Содержание к диссертации
Введение
1 Литературный обзор 10
1.1 Микробиологические методы получения хиральных вторичных спиртов
1.1.1 Кинетическое разделение 11
1.1.2 Восстановление 12
1.1.3 Стереоинверсия
1.2 Особенности трансформации липофильных соединений клетками микроорганизмов
1.3 Трансформации органических соединений в эмульсиях 30
1.4 Биоэмульгаторы и адгезия клеток. Трансформация в биоэмульсиях
1.4.1 Биоэмульгаторы 34
1.4.2 Синтез биоэмульгаторов микроорганизмами 35
1.4.3 Биоэмульсии. Трансформация органических соединений в биоэмульсиях
1.5 Полиненасыщенные жирные кислоты 40
1.5.1 Биосинтез и метаболизм ПНЖК в организме 41
1.5.2 Физиологическая роль 42
1.5.3 Природные источники ЭПК 44
1.5.4 Получение ЭПК с помощью грибов 1.5.4.1 Условия и способ культивирования 47
1.5.4.2 Влияние состава питательной среды 48
1.5.4.3 Влияние температуры культивирования грибов 50
1.5 А Л Трансформация растительных масел 51
1.5.4.5 Генетическая модификация продуцентов ПНЖК
2 Объекты, материалы и методы исследования 58
3 Результаты и обсуждение
3.1 Разработка биокаталитических систем и методов получения оптически активных (S)- и (11)-1-фенилэтанолов
3.1.1 Скрининг микроорганизмов 67
3.1.2 Исследование трансформации ацетофенона в буфере 70
3.1.3 Исследование восстановления ацетофенона в биоэмульсиях 78
3.1.4 Трансформация ацетофенона в буфере с помощью 88
пермеабилизованных клеток
3.1.5 Исследование трансформации ацетофенона с помощью гриба 91
Geotrichum sp. 85-1 в системах буфер -изопропанол
3.1.6 Исследование условий получения (S)-(-)-l-фенилэтанола с помощью 95 гриба Geotrichum sp. 85-1 в системе буфер - изопропанол (33%)
3.1.7 Исследование стереоинверсии рацемического 1 -фенилэтанола 98
3.1.8 Принципиальная технологическая схема получения 100
оптических изомеров (S)- и (R)-l-фенилэтанола
3.2 Разработка методов биоконверсии растительных масел в грибные 103
липиды, обогащенные ЭПК
3.2.1 Исследование трансформации льняного масла галорезистентным грибом Mortierella alpina ХН-1 на среде ОГ с 5% NaCl
3.2.2 Исследование влияния сульфата цинка на синтез ЭПК de novo у галорезистентного мутанта
3.2.3 Исследование трансформации льняного масла грибами, 109
выращенными на средах с сульфатом цинка
3.2.4 Исследование влияния хлористого натрия на синтез ЭПК de novo у галорезистентного мутанта
3.2.5 Исследование трансформации растительных масел, несодержащих или содержащих небольшие количества а-линоленовую кислоту
3.2.6 Анализ выхода липидов и ПНЖК при трансформации растительных масел
Выводы 122
Список использованных источников
- Особенности трансформации липофильных соединений клетками микроорганизмов
- Исследование восстановления ацетофенона в биоэмульсиях
- Исследование трансформации льняного масла галорезистентным грибом Mortierella alpina ХН-1 на среде ОГ с 5% NaCl
- Исследование влияния хлористого натрия на синтез ЭПК de novo у галорезистентного мутанта
Введение к работе
Актуальность работы. Процессы биотрансформации органических соединений, осуществляемые с помощью оксидоредуктаз микроорганизмов (карбонилредуктаз и десатураз), представляют значительный интерес для создания перспективных методов получения практически важных веществ, таких как эйкозапентаеновая кислота (ЭПК), (R)- и (S)-энантиомеры 1-фенилэтанола (1-ФЭ) и др.
ЭПК используется в качестве диетарных добавок при лечении и для профилактики различных хронических и воспалительных заболеваний, включая сердечно-сосудистые заболевания, ревматоидные артриты, астму, экзему, псориаз и рак.
