Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы. характеристика бактериальной целлюлозы: продуценты, биотехнология и практическое значение 9
1.1 Характеристика бактериальной целлюлозы 9
1.2 Продуценты бактериальной целлюлозы 14
1.3 Механизм синтеза бактериальной целлюлозы 21
1.4 Культивирование продуцентов бактериальной целлюлозы 31
1.5 Применение бактериальной целлюлозы 42
1.6 Целлюлоза и её производные как пищевые добавки 46
2 Объекты, схемы постановки экспериментов и методы исследований 50
2.1 Характеристика объектов исследования 50
2.2 Методы выделения продуцента бактериальной целлюлозы 52
2.3 Изучение морфологических, культуральных и биохимических свойств продуцента бактериальной целлюлозы 56
2.4 Идентификация штамма до вида с помощью анализа 16s рРНК 57
2.5 Оценка влияния рН на продуктивность бактериальной целлюлозы штамма при поверхностном культивировании 58
2.6 Подбор питательных сред для оценки продуктивности штамма Gluconacetobacler hansenii 58
2.7 Оптимизация условий биосинтеза бактериальной целлюлозы в стационарных и глубинных условиях культивирования штамма 59
2.8 Статистическая обработка полученных результатов 63
2.9 Оценка влияния растворенного кислорода на продуктивность бактериальной целлюлозы 2.10 Исследование наноструктуры бактериальной целлюлозы 65
2.11 Исследование химической структуры бактериальной целлюлозы
2.12 Исследование физико-химических свойства варенной колбасы, содержащей бактериальную целлюлозу 68
3 Выделение, идентификация и изучение продуцента бактериальной целлюлозы 70
3.1 Скрининг продуцента бактериальной целлюлозы 70
3.2 Изучение культурально-морфологических признаков и идентификация продуцента полимера 73
3.3 Культивирование штамма Gluconacetobacter hansenii GH-1/2008 77
3.4 Влияние растворенного кислорода и состава питательной среды на продуктивность бактериальной целлюлозы
4 Исследование наноструктуры, химического состава и физико-химических свойств пленок бактериальной целлюлозы 98
5 Оценка перспектив использования бактериальной целлюлозы
5.1 Разработка способов сушки и получения порошка бактериальной целлюлозы 108
5.2 Использование бактериальной целлюлозы в технологии мясных продуктов на примере вареных колбас 112
5.3 Исследование адсорбционных свойств пленок бактериальной целлюлозы 118
Заключение 121
Выводы 133
Список использованной литературы 135
- Механизм синтеза бактериальной целлюлозы
- Изучение морфологических, культуральных и биохимических свойств продуцента бактериальной целлюлозы
- Изучение культурально-морфологических признаков и идентификация продуцента полимера
- Использование бактериальной целлюлозы в технологии мясных продуктов на примере вареных колбас
Введение к работе
Актуальность темы.
В настоящее время внеклеточная бактериальная целлюлоза получила уже широкое применение в нескольких отраслях народного хозяйства в мировой практике: для создания биофильтров с различными размерами, для иммобилизации микроорганизмов и ферментов; в бумажной и упаковочной промышленностях. В текстильной промышленности бактериальную целлюлозу используют для создания новых тканей, в медицине для производства искусственной кожи; в высокотехничной промышленности для производства новых материалов, нанокомпозитов, в экологии для очистки сточных вод и т.д. (Bielecki et al., 2005; Klemm et al, 2005).
В пищевой промышленности в ряде стран бактериальная целлюлоза уже широко используется в виде порошка как общепринятая безопасная добавка (GRAS - Generally Regarded As Safe) - пищевой ингредиент. Порошкообразная бактериальная целлюлоза используется в замороженных молочных десертах; в изготовлении пудингов, в желе с фруктовой мякотью (Филлипс, 2006). Кроме того, в пищевой промышленности бактериальная целлюлоза используется для производства продуктов «Nata-de-Coco», конфет.
Не смотря на перспективность использования бактериальной целлюлозы в различных сферах народного хозяйства, в России до сих пор нет её производства вследствие отсутствия эффективных продуцентов и разработки биотехнологии на их основе.
Многие авторы рекомендуют для промышленного получения бактериальной целлюлозы штаммы вида Gluconacetobacter xylinus (Хрипунов, Ткаченко, 1999; Toyosaki и др., 1995; Chawla et al., 2009). Однако сведений по использованию штаммов других видов, как продуцентов бактериальной целлюлозы, в мировой литературе мало, а в России такие данные отсутствуют. Кроме этого, в литературе мало информации о виде Gluconacetobacter hansenii, штаммы которого синтезируют не только бактериальную целлюлозу, но и олигомер глюкуроновой кислоты. Такие штаммы будут играть очень важную роль в развитии биотехнологии бактериальной целлюлозы с целью её использования, в том числе и в нанотехнологиях.
