Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 7
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 11
1.1 Введение 11
1.2 Биологическая активность бетулиновой кислоты и ее 11
производных
-
Распространение, биосинтез и получение бетулиновой кислоты 19
-
Потенциал микроорганизмов как катализаторов процессов 26 получения бетулиновой кислоты из бетулина
1.5 Особенности трансформации органических соединений с 33
применением клеточных катализаторов
1.6 Направленная трансформация тритерпеноидных соединений 40
Заключение 50
2, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 52
-
Объекты исследований 52
-
Материалы и реагенты 52
-
Методы исследования 53
-
Культивирование микроорганизмов 53
-
Получение накопительных культур 54
-
Выделение чистых культур микроорганизмов 54
-
Идентификация микроорганизмов 55
-
Исследование окислительной способности микроорганизмов 55
-
Определение концентрации биомассы 55
2.3.7 Трансформация тритерпеноидов покоящимися клетками 56
микроорганизмов
2.3.8 Выделение продуктов трансформации 56
2.3.9 Трансформация бетулина покоящимися клетками 56
микроорганизмов в хлороформе
-
Трансформация бетулина покоящимися клетками 57 микроорганизмов в системе 0,05 М фосфатный буфер (рН—7,0) -хлороформ
-
Трансформация бетулина покоящимися клетками 58 микроорганизмов в системе 0,05 М фосфатный буфер (рН=5,5) -хлороформ в соотношении (97:3) с циклическими спиртами и циклогексаноном
-
Трансформация в анаэробных условиях 58
-
Гидролиз 3 - О - ацетилбетулина 59
-
Ацилирование бетулина 59
2.3.15 Получение бетулиновой кислоты тандемом 60
микроорганизмов
2.3.16 Трансформация бетулина покоящимися клетками 60
микроорганизмов в системе 0,05 М фосфатный буфер - ацетон
-
Трансформация бетулина в ростовых условиях 61
-
Идентификация субстрата и продуктов трансформации 61
2.3.19 Определение концентрации субстрата и продуктов 62
трансформации
3. РЕЗЕЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 63
3.1 Разработка метода скрининга микроорганизмов, 63 окисляющих бетулин в бетулиновую кислоту
3.1 Л Поиск штаммов - активных окислителей оксиметильных 63
групп в карбокисльные группы среди музейных микроорганизмов
3.1.2 Исследование влияния бетулина на окисление этанола 65
микроорганизмами
-
Исследование трансформации бетулина микроорганизмами 67
-
Исследование влияния ацетона на трансформацию бетулина 69 штаммом Т-12
3.1.5 Исследование влияния этанола и бетулина, вводимых в 72
ростовую среду, на окислительные свойства штамма Т-12
3.2 Скрининг микроорганизмов-трансформаторов бетулина в 74
бетулиновую кислоту среди почвенной микрофлоры
3.3 Исследование продуктов окисления бетулина 76
микроорганизмами
3.4 Исследование трансформации бетулоновой кислоты 82
микроорганизмами
-
Исследование микробиологической трансформации 84 бетулина в хлороформе
-
Исследование трансформации 3-О-ацетил бетулина 86 обводненной биомассой штаммов НС-231, НС-331 и Диз 12 в хлороформе
3.7 Разработка стадии ацилирования бетулина 88
3.S Синтез бетулиновой кислоты трансформацией бетулина с 94 помощью тандема биокатализаторов
3.9 Исследование трансформации бетулина региоселективными 96
штаммами в двухфазных системах: буфер (рН=7,0) - хлороформ
3.10 Исследование влияния рН буфера на трансформацию 98
бетулина в двухфазной системе с 50 %-ным содержанием хлороформа
3.11 Исследование трансформации бетулина штаммами НС-231, 100
НС-313, У3-26, Н-43 в кислых условиях
3.12 Поиск способов интенсификации трансформации 102
бетулина в бетулиновую кислоту штаммом НС-231
3.13 Поиск способов интенсификации синтеза бетулиновои 103
кислоты микробиологическим окислением бетулина
штаммом Н-43
3.14 Исследование трансформации бетулина в 108
бетулиновую кислоту штаммом 1-4-1 в ростовой среде
3.15 Исследование основных таксономических и патогенных 111
