрам, но и превосходит их по надежности получения микробиологических проб воды с разной глубины при работе в глубоководных областях морей, океанов и озер. Поверхностные и прибрежные пробы воды отбирались в стерильные пробирки. Отбор проб проводился в районе п. Листвянка, расположенного в истоке р. Ангары (рис. 2).
Глубоководные пробы донных отложений на оз. Байкал по проекту "Байкал-бурение" были любезно предоставлены сотрудниками института Геохимии РАН. В лаборатории сделаны посевы на определение видового состава бактериобентоса. Некоторые штаммы бактерий определены на наличие в них ферментов рестриктаз.
Для выявления микроорганизмов, оз. Байкал-индикаторов антропогенного влияния и выявления перспективы их использования в биотехнологии, наблюдения и экспериментальные работы проводились в течение 2000-2003 гг. Объем выполненных работ представлен в таблице 5.
При исследовании проб воды, на санитарно-микробиологический анализ, использовали методики МУК 4.2.671-97, основанные на разработках СанПиН 2.1.4.559-96 «Питьевая вода», а также «Гигиена окружающей среды» (нормативно-методические документы, 1991).
Общее микробное загрязнение определяли количеством микроорганизмов в 1 мл воды, которые при посеве на мясопептонный агар и инкубации при 37±0,5 С в течение 24 ч. образуют колонии, видимые простым глазом или при увеличении в 2-5 раз. Посев производили в трех повторностях, объемом 1 мл. в стерильные чашки Петри и заливали 10-12 мл растопленного и остуженного до 45С мясопептонного агара. После застудневания агара чашки с посевами вверх дном помещают в термостат при 37 ±0.5С на сутки.
После указанного срока выращивания приступали к подсчету колоний, выросших как на поверхности, так и в глубине агара. Подсчет колоний производился с помощью лупы (х5). Результаты анализа выражали количеством бактерий на 1 мл исследуемой воды. За окончательное количество бактерий принимается среднее арифметическое результата подсчета на трех парал-лельных чашках.
При определении коли-титра в питьевой воде использовали метод мембранных фильтров. По окончании фильтрования фильтр захватывают обожженным пинцетом и накладывают на поверхность среды Эндо в чашки Петри. На одну чашку помещали 4-5 фильтров. Под каждым фильтром делали надпись с указанием даты, номера анализа и объема профильтрованной воды. Посевы инкубировали в термостате 18-24 ч. при 37 С. На второй день, по окончании сроков инкубации, производили просмотр посевов. Отсутствие микробного роста на фильтрах или обнаружение на них колоний, не характерных для бактерий кишечной группы (губчатые, пленчатые с неровной поверхностью и краем), позволяет на этом этапе анализа закончить исследования (18-24 ч.) с выдачей отрицательного результата на присутствие кишечных палочек в анализируемом объеме воды. При обнаружении на фильтре колоний, характерных для кишечных палочек (темно-красных с металлическим блеском или без него, розовых и прозрачных), исследование продолжали. Из нескольких колоний каждого типа готовили мазки, окрашивали их по Граму и микроскопировали. Отсутствие в мазках грамотрицательных, неспороносных палочек является основанием для прекращения анализа с регистрацией отрицательного результата. При обнаружении в мазке грамотрицательных палочек, морфологически сходных с кишечной (возможны удлиненные, нитевидные формы или крупные полярно окрашенные палочки), ставилась оксидазная проба.
При обнаружении на мембранных фильтрах однотипных лактозополо-жительных колоний (темно-красных с металлическим блеском или без него), не вырабатывающих оксидазы, анализ воды заканчивали на данном этапе подсчетом выросших колоний. При обнаружении на мембранных фильтрах розовых и бесцветных колоний с отрицательной оксидазной активностью, их подсчитывали и подтверждали принадлежность к бактериям группы кишечных палочек посевом 2-3 изолированных колоний каждого типа в полужидкую среду с глюкозой