Цель работы: выделение продуцента бактериальной целлюлозы Gluconacetobacter hansenii и исследование закономерностей его роста при культивировании; исследование свойств бактериальной целлюлозы и оценка возможности её использования.
В задачи исследований диссертационной работы входило: S выделение нового штамма Gluconacetobacter spp.,
S изучение его микро и макроморфологических, физиологических, культуральных свойств, проведение молекулярно-генетической идентификации;
S изучение продуктивности бактериальной целлюлозы у штамма Gluconacetobacter hansenii в поверхностных и глубинных условиях культивирования;
S разработка оптимальных условий для роста и биосинтеза полимера бактериальной целлюлозы штамма Gluconacetobacter hansenii GH-1/2008 в поверхностных и глубинных условиях культивирования; S изучение влияния концентрации растворенного кислорода и этанола на биосинтез бактериальной целлюлозы в условиях поверхностного культивирования продуцента Gluconacetobacter hansenii; S исследование наноструктуры, биохимического состава и физико-химических свойств пленок бактериальной целлюлозы, полученных при культивировании штамма в поверхностных условиях; S разработка способа получения порошка бактериальной целлюлозы. S оценка возможности использования бактериальной целлюлозы как пищевой
добавки в технологии вареных колбас; S исследование способности пленок бактериальной целлюлозы адсорбировать антимикробные соединения - антибиотики и нано серебро, и оценка антимикробных свойств.
Научная новизна работы.
Методом многоступенчатого скрининга выделен новый продуцент бактериальной целлюлозы GH-1/2008. На основании исследований микроморфологических, культуральных, физиологических свойств и молекулярно- генетического анализа установлена его принадлежность к виду Gluconacetobacter hansenii.
При исследовании твёрдотельных спектров методом ядерного магнитного
резонанса КП ВМУ С впервые показано, что полимер, синтезируемой продуцентом Gluconacetobacter hansenii, содержит в основном целлюлозу Ia и значительно меньше ip. В основной цепи молекулы мономер в полимере имеет в-1,4 связь. Нативный полимер содержит 97 % влаги, 2,85 % целлюлозы, белка, липидов и нуклеиновых кислот - 0,15 %.
Методом атомно-силовой микроскопии показано, что бактериальная целлюлоза, синтезируемая штаммом Gluconacetobacter hasenii, имеет сеть микробрилл с диаметром от 15-20 нм и макрофибрилл с диаметром 50 - 100 нм, и длиной от 1 - 9 цм, высокую степень кристалличности, которая обеспечивает влагоудерживающую способность, эластичность и прочность.
Показано, что при поверхностном культивировании в оптимальных условиях (рН и состав среды) продуктивность бактериальной целлюлозы штамма GH-1/2008 составляет 28,8 г/л, что превышает этот показатель у других штаммов Gluconacetobacter hansenii, синтезирующих целлюлозу.
Установлено, что количество растворенного кислорода в питательной среде от 1,5 до 3,0 мг/л является оптимальным для роста и инициации биосинтеза бактериальной целлюлозы штаммом G. hansenii GH-1/2008.
Практическая значимость работы.
Выделенный штамм Gluconacetobacter hansenii GH-1/2008 депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов с коллекционным номером ВКПМ В-10547 как продуцент для получения бактериальной целлюлозы в промышленных масштабах.
Подобрана оптимальная питательная среда для культивирования штамма Gluconacetobacter hansenii GH-1/2008 следующего состава,%: сахарозы - 7, густого кокосового молока - 0,1, дрожжевого экстракта - 0,5, Na2HPO4 - 0,27, K2HPO4 - 0,2, (NH4)2SO4 - 0,3, моногидрата лимонной кислоты - 0,115, спирта - 0,5, рН = 4,0.
Экспресс-метод оценки количества растворенного кислорода может быть использован для разработки состава питательной среды для биосинтеза бактериальной целлюлозы штаммами Gluconacetobacter hasenii.
Разработан способ получения порошка бактериальной целлюлозы с хорошими технологическими и функциональными свойствами. Наработаны партии препарата бактериальной целлюлозы и проведены испытания её в технологии продукта вареной колбасы, которые показали преимущество использования бактериальной целлюлозы в сравнении с растительной целлюлозой.
Доказано, что пленки бактериальной целлюлозы G. hansenii GH-1/2008 с абсорбированными антибиотиками и наносеребром обладают
антимикробными свойствами и могут быть рекомендованы для разработки покровных материалов для лечения раневых инфекций.
Апробация работы.