(R)- и (S)-энантиомеры 1-фенилэтанола а также их производные являются синтонами лекарственных препаратов, обладающих антидиабетическим, антидепрессантным и антирабическим действием. Эти соединения используются также при получении жидких кристаллов и в синтезе оптически активных полимеров, применяемых для разделения рацемических смесей органических веществ.
Получение этих соединений химическими методами представляется мало эффективным.
В связи с этим создание высокоэффективных биокаталитических систем и разработка на их основе регио- и стереонаправленных методов получения ЭПК и оптически чистых энантиомеров 1-ФЭ, а также поиск методов их интенсификации являются актуальной задачей.
Диссертационная работа выполнена в соответствии с Федеральной целевой программой «Государственная поддержка интеграции высшего образования и фундаментальной науки в 2002-2006 гг.» (2004-2006 гг., госконтракт № 02.438.11.7003), планами научно-исследовательских работ Уфимского государственного нефтяного технического университета (2003-2006 гг.), ведомственной научной программой «Развитие научного потенциала высшей школы» (2006-2008 гг., № РНП.2.2.3.1.5668).
Цель работы. Разработка регио- и стереоселективных биокаталитических методов получения эйкозапентаеновой кислоты и оптически чистых энантиомеров
1-фенилэтанола из доступного сырья.
В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:
проведение скрининга микроорганизмов, способных осуществлять энантиоселективное восстановление ацетофенона (АФ) при высоких концентрациях субстрата;
разработка энантиоселективных биокатализаторов на основе клеток микроорганизмов для получения оптически чистых энантиомеров 1-фенилэтанола;
разработка методов получения (S)- и (R)-энантиомеров 1-фенилэтанола с помощью разработанных биокатализаторов;
разработка эффективного метода получения эйкозапентаеновой кислоты биотрансформацией доступных растительных масел.
Научная новизна. Создан новый биокатализатор на основе гриба
Geotrichum sp. 85-1 и найдены условия, в которых с его участием осуществляется энантиоселективное восстановление ацетофенона в S-энантиомер 1-фенилэтанола при высоких концентрациях субстрата.
Обнаружена реакция изомеризации (S)-изомера рацемической смеси
1-фенилэтанола в (R)-изомер при инкубировании биомассами культур микроорганизмов Geotrichum sp. 85-1, Candida sp. 81-12, Metschnikowia sp. 84-13 и Candida sake 777.
Показана способность гриба Mortierella alpina 18-1 или его галорезистентного мутанта ХН1 трансформировать соевое, подсолнечное и оливковое масла в липиды, обогащенные эйкозапентаеновой кислотой.
Практическая значимость. Разработаны методы получения эйкозапентаеновой кислоты с помощью гриба Mortierella alpina 18-1 биотрансформацией растительных масел (льняного, соевого, подсолнечного и оливкового) с выходом 5,2 – 7,9 г/кг среды.
Созданы методы получения (S)-(-)-1-фенилэтанола энантиоселективным биовосстановлением ацетофенона с помощью культуры микроорганизма Geotrichum sp. 85-1 с выходом 83,6% и оптической чистотой не менее 99%ее, а также (R)-(+)-1-фенилэтанола изомеризацией S-энантиомера рацемической смеси с помощью культуры микроорганизма Candida sp. 81-12 с выходом 95% и оптической чистотой 95,8%ее.
Результаты научных исследований легли в основу создания новых лабораторных работ и используются в учебном процессе при подготовке инженеров по специальности 24.09.01 - Биотехнология в Уфимском государственном нефтяном техническом университете.
Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на IV, V Всероссийских научных INTERNET-конференциях «Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и биотехнологии» (Уфа,2005-2006), VI Всероссийском научном семинаре «Химия и медицина» (Уфа,2007).
Публикации: По материалам диссертации опубликовано 7 работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России, и тезисы 3 докладов.