свойств перспективных микроорганизмов — окислителей
бетулина
3.16 Принципиальные технологические схемы получения 112
бетулиновои кислоты трансформацией бетулина с помощью
микроорганизмов
-
Принципиальная схема получения бетулиновои кислоты с 112 помощью Mycobacterium sp. 1-4-1
-
Принципиальная схема получения бетулиновои кислоты с 117 помощью Pseudomonas sp. Н-43
-
Принципиальная схема получения бетулиновои кислоты с 122 помощью тандема биокатализаторов
ВЫВОДЫ 130
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 132
ПРИЛОЖЕНИЯ
1. Экономическое обоснование себестоимости бетулиновой
кислоты (процесс региоселективного окисления бетулина
штаммом Pseudomonas sp. Н-43)
2. Протоколы проверки штаммов на патогенность
Введение к работе
Актуальность работы. Бетулиновая (Зр-гидрокси-20(29)-лупаен-28-овая) кислота, тритерпеноид лупановой природы, является перспективным противораковым средством, индуцирующим апоптоз (програмированную гибель клеток) в злокачественных меланомах, опухолях мозга и ряда других видов рака. Благодаря своей высокой специфичности в отношении раковых клеток, это соединение, в отличие от других противораковых препаратов, не оказывает токсического действия на здоровые клетки человека. На основе бетули-новой кислоты путем ее химической или микробиологической трансформации могут быть получены еще более эффективные противоопухолевые агенты, а также соединения, проявляющие высокую анти-ВИЧ активность в области наномолярных концентраций.
Бетулиновая кислота обнаружена во многих растениях, но низкое содержание делает нерентабельным ее производство выделением из растительного сырья. В то же время в коре белоствольных берез рода Betula, являющейся многотоннажным отходом лесохимических производств и деревообрабатывающих комбинатов, в больших количествах (до 35 %) содержится биосинтетический предшественник этого соединения - бетулин, Зр-гидрокси-20(29)-лупаен-28-ол. Это делает перспективным синтетический путь получения бетулиновой кислоты региоселективным окислением бету-лина. Однако эту задачу на сегодняшний день не удалось решить химическими методами из-за отсутствия региоселективных окислителей, способных избирательно окислять оксиметильную группу при С17, не затрагивая 3-гидрокигруппу бетулина.
Известные химические методы, основанные на нерегиоселективном окислении бетулина, требуют либо последующего энантио селективного восстановления 3-кетогруппы в зр-оксигруппу, что также является весьма сложной задачей, либо предусматривают предварительную защиту исходной Зр-оксигруппы бетулина ацетильной группой, которую также невозможно
8 осуществить региоселективно. Отсутствие региоселективности и, как следствие многостадийность процесса, а также использование дорогостоящих реагентов, токсичных для окружающей среды или запрещенных для производства медицинских препаратов, ограничивают использование таких методов в промышленном производстве бетулиновой кислоты.
Перспективным подходом в решении проблем регио- и энантиоселек-тивного синтеза органических соединений является использование методов биотрансформации с применением ферментов и клеток микроорганизмов, которые могут осуществляться в мягких, экологически безопасных условиях. Такие методы уже используются в промышленном производстве стероидов, также относящихся к классу тритерпеноидных соединений, однако для трансформации бетулина в бетулиновую кислоту они еще не применялись.
Вместе с тем, способность биокатализаторов осуществлять региоселек-тивное ацилирование и окисление различных диолов и полиолов, а также энантиоселективное восстановление карбонилсодержащих органических соединений хорошо известна. В связи с этим актуальным является поиск биокатализаторов и разработка на их основе методов получения бетулиновой кислоты из бетулина.