Основные положения работы и результаты исследований представлены на конкурсах и конференциях: 10-ой юбилейной Всероссийской выставке научно-технического творчества молодежи НТТМ (Москва, 2010); V фестивале науки (Москва, 2010); конкурсе молодых ученых VI Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011); Х Международной научно-практической конференции с международным участием «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2012); IX международной научно - практической конференции «Технологии и продукты здорового питания, Москва, 2012, II Международной научно-практической Интернет - конференции "Медицина в XXI веке: тенденции и перспективы". Казань, 2013.
Работа выполнялась при финансовой поддержке грантов: АВЦП «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2010 годы)», проектов № 4209 и № 9353; госконтракта П175 в рамках ФЦП «Научные и научно- педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг; гранта Президента РФ по поддержке ведущих научных школ; тема № 16.120.11.3245.- НШ «Разработка новых пищевых технологий с участием живых систем на основе нетрадиционных подходов к управлению их жизнедеятельностью и обеспечению качественных показателей готовой продукции».
Структура и объем работы
Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, списка литературы и приложений. Общий объем диссертации 162 страниц (основная часть - 150 стр.; приложения - 12 стр.). Диссертация включает 41 рисунков, 13 таблиц. Список цитируемой литературы содержит 154 источников, из них 16 на русском языке и 138 на иностранных языках.
Публикации
Механизм синтеза бактериальной целлюлозы
Представители вида G. hansenii — облигатные аэробы, грамотрицательные, палочковидной формы (0,6- 1,2 х 1- 3 мкм), клетки соединяются в парах, в цепочках или в небольших кластерах. Клетки подвижные или неподвижные с перитрихиальными жгутиками. Колонии бледные, пигменты не продуцируют. Основным переносчиком электрона является убихинон Q-10. В составе клеточных жирных кислот преобладает неразветвленныс насыщенные кислоты С]8:т7. Средние величины содержания G+Ц в ДНК составляют 58 - 63 мол.% [23].
Установлено, что Gluconacetobacter xylinus и Gluconacetobacter hansenii являются эффективными продуцентами целлюлозы и синтезируют внеклеточную целлюлозу в виде плотно упакованных волокон и постоянного молекулярного состава [24]. Другие продуценты родов Achromobacter, Aerobacter, Agrobacterium, Alcaligenes и Rhizobium синтезируют целлюлозу в виде фибрилл, бактерии родов Pseudomonas, Sarcina и Zoogloea в виде аморфных образований [11].
Большинство представителей родов семейства Acetobacteriaceae (кроме Asaid) окисляет одно- и многоатомные спирты. Этиловый спирт окисляют в уксусную кислоту. После полного окисления спирта бактерии рода Acetobacter, Gluconacetobacter и Acidomonas окисляют уксусную кислоту дальше до СОг и Н2О, вследствие чего, их называют «переокислителями».
Характерный убихинон у бактерий рода Acetobacter — тип Q-9, тогда как для G. hansenii - Q-10. По характеристике роды Gluconacetobacter и Acetobacter очень близки. В классификации этих родов существенных отличий нет.
Интенсивные исследования синтеза бактериальной целлюлозы, на основе A. xylinum (G. xylinus), как основного продуцента, были начаты S. Hestrin и др. в период с 1946 по 1963 гг. Группа исследователей под руководством S. Hestrin из Еврейского (Hebrew) университета опубликовала несколько работ, связанных с продуцентом бактериальной целлюлозы и его характеристикой [25]. В 1954 году S. Hestrin и М. Schramm сообщили о продуктивности микробной целлюлозы в богатой глюкозой питательной среде, при культивировании бактерии A. xylinum. Они доказали, что покоящиеся и лиофилизированные отдельные клетки Acetobacter синтезировали целлюлозу в присутствии глюкозы и кислорода [26]. Этими же учеными в 1954 году было установлено появление нецеллюлозобразующих (целлюлозо-негативных) мутантов у A. xylium.
Когда целлюлозобразующие штаммы выращивали в условиях интенсивного перемешивания (встряхиваемая культура), то спонтанно происходит возникновение целлюлозо-негативных (Cel-) мутантов, проявляющих более низкую продуктивность бактериальной целлюлозы.
В научной литературе существует несколько точек зрения о физиологической роли бактериальной целлюлозы для жизнедеятельности бактерий [41]. В естественных средах обитания большинство бактерий синтезирует внеклеточные полисахариды, которые формируют конверты вокруг клеток [27]. Бактерии синтезируют внеклеточные полимеры для того, чтобы поддерживать иммобилизованную клетки в аэробной среде. Клетки бактерий, синтезирующих целлюлозу, иммобилизуются в сети полимера, чтобы поддерживать всю популяцию в пространстве между воздухом и жидкостью [28]. Именно поэтому целлюлозосинтезирующие микроорганизмы часто могут заселять сточные воды [29].