Структура и объем работы: Диссертация включает введение, обзор литературы (1 глава), описание объектов и методов исследования (2 глава), обсуждение результатов (3 глава), выводы, список цитируемой литературы и приложения. Работа изложена на 143 страницах машинописного текста, содержит 34 рисунка, 19 таблиц.
Особенности трансформации липофильных соединений клетками микроорганизмов
Традиционно в качестве биокатализаторов процессов биовосстановления карбонилсодержащих соединений используется широко доступная биомасса пекарских дрожжей {Saccharomyces cerevisiae) [8].
Вместе с тем в последние годы были найдены новые микроорганизмы, способные проявлять более высокую энантиоселективность в процессах восстановления карбонилсодержащих соединений, а в ряде случаев и противоположную энантионаправленность, осуществляющие более полную конверсию субстрата с более высоким выходом целевого продукта по сравнению с пекарскими дрожжами.
С помощью грибов Geotrichum candidum восстановлением прохирального ацетофенона в атмосфере аргона получен оптически активный (8)-1-фенилэтанол с выходом 98 % и энантиомерным избытком 95 %ее [33].
Грибы Rhizopus oryzae и Aspergillus terrius энантиоселективно восстанавливают ряд фторпроизводных ацетофенона в соответствующие спирты (99% ее) [34].
Получен хиральный интермедиат (8)-1-(2 -бром-4 -фторфенил)этанол стереоселективным восстановлением 2-бром-4-фторацетофенона дрожжами родов Candida, Hansemila, Pichia, Rhodotorula, Saccharomyces, Sphingomonas и пекарскими дрожжами с выходом более 90% и энантиомерным избытком 99%
Энантиоселективным восстановлением ацетофенона и его аналогов (4-метилацетофенона и 4-хлорацетофенона) клетками гриба Trichothecium sp получены соответствующие (Я)-спирты с высокими энантиомерными избытками (90-98%) [36]. Восстановление клетками гриба Rhizopus arrhizus широко ряда 1-алкилфенилкетонов и 4-алкилацетофенонов протекает в соответствии с правилом Прелога с образованием (З)-карбинолов с высокой оптической чистотой 92-99 %ее и удовлетворительными выходами 15-68 % [37].
Более редко встречаются сообщения о энантиоселективном восстановлении карбонилсодержащих соединений бактериями.
Молочнокислые бактерии Lactobacillus fermentum энантиоселективно восстанавливают нециклические кетоны (2-пентанон, этилацетоацетат и ацетофенон) в соответствующие (З)-спирты с выходами более 90% и высокой оптической чистотой 99% ее [38].
Следует отметить, что несмотря на достигнутые успехи, использование цельно-клеточных катализаторов в процессах восстановления зачастую сопряжено с рядом проблем, и прежде всего, с проблемой стереоконтроля трансформации. Селективность клеточных катализаторов может существенно меняться под действием различных факторов, действующих как на стадии выращивания биомассы микроорганизмов, так и на стадии трансформации.
В основе такого явления лежит наличие в клетках нескольких ферментов, катализирующих окислительно-восстановительные реакции, с одним и тем же субстратом трансформации, но проявляющих разную стереоспецифичность. Уровень таких ферментов в клетках, а также их активность могут существенно меняться как в процессе роста культуры, так и в ходе трансформации [8]. Суммарная» активность R- и S-редуктаз, присутствующих в клетках, определяет селективность процесса восстановления клеточным биокатализатором.
Увеличение селективности цельно-клеточных биокатализаторов может быть достигнута исследованием физиологического состояния клетки путем подбора времени выращивания, рН, аэрации, концентраций субстрата и ко-субстрата для изменения уровня редуктаз.
Увеличение активности специфических редуктаз дрожжей может не только увеличить энантиомерныи выход, но также улучшить выход продукта и продуктивность [39]. Например, добавление серасодержащего L-цистеина увеличивает и энантиомерный выход, и скорость реакции восстановления; этилацетоацетата до соответствующего (38)-спирта. Механизм этого неясен; хотя авторы; предполагают, что соединение серы взаимодействует с активным центром одной из нескольких специфических редуктаз и изменяет конформацию реакционного центра [39].