Цель исследования. Целью работы являлась разработка биокаталитических систем и методов получения бетулиновой кислоты биотрансформацией бетулина. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: осуществить скрининг микроорганизмов, способных трансформировать бетулин в бетулиновую кислоту; разработать методы получения бетулиновой кислоты с помощью найденных микроорганизмов; исследовать основные свойства перспективных штаммов с целью их предварительной идентификации; найти методы интенсификации перспективных процессов. Диссертационная работа выполнена в соответствии с Федеральной це левой программой «Государственная поддержка интеграции высшего образо-
9 вания и фундаментальной науки в 2002 - 2006 гг.» (2003 г.) и программой «Химия и химические технологии» Академии наук Республики Башкортостан (2001 - 2003 гг).
Научная новизна. Впервые выделены и идентифицированы микроорганизмы, способные окислять бетулин в бетулиновую кислоту (Pseudomonas sp. Н-43, Pseudomonas sp. НС-231, Mycobacterium sp. 1-4-1, Bacillus sp. Диз-12). Впервые предложены методы получения бетулиновой кислоты региоселктивным окислением из бетулина с помощью биокатализаторов на основе клеток микроорганизмов, в водной среде, органическом растворителе и двухфазных системах. Показано, что региоселективность окисления субстрата микроорганизмами и выход целевого продукта существенно зависят от природы растворителя и кислотности реакционной смеси, условий выращивания биомассы.
Впервые выявлена способность микроорганизмов гидролизовать 3-0-ацетилбетулин, ацетилировать бетулин и восстанавливать бетулоновую кислоту. Найдены штаммы Pseudomonas sp. НС-231 и Pseudomonas sp. НСВ-29, региоселективно ацетилирующие 3-гидроксигруппу бетулина. Впервые предложен однореакторный метод получения бетулиновой кислоты из бетулина с помощью тандема биокатализаторов.
Практическое значение. Разработаны методы скрининга микроорганизмов, способных трансформировать бетулин в бетулиновую кислоту, а также региоселективно ацетилировать бетулин. Создана коллекция культур микроорганизмов, транформирующих тритерпеноиды лупановой природы (бетулин, бетулиновую и бетулоновую кислоты). Осуществлен однореакторный трехста-дийный синтез бетулиновой кислоты из бетулина с помощью тандема биокатализаторов Pseudomonas sp. Н-43 и Bacillus sp. Диз-12, обеспечивающий выход целевого продукта на уровне 65 % за 50 ч. Разработаны одностадийные биокаталитические методы рсгиосслективного окисления бетулина, позволяющие получать в течение 6 часов бетулиновую кислоту с выходом 38 % и бетулиновый альдегид с выходом 56 % с помощью штамма Pseudomonas sp. Н-43 в покоящихся условиях или 45 - 50 % кислоты за 24 - 36 ч с помощью штамма Mycobacterium sp. 1-4-1 в ростовых условиях.
10 Результаты научных исследований легли в основу создания новых лабораторных работ и используются в учебном процессе подготовки специалистов по специальности «Биотехнология».
Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на I международном конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» Москва, 2002 г.; XXXIX и XLI Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2001, 2003); 53 и 54 Научно-технической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых УГНТУ (Уфа, 2002, 2003); I и II Всероссийской научной Internet-конференции «Интеграция науки и высшего образования в области био-и органической химии и механики многофазных систем» (Уфа, 2002, 2003); IV-om Всероссийском научном семинаре и молодежной научной школе «Химия и медицина» г. Уфа, 2003 г.
Публикации: По материалам диссертации опубликовано 13 работ. Структура и объем работы: Диссертация состоит из введения, обзора литератур, экспериментальной части, изложения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 201 ссылку. Работа изложена на 152 страницах машинописного текста, содержит 23 рисунка и 12 таблиц.