Другой причиной может быть трофическая: создание матрицы полимера необходимо для иммобилизованных клеток как структуры, на которой адсорбируются частицы пищи. Таким образом, субстрат для питания становится более доступным бактериям, так как концентрация веществ в решетке полимера заметно увеличена из-за её адсорбционных свойств, по сравнению с окружающей водной средой [29, 27].
Некоторые авторы предполагают, что целлюлоза, синтезируемая А. xylinum, также играет роль запасного вещества и может быть использована голодающими микроорганизмами. В этом случае её разложение возможно катализировать экзо- и эндоглюканазами, присутствие которых было обнаружено в суспензии культуры нескольких целлюлозообразующих штаммов [30].
Еще одна физиологическая роль целлюлозы - предотвращение потенциального конкурента из-за вязкости и гидрофильньности слоя целлюлозы. В матрице полимера повышено сопротивление бактериальных клеток против неблагоприятных изменений (уменьшение в содержании воды, изменения в рН фактора, появление токсичных веществ, патогенных организмов, и т.д.): в этой среде клетки могут размножаться и развиться в матрице.
Важным фактором защиты является целлюлоза для бактерий и от ультрафиолетового излучения. Установлено, что целлюлоза, защищает бактериальные клетки от ультрафиолетового излучения из-за её светонепроницаемости, что показано было Н.М. Коо с соавторами на культуре Л. xylinum [31]. Исследования показали, что при ультрафиолетовом облучении уксуснокислых бактерий в течение 1 ч клетки, покрытые бактериальной целлюлозой, сохраняется жизнеспособными на 23 %, а без защитного полисахарида сохраняется жизнеспособными только 3 % клеток популяции [32].
Бактериальная целлюлоза является фактором, удерживающим влагу для бактерий. P. Ross с соавторами показали, что в культуре A. xylinum удержание влаги было более высоким на сухих природных субстратах, в сравнении с культурой без целлюлозы [32].
Таким образом, биосинтез целлюлозы для продуцентов целесообразен физиологически, и является важным эволюционным механизмом выживания продуцентов этого полимера.
В 2008 году генетически модифицированная цианобактерия новая, созданная учеными Малкольмом Брауном (Malcolm Brown) и Девидом Ноблесом (David Nobles) из Университета штата Техас, продуцирут целлюлозу, которую можно легко превратить в этанол и другие виды биотоплива. Как отмечают исследователи, при использовании таких штаммов микроорганизмов в больших масштабах, они смогут значительно удовлетворить потребность страны в топливе [33, 18]. Кроме того, гены штамма A.xylinum, детерминирующие биосинтез бактериальной целлюлозы, также можно встроить (рекомбинировать) в другие виды микроорганизмов, например в Е. coli, для получения нового биотоплива [34].
Изучение морфологических, культуральных и биохимических свойств продуцента бактериальной целлюлозы
Критерием оптимизации был выбран выход биомассы абсолютно сухой биомассы бактериальной целлюлозы. Определение влажности полимера производили сушкой в сухожаровом термостате при температуре 80 С до постоянной массы образца.
Оптимизация оптимальных условий для глубинного культивирования.
При проведении исследований по оптимизации условий культивирования продуцента бактериальной целлюлозы Gluconacetobacter hansenii GH-1/2008 были отобраны пять факторов оптимизации: источник углерода - сахароза, источник энергии - этанол, рН среды (использовали ацетат), число оборотов/мин при глубинном культивировании и кокосовое молоко, которое уже давно используют странах юго-восточной Азии как источник жирных кислот для уксуснокислых бактерий-продуцентов целлюлозы.
В качестве оптимизируемой использовали питательную среду Н5-2 состава (г/л): (NH4)2S04 - Зг, К2НР04 - 2г, дрожжевой экстракт - 5 г, Na2HP04 - 2,7 г, моногидрат лимонной кислоты - 1,15 г, вода - 1000 мл; В качестве первого фактора Х брали концентрацию кокосового молока: верхний уровень 0,2 %, нижний уровень - 0,1 %, шаг варьирования 0,05 %. В качестве второго фактора Х2 брали концентрацию этанола: верхний уровень - 1,0 %, нижний уровень - 0,5 %, шаг варьирования - 0,25 %. В качестве третьего фактора Хз брали рН среды, которую регулировали с использованием уксусной кислоты: верхний уровень 0,75 % (рН = 3.5), нижний уровень - 0,25 % (рН = 4.0), шаг варьирования 0,25 %. В качестве четвертого фактора Xt брали концентрацию сахарозы: верхний уровень 3 %, нижний уровень - 1 %, шаг варьирования 1 %. В качестве пятого фактора Х5 брали число перемешивания в минуту: верхний уровень 250 об/мин, нижний уровень - 100 об/мин, шаг варьирования - 75 об/мин. Питательные среды без добавления спирта и уксусной кислоты разливали в колбы 100 мл по 50 мл, затем стерилизовали в автоклаве при 115 С в течение 20 минут. Спирт и уксусную кислоту вносили согласно плану полного факторного эксперимента. В качестве инокулюма использовали 3 мл трехсуточной чистой культуры G. hansenii GH -1/2008. Культивирование проводили в колбе с магнитной мешалкой типа Sky line при температуре (25±1 С) в течение 7 суток. Режимы перемешивания составляли 100 и 200 оборотов в минуту, а в контрольных вариантах культуру перемешивали с числом 175 оборотов в минуту.