Для повышениям энантиоселективности клеточных катализаторов процессов восстановления1 карбонилсодержащих соединений наряду с оптимизацией условий- выращивания биомассы и условий трансформации; разрабатываются дополнительные способы, избирательно снижающие активность «мешающих» ферментов;
Управление селективности процесса микробиологического восстановления; или даже: изменение его стереонаправленности может иметь место при использовании активаторов и ингибиторов специфических (R)- или (З)-редуктаз: метилвинилкетона, аллилового спирта, бромистого аллила, соединений серы (диметилсульфоксида, тиоацетамида), солей магния; или кальция; алифатических карбоновых кислот, аденина; этилхлорадетатаи: ряда других соединений [40,41].
В; ряде случаев, положительный эффект оказывает температурная инактивация нецелевых ферментов, используя различия в термической стабильности. Для пекарских дрожжей, катализирующих образование (8)-этил-3-оксибутирата, показана возможность увеличения энантиомерного избытка? продукта путем выдерживания; биомассы при 50 - 55 С в течение 30 минут.
Показана возможность использования осмотического и окислительного стресса, теплового шока; и диауксического сдвига для индуцирования специфических редуктаз Saccharomyces cerevisiae [42]
Существенное увеличение оптической чистоты целевого продукта, образующегося при восстановлении карбонилсодержащих соединений пекарскими дрожжами оказывают органические растворители [43 44].
Исследование восстановления ацетофенона в биоэмульсиях
Большое влияние на биосинтез ПНЖК в культурах Mortierella оказывают источники углерода и азота. Глюкоза - наиболее часто используемый углеродный источник для микробиологического производства АК [191]. Shinmen и др. [195] и Lindberg и др.[196] исследовали различные углеродные источники, используя виды М. alpina и М. alliacea соответственно, и обнаружили, что глюкоза является оптимальной для производства АК. В случае М. alliacea, крахмал также может быть источником углерода, потому что этот вид был выделен из ризосферы зерна риса. В работе [196] установили влияние концентрации глюкозы на биосинтез АК. Больше 20 % глюкозы в среде подавляли рост М. alpina.
В качестве источника азота для культуры Mortierella широко используется соевая мука. Исследование различных источников азота показало, что наиболее эффективными являются дрожжевой автолизат и соевая мука [197]. Отмечено [182], что использование дрожжевого автолизата предпочтительнее соевой муки. Однако если в основной среде использовались минеральные добавки, то добавление соевой муки было эффективнее, чем добавление дрожжевого автолизата. Park и др. [198] исследовали различные источники азота (дрожжевой автолизат, соевая мука, кукурузный экстракт, пептон, рыбная мука) и показали влияние на биосинтез АК и мицелиальную морфологию. Totani и др. [199] использовали отруби пшеницы и пептон в ростовой среде культуры М. alpina и получили высокий выход АК (11 г/л). Низкий выход биомассы был получен на средах с добавками нитрата аммония, нитрата натрия, ацетата аммония, или сульфата аммония в качестве источников азота [197], вследствие того, что грибы Mortierella плохо усваивают неорганический источник азота по сравнению с аминокислотами или белком. Koike и др. [200] установили влияние соотношения углерода к азоту (C/N) на биосинтез АК и мицелиальную морфологию в культуре М. alpina. Культивирование осуществлялось при различных отношениях C/N. Было показано, что для биосинтеза АК оптимальное соотношение C/N находиться в диапазоне 15 - 20 к 1. Интенсивное липидообразование происходит после завершения активного роста культуры в период стационарной фазы.
Для увеличения выхода АК необходима оптимизация элементного состава среды. Фосфор, калий, сера, кальций, натрий, железо, и магний главные неорганические элементы грибов. Эти минеральные добавки должны быть в достаточном количестве и важна их оптимальная концентрация. Различные исследования были направлены на увеличение производительности АК путем оптимизации количества минеральных добавок.