После 7 суток культивирования биомассу отделяли питательные среды фильтрованием бумажными фильтрами. Оценку результатов проводили по продуктивности бактериальной целлюлозы путем измерения биомассы весовым методом.
Критерием оптимизации был выбран выход биомассы абсолютно сухой биомассы бактериальной целлюлозы. Определение влажности полимера производили сушкой в сухожаровом термостате при температуре 80 С до постоянной массы образца.
Представление математической модели для оценки продуктивности в при поверхностном и глубинном культивировании штамма. Линейное уравнение регрессии для п факторов имеет вид: У = bo + biX, + b2X2 + b3X3 + b4X» + b5X5 + XbiXiXj Где, Хц - факторы, b0, bb b2, b3, bn - коэффициенты регрессии
Расчет полного факторного эксперимента типа 25 производили по следующему алгоритму: в матрицу планирования экспериментов включали параллельные опыты. Если априорные сведения предполагают невысокую воспроизводимость результатов, проводили расчет коэффициентов уравнения регрессии, построчные дисперсии, дисперсию воспроизводимости, которую проверяли по критерию Кохрена. Оценивали значимость коэффициентов рефессии двумя способами по критерию Стьюдента и доверительным интервалам коэффициентов рефессии.
Для оценки пригодности линейного уравнения рефессии в решении задачи поиска оптимума сравнивали две дисперсии: адекватности и ошибки опыта (дисперсии воспроизводимости). По критерию Фишера оценивали адекватность полученной линейной модели.
Параллельно, с использованием пакета профамм Statistica 8, был проведен компьютерный анализ и спроектированы поверхности отклика уравнений рефессии. Второй этап оптимизации. Метод Бокса-Уилсона. Следующим этапом оптимизации питательной среды был многофакторный эксперимент по методу Бокса-Уилсона. Построение плана эксперимента проводили на основе уравнения рефессии, полученного при проведении полного факторного эксперимента.
Аналогично выбору интервалов варьирования, нижнюю фаницу значимых факторов задавали нулевыми уровнями, а верхнюю - областью определения фактора. Незначимые факторы стабилизировали на нулевом уровне. По одному из наиболее значимых факторов (конценфация сахарозы) выбирали шаг движения, и, пропорционально произведениям коэффициентов рефессии на интервалы варьирования, рассчитывали шаги по другим факторам.
При проведении работы были получены фи-пять параллельных результатов эксперимента. Полученные данные обрабатывали статистически с использованием пакета профамм Statistica 6.0. Графики Сфоили с помощью профаммы JMP. 2.9 Оценка влияния растворенного кислорода на продуктивность бактериальной целлюлозы
Для оценки влияния растворенного кислорода на продуктивность бактериальной целлюлозы штамма G. hansenii GH-1/2008 использовали шесть питательных сред, в которых была различная начальная растворимость кислорода: HS, GY, Н5 без этанола, Н5 с 0.5% этанола и сахарозой, Н5 с 1% этанола и сахарозой 70 г/л и GY с глюкозой 100 г/л.
На рисунке 12 (а, б) показана система для измерения растворенного кислорода в питательной среде. Для каждой питательной среды 50 мл среды добавляли в колбу 70 мл с датчиком кислорода внутри. Колбу помещали в банку, плотно закрытую крышкой, в которую кислород из внешней среды не мог поступать (рисунок 12 а). Концентрацию растворенного кислорода в среде измеряли в течении 24 часов культивирования с помощью оксиметра (модель "Эксперт 001", Эконикс Эксперт, Россия), который был подключен к компьютеру для анализа данных (рисунок 12 б).
Для получения бактериальной целлюлозы после 24 часов культивирования культуру вносили в 50 мл питательной среды в колбу с соотношением 1:10, закрытую пробкой. Посевы в колбах культивировали при температуре 28 С и проводили измерение растворенного кислорода в течении 7 суток. После 7 суток культивирования, пленки бактериальной целлюлозы отфильтровали и отмывали клетки с помощью 0,5 н NaOH. Образцы полимера высушивали до постоянной массы при температуре 80 С и измеряли вес каждого сухого образца.
Изучение культурально-морфологических признаков и идентификация продуцента полимера
Многочисленными исследованиями установлено, что кислород является очень важным фактором для роста клеток и синтеза бактериальной целлюлозы штаммами различных продуцентов. Как известно, в культурах продуцентов бактериальной целлюлозы одновременно существуют две популяции клеток: целлюлозоположительные (Се11+) и целлюлозоотрицательные (Cell-). Согласно гипотезы R.E. Cannon (1989), J.W. Costeron (1999) и W.S. Wiliams (1989), бактерии синтезируют внеклеточные полимеры для того, чтобы поддержать клетки путем иммобилизации на них и контакта с аэробной окружающей средой. Однако в отсутствии полимера некоторый период времени клетки находятся в жидкой фазе, где начинается их рост и продукция полимера. Являясь облигатными аэробами, они нуждаются в кислороде, растворенном в среде. Поэтому концентрация растворенного кислорода в среде является одним из наиболее важных факторов, особенно с начальный период культивирования, когда клетки не контактируют с воздушной средой. Основываясь на этой информации, концентрация растворенного кислорода в питательной среде является очень также важным фактором, влияющим не только на рост клеток, но и на биосинтез целлюлозы.
Высокая концентрация растворенного кислорода может привести к появлению побочных продуктов метаболизма и возникновения мутантов, не образующих целлюлозу (Cell -). С другой стороны, целлюлосинтезирующие клетки (Cell +) G. hansenii создают матрицу целлюлозы, чтобы подняться на межфазное пространство, что способствует их тесному контакту с воздухом, когда концентрация растворенного кислорода в среде ограничена. В связи с этой гипотезой, процессом можно управлять, если создать микро-среду с минимальным количеством растворенного кислорода, тогда биосинтез бактериальной целлюлозы штаммом G. hansenii можно индуцировать. Кроме того, можно оценить способность к биосинтезу полимера при культивировании продуцента на различных питательных средах.
Для такой цели штамм G. hansenii GH-1/2008 культивировали в пробирках на шести питательных средах, в которых была различная начальная растворимость кислорода. Результаты исследований показали, что биосинтез пленок бактериальной целлюлозы инициируется уже через 24 часа на всех питательных средах, в которых начальное количество кислорода было более 2,5 мг/л. После 24 часов культивирования количество растворенного кислорода во всех питательных средах потребляется полностью.
При концентрации растворенного кислорода ниже критической для данной культуры, рост тормозится, т.е. кислород становится лимитирующим фактором. Это означает, что в системе с критической концентрацией растворенного кислорода, но с более подходящим для метаболизма источником углерода происходит индукция синтеза целлюлозы тогда, когда рост активно начинается в первые часы. Как показали наши исследования, пленка образуется быстрее (через 24 часа) на тех средах, в которых количество растворенного кислорода было более 2,5 мг/л и не снижалось менее 0,5 мг/л (среды Н5 без и с 0,4 % этанола, и среда GY). Следует отметить, что при культивировании штамма на этих средах в условиях перемешивания, где кислород не являлся лимитирующим фактором, рост штамма был активным, но биосинтез полимера отмечался только через 48 часов, тогда как при культивировании в условиях лимитирования кислорода биосинтез полимера активно начинался через 24 часа.
Основываясь на том, что потребность культуры микроорганизмов в кислороде зависит от ряда факторов: наличия в среде веществ, ингибирующих рост микроорганизмов, источника углерода и биологии микроорганизма [148, 149], соответственно, потребление кислорода штаммом будет различным. При концентрации растворенного кислорода ниже критической для данной культуры, рост и размножение клеток тормозятся, т.е. кислород становится лимитирующим фактором. Это означает, что в системе с ограниченной концентрацией растворенного кислорода, но с более подходящим для метаболизма источником углерода происходит индукция синтеза целлюлозы тогда, когда рост начинается в первые часы.
Как показали наши исследования, пленка образуется быстрее (через 24 часа) на тех средах, в которых источник углерода более доступен для продуцента, чем на средах с источником углерода, не подходящим для продуцента. В открытой системе при перемешивании, где кислород не является лимитирующим фактором, рост штамма на различных питательных средах был активным, но биосинтез полимера отмечен только через 48 часов и в меньших количествах.
Как показали результаты, важным фактором является также скорость процесса диффузии кислорода из воздуха. Из рисунка 23 видно что, самое высокое поглощение кислорода отмечено на среде Н5 с 0,5 % спирта, при этом биосинтез полимера на этой среде был максимальным на 7-е сут культивирования. В остальных питательных средах поглощение кислорода было незначительным, что, вероятно, оказало влияние на рост культуры и биосинтез бактериальной целлюлозы.