Totani и др. [199] исследовали потребность культуры М. alpina в минеральных добавках. Они определили, что фосфор, калий, железо и марганец необходимы для роста клетки, а железо и марганец играют важную роль в синтезе липидов. Таким образом, при добавлении только железа или только марганца возможен отрицательный эффект. Sajbidor и др. изучили влияние кальция, магния, марганца и железа на биосинтез АК в культуре Mortierella [199]. Они показали, что низкая концентрация марганца положительно сказывается на содержании АК, а высокая концентрация подавляет накопление липидов. Такой же эффект наблюдался при использовании железа. Kyle [201] показал, что добавление железа, цинка, и меди увеличивало выход АК в культуре М. alpina. Причиной этого является то, что ацетил-СоА-карбоксилаза, которая катализирует преобразование ацетила-СоА в малонил-СоА, необходимы ионы двухвалентных металлов в качестве кофактора. Добавленные минеральные соли могут действовать как кофакторы системы фермента, который катализирует начальный этап жирно-кислотного синтеза.
Низкие температуры стимулируют биосинтез высоко ненасыщенных ЖК, таких как ЛК, ГЛК, АК и ЭПК. Высокий выход суммы ПНЖК достигается при 12-15 С, и уменьшается при температуре инкубации выше 20 С. Низкая температура инкубации способствуют увеличению выхода ПНЖК, но замедляет скорость роста исследуемых микроорганизмов.
Грибы М. alpina 1S-4, продуцирующие АК, аккумулируют в их мицелии ЭПК только при низких температурах (12 С) при росте на обычной среде, содержащей глюкозу в качестве источника углерода. Предполагают, что при низких температурах происходит активация А -десатурации ПНЖК шб ряда, в основном АК, образованной из ЛК, в ЭПК (рисунок 1.4). Выход ЭПК составляет 0,3 г/л (27 мг/г асв) [202].
Исследование трансформации льняного масла галорезистентным грибом Mortierella alpina ХН-1 на среде ОГ с 5% NaCl
Однако, сравнение значений углов вращения полученных препаратов с литературными данными [30, 32] для оптически чистых (S)- и (К)-энантиомеров 1-ФЭ показало, что оптическая чистота продуктов трансформации АФ в используемых стандартных условиях не достаточно высокая. Согласно современным требованиям, предъявляемым к синтонам лекарственных препаратов оптическая чистота этих соединений должна быть выше 95% ее [8]. Следует отметить, что использование цельно-клеточных катализаторов в процессах восстановления зачастую сопряжено с рядом проблем, и, прежде всего, с проблемой стереоконтроля трансформации. Стереоселективность клеточных катализаторов может существенно меняться под действием различных факторов, действующих как на стадии выращивания биомассы микроорганизмов, так и на стадии трансформации [30,40,41,48].
В основе такого явления лежит наличие в клетках нескольких ферментов (дегидрогеназ, карбонилредуктаз), катализирующих окислительно-восстановительные реакции, с одним и тем же субстратом трансформации, но проявляющих разную стереоспецифичность [8,9]. Уровень таких ферментов в клетках, а также их активность могут существенно меняться как в процессе роста культуры, так и в ходе трансформации [8]. Суммарная активность R- и S-редуктаз, присутствующих в клетках, определяет в целом стереоселективность процесса восстановления клеточным биокатализатором. Кроме того, в последние годы было обнаружено, что в процессе трансформации карбонилсодержащих соединений, в том числе АФ может происходить стереоинверсия конечного продукта под действием ферментов, осуществляющих обратный процесс его окисления [30]. Окисление протекает особенно интенсивно в условиях аэрации реакционной смеси [76] и также может отличаться определенной стереоизбирательностью [9].