Интенсивное поглощение кислорода из внешней среды также было отмечено и на среде GY с сахарозой (№ 5) уже через 4 часа культивирования. На этой среде также отмечается высокий выход полимера на 7 сут культивирования. В среде GY с глюкозой (№ 6) начальное количество растворенного кислорода составляло 0,5 мг/л. В этой среде почти не было поглощения кислорода из воздуха уже через 4-5 часов культивирования после потребления штаммом начального кислорода, и на этой среде биосинтез полимера был минимальным.
С другой стороны, высокая концентрация растворенного кислорода в средах Н5 без этанола и HS (более 4 мг/л) приводила к резкому снижению его концентрации через 4 часа, а продуктивность бактериальной целлюлозы на этих средах была значительно ниже. Из этого можно предположить, что в начале культивирования идет интенсивный рост целлюлозонегативных клеток, которые потребляют и растворенный кислород, но, вследствие неспособности синтезировать матрицу полимера, клетки в дальнейшем гибнут.
Таким образом, количество растворенного кислорода для Gluconacetobacter hansenii GH-1/2008 является лимитирующим фактором, инициирующим биосинтез полимера, при этом критическое количество растворенного кислорода в среде должно составлять не менее 2,5 мг/л и не более 3,0 мг/л. Контроль концентрации растворенного кислорода в среде может быть использован для оценки продуктивности бактериальной целлюлозы штаммами на различных питательных средах.
Другим важным фактором, оказывающим влияние на биосинтез целлюлозы, является присутствие в среде этанола (среды Н5. варианты №2 и №3). Добавление этанола в среду является фактором, ингибирующим рост целлюлозонегативных клеток, которые не синтезируют целлюлозу, но потребляют субстрат. При этом в культуре в основном остаются только клетки целлюлозоположительные, которые начинают активный синтез полимера для иммобилизации клеток и дальнейшего потребления кислорода из воздуха. Использование этанола в среде также целесообразно для элиминации целлюлозоотрицательных клеток в культуре.
Использование бактериальной целлюлозы в технологии мясных продуктов на примере вареных колбас
В настоящее время бактериальная целлюлоза все больше привлекает внимание специалистов различных областей как уникальный природный материал. Благодаря сверх упорядоченной сетевой структуре с зонами кристалличности (высоко ориентированными участками), включающими отдельные аморфные (неориентированные) участки, бактериальная целлюлоза имеет большую механическую прочность. Диаметр фибрилл бактериальной целлюлозы составляет 72-175 нм (Bohn и др., 2000) или 70-130 нм (Jonas и Farah, 1998; Yamanaka и др., 2000). Поскольку бактериальная целлюлоза состоит из нано размерных волокон, и структура нановолокон определяет её свойства, поэтому её описывают как наноцеллюлозу (Klemm и др., 2006).
По своим свойствам бактериальная целлюлоза отличается от растительной, так как в своем составе не содержит лигнина, гемицеллюлзы, пектина и восков. Степень полимеризации бактериальной целлюлозы составляет 2000-6000, тогда как растительной - 13000-14000 остатков глюкозы. Бактериальная целлюлоза имеет высокую способность к абсорбции воды, химическую стабильность, высокую механическую прочность (когда полимер влажный), сохраняет превосходную форму. Кроме этого, бактериальная целлюлоза нетоксичная, является биоразлагаемым полимером, инертным для метаболизма человека (Bielecki, 2005).
Все эти положительные свойства бактериальной целлюлозы позволили получить уже широкое её применение в ряде отраслей народного хозяйства в мировой практике. Чаше всего бактериальная целлюлоза используется как альтернатива растительной целлюлозе, однако новые области применения её ещё не исчерпаны.
Согласно сведений о штаммах-продуцентах, бактериальную целлюлозу способно синтезировать небольшое число прокариот как внеклеточный полимер, выполняющий для них в основном функцию иммобилизации клеток в его матриксе. Это представители родов Acetobacter, Agrobacterium, Rhizobium, Sarcina, Pseudomonas, Achromobacter, Alcaligenes, Aerobacter, Azotobacter, Zooglea (Kunihiko Watanabe, 2004), Gluconacetobacter. kombuchae, G. intermedius, G. swingsii, G. rhaeticus, G. nataicola (Debasree Dutta, 2007), G. oboediens, G. europaeus, G. hansenii, G. entanii (Franco Dellaglio, 2005) и цианобактерии (Brown, 2008).