Исследование зависимости энантиоселективности трансформации АФ биомассой гриба Geotrichum sp. 85-1 от продолжительности реакции показало, что вначале реакции образуется преимущественно (8)-1-ФЭ, а затем увеличивается содержание (11)-энантиомера в реакционной среде (рисунок 3.3). Энантиомерный избыток синтезированного (К)-1-ФЭ достигает 69,5 % ее через 96 ч трансформации. аэробные условия. При исследовании процесса восстановления АФ дрожжами Candida sp. 81-12 и Metschnikowia sp. 84-13 было обнаружено, что оптическая чистота (8)-1-ФЭ при инкубировании биомассы с АФ в течение 48 ч существенно снижается (почти в 2 раза) по сравнению с продуктами, полученными через 24 ч трансформации (таблицы 3.3 и 3.4).
В случае Candida sake 111 также происходит изменение энантиомерного состава продукта в процессе трансформации АФ. При этом первоначально преимущественно образуется S-энантиомер 1-ФЭ (74,4 % ее) (таблица 3.3). Однако, через 48 ч трансформации в реакционной смеси преобладает R-энантиомер 1-ФЭ (21,1 % ее) (таблица 3.4).
Оптические свойства 1-ФЭ, полученного при трансформации АФ культурами микроорганизмов Candida sp. 81-12, Candida sake 111 и Metschnikowia sp. 84- Микроорганизм (конфигурация) Оптическая чистота, %ee Candida sp. 81-12 - 22,0 (S) 38,6 Metschnikowia sp. 84-13 - 19,2 (S) 33,7 Candida sake 111 + 12,4 (R) 21,1 Условия реакции: 0,1 M фосфатный буфер, рН 7,0; биомасса - 80 г (асв) / л; АФ - 5 г/л; аэробные условия, температура - 30 С, время реакции - 48 ч.
Возможным объяснением обогащения реакционной смеси (К)-энантиомером 1-ФЭ может служить стереоинверсия (8)-энантиомера 1-ФЭ, образующегося первоначально в качестве основного энантиомера при восстановлении АФ. В основе такой стереоинверсии может лежать низкая селективность фермента(ов), восстанавливающего АФ, и низкая активность или отсутствие фермента(ов), окисляющего )-1-ФЭ. о
В пользу стереоинверсии S-энантиомера 1-фенилэтанола свидетельствуют также результаты по влиянию кислорода.
Известно, что восстановление карбонилсодержащих соединений осуществляется с помощью ферментов, использующих в качестве восстановителя NADH или NADPH, содержание которых в клетке может снижаться в присутствии кислорода, например, вследствие окисления NADH при участии электронтранспортной цепи, использующей кислород в качестве акцептора электронов [30]. Это позволяет предположить, что восстановление АФ исследуемыми микроорганизмами будет проходить более интенсивно в анаэробных условиях, вследствие большей стабильности восстановленных форм коферментов в этих условиях.
Было установлено, что в отсутствии принудительной аэрации восстановление АФ действительно протекает более активно и с большей конверсией субстрата (не менее 95 %) (таблица 3.5). По-видимому, при лимитировании процесса по кислороду равновесие между окислительными и восстановительными процессами в клетках смещается в сторону образования восстановленных продуктов.
Исследование влияния хлористого натрия на синтез ЭПК de novo у галорезистентного мутанта
Отсутствие промежуточных интермедиатов на пути превращения линолевой кислоты в арахидоновую и эйкозапентаеновую кислоты указывает на лимитирование стадии окисления линолевой кислоты (рисунок 3.25). Это, вероятно, приводит к повышению концентрации линолевой кислоты в клетках - сигналу для включения пути соЗ, ведущего к ЭПК.
В силу широкой специфичности десатуразы грибов Mortierella alpina, окисляющей линолевую кислоту в а-линоленовую кислоту (А15/17-десатуразы, или юЗ-десатуразы), использующей в качестве субстрата и арахидоновую кислоту [220], можно ожидать, что последняя кислота также может окисляться в ЭПК.
Таким образом установлено, что с помощью исследуемых грибов можно получать ЭПК при трансформации не только масел, содержащих в высоких количествах не только а-линоленовую или линолевую кислоту, но также и олеиновую кислоту.
В результате трансформации исследуемых масел (10 г/кг среды) с помощью исследуемых грибов, выращенных на овсяной среде с глицерином (содержащей в случае ХН1 5% NaCl), можно получать от 15 до 22 г/кг среды грибных липидов (рисунок 3.26 а). При этом более высокий выход липидов может быть достигнут при трансформации растительных масел с помощью исходного гриба 18-1.
Суммарное содержание ценных ПНЖК в препаратах грибных масел достигает 48 - 88 % (рисунок 3.26 б). Доля этих соединений в липидах снижается при переходе от наиболее ненасыщенного льняного масла (степень ненасыщенности - 2,26) к наиболее насыщенному оливковому маслу (степень насыщения - 1,18). Вероятно, для конверсии более насыщенных масел в ПНЖК требуется затратить больше времени. Масло: ЛМ - льняное, СМ - соевое, ПМ - подсолнечное, ОМ - оливковое Рисунок 3.26 - Выход липидов (а) и содержание в них ПНЖК (б) при трансформации растительных масел с помощью исследуемых грибов Наиболее высокий выход ценных ПНЖК (17,3 г/кг среды) был получен при трансформации грибом MortiereUa alpina 18-1 льняного масла (рисунок 3.27 а).
Выход ПНЖК и обезжиренной биомассы при трансформации растительных масел (ЛМ - льняное, СМ - соевое, ПМ - подсолнечное, ОМ оливковое) с помощью исследуемых грибов
Данный гриб оказался более эффективным, чем его галорезистентный мутант, и при трансформации других растительных масел. Это, вероятно, связано с его способностью к более быстрому росту, о чем свидетельствуют данные по выходу обезжиренной биомассы грибов в исследованных процессах (рисунок 3.27 б).
Наибольший выход целевой эйкозапентаеновой кислоты был достигнут при трансформации соевого и подсолнечного масел грибом Mortierella alpina 18-1 (7,2 - 7,9 г/кг среды, соответственно), что превышает ее выход при трансформации льняного масла, изначально прогнозируемого как наиболее перспективного источника богатого предшественником ЭПК - а-линоленовой кислотой (рисунок 3.28 а).
Согласно литературным данным, одним из наилучших достижений в получении ЭПК является процесс трансформации льняного масла с помощью мутантного гриба Mortierella alpina, дефицитного по А12-десатуразе, накапливающего около 6,4 % ЭПК от веса биомассы [220]. При трансформации растительных масел на средах с сульфатом цинка с помощью исследуемых грибов удалось получить от 11,9 до 18,3 % ЭПК от веса сухой биомассы.
Следует отметить, что использование гриба Mortierella alpina 18-1 в процессах трансформации растительных масел менее эффективно для получения арахидоновой кислоты (рисунок 3.28 б), чем применение его в процессе биосинтеза из глицерина на среде ОГЦ, где удается получить до 15,3 г/кг этого соединения [206].
Вместе с тем, липиды обоих грибов, полученные на основе льняного масла, представляют собой практический интерес как продукты, содержащие не менее ценную дигомо-у-линоленовую кислоту. Выход дигомо-у-линоленовой кислоты, полученный с помощью исследуемых грибов, составляет 3,5 - 3,6 г/кг среды (рисунок 3.28 в).
Таким образом, показана возможность использования гриба Mortierella alpina 18-1 и его галорезистентного мутанта ХН1 для трансформации растительных масел (льняного, соевого, подсолнечного и оливкового), содержащих значительные количества а-линоленовой, линолевой и олеиновой кислотами, в грибные липиды, в ценные ПНЖК с выходом 7,9 -17,3 г/кг среды, в том числе в ЭПК с выходом 3,4 - 7,9 г/кг среды. Выявлена способность исследуемых грибов трансформировать льняное масло в дигомо-у-линоленовую кислоту с выходом 3,5-3,6 г/кг среды.
Полученные результаты могут быть использованы для разработки методов биоконверсии малоценных масел и жиров, а также отработанных жиров (в том числе в жиросодержащих стоках) в грибной жир, обогащенный ПНЖК, в том числе эикозапентаеновой, арахидоновой и дигомо-у-линоленовой кислотами.