До настоящего времени наибольшее внимание для практического использования привлекает к себе вид A. xylinum, который в 1998 г. был реклассифицирован как вид Gluconacetobacter xylinus. Анализ результатов, полученных рядом авторов, показал, что вид G. hansenii, синтезирующий бактериальную целлюлозу, способен синтезировать еще и другой олигомер глюкуроновой кислоты, на что указали авторы Joong Коп Part и Taous Khan, (2006). Однако, сведения об использовании этого вида малочисленны. В России имеются немногочисленные исследования, посвященные получению бактериальной целлюлозы с использованием штаммов A. xylinum (Хрипунов, Ткаченко, 1999). Кроме того, в России до сих пор не налажено производство бактериальной целлюлозы, а в коллекциях отсутствуют штаммы-продуценты бля получения бактериальной целлюлозы в промышленных масштабах.
Это обстоятельство послужило основанием для предпринятого исследования, в задачи которого входило выделение и идентификация продуцента, оценка его продуктивности, проведение оптимизации условий для получения полимера, исследование биохимического состава и свойств бактериальной целлюлозы и разработка технологической схемы её получения в поверхностных и глубинных условиях культивирования.
В период с 2006 по 2008 гг. методом многоступенчатого скрининга из культуры «чайного кваса» был выделен штамм GH-1/2008, который синтезировал внеклеточный полимер на полужидких и жидких селективных для уксуснокислых бактерий питательных средах. Исследования микроморфологических и культуральных свойств показали высокое сходство штамма с представителями рода Gluconacetobacter. Для подтверждения видовой принадлежности штамм был исследован молекулярно-генетическими методами, показавшими его сходство с видом G. hansenii на 99 %. Таким образом, этот штамм был использован как объект для дальнейших исследований его в качестве продуцента бактериальной целлюлозы.
На наш взгляд, важным аспектом является исследование у штамма культуральных особенности в различных условиях культивирования. Оценка продуктивности штамма позволяет дать объективную оценку возможности их использования в биотехнологии как продуцента бактериальной целлюлозы. С этой целью была изучена продуктивность бактериальной целлюлозы при культивировании в условиях поверхностного культиврования штамма на рекомендованных авторами S. Hestrin и М. Schramm (1985) и разработанных нами 12 питательных средах.
Согласно полученным данным, было установлено, что штамм растет на различных источниках углерода, при этом продуктивность целлюлозы была наибольшей на разработанной нами среде Н5-2. Продуктивность биосинтеза полимера штамма GH-1/2008 сравнивали с таковой у типового штамма G. hansenii (ВКПМ В-11239), которая была ниже на всех средах в 2-5 раз.
Для дальнейших исследований для культивирования продуцента бактериальной целлюлозы целесообразно было использовать среду Н5-2.
Следующий этап исследований был посвящен оптимизации состава питательной среды и условий поверхностного и глубинного культивирования штамма. При оптимизации по показателю продуктивности бактериальной целлюлозы штамма в поверхностных условиях культивирования в качестве факторов варьирования использовали: концентрацию кокосового молока, концентрацию спирта, рН среды, концентрацию сахарозы и температуру. Для оптимизации показателя продуктивности штамма в глубинных условиях культивирования в качестве факторов варьирования использовали: концентрацию кокосового молока, концентрацию спирта, рН среды, концентрацию сахарозы и число оборотов в минуту.
В результате оптимизации показано, что в условиях поверхностного культивирования продуктивность биомассы полимера выше (13,5 г/л), чем в условиях глубинного (8,83 г/л, рисунок 5), в связи с чем, для получения максимальной массы полимера штамм целесообразно культивировать в поверхностных условиях. На следующем этапе оптимизации, проведенном по плану Уилсона-Бокса, продуктивность штамма G. hansenii GH-1/2008 на 7 сут в условиях поверхностного культивирования была увеличена до 28,78 г/л на среде, содержащей, %: сахароза - 7, кокосовое молоко - 0,1, дрожжевой экстракт - 0,5, Na2HP04 - 0,27, К2НР04 - 0,2, (NH4)2S04 - 0,3, моногидрат лимонной кислоты - 0,115, спирта - 0,5, рН = 4,0.
Учитывая, что продуцент бактериальной целлюлозы G. hansenii GH 1/2008 является облигатным аэробом, то концентрация растворенного кислорода в питательной среде является очень важным фактором, влияющим на биосинтез целлюлозы. Основываясь на концепции авторов R.E. Cannon (1989), J.W. Costeron (1999) и W.S. Wiliams (1989), что в культурах продуцентов бактериальной целлюлозы одновременно существуют две популяции клеток: целлюлозоположительные (Се11+) и целлюлозоотрицательные (Cell-), подбирали среды с различным начальным количеством растворенного кислорода, для того, чтобы индуцировать биосинтез полимера у целлюлозоположительных клеток и элиминировать целлюлозонегативные клетки на начальных этапах культивирования.
